CN101619342A - 一种检测水源水遗传毒性物质的简易方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测水源水遗传毒性物质的简易方法，包括以下步骤：将菌株TA1535接种到液体LB或者营养肉汤培养基里，振荡培养，用无菌水调整菌悬液浓度至OD₅₉₅为0.2－0.3，得菌悬液；取至少四个浓度梯度的水样样品浓缩物，分别加入到所述的菌悬液中，振荡培养，以DMSO为溶剂对照，以4－NQO为阳性对照；振荡培养后加入B－Buffer混匀，再加氯仿振荡混匀；加入ONPG溶液，温育显色30－50min；加入Na₂CO₃溶液终止显色，测定显色后溶液的OD₄₂₀和OD₅₅₀；算样品和溶剂对照的酶活性，并计算诱导率IR。本发明检测水源水中遗传毒性物质的简易方法，可以在保持试验操作常规化，测试结果精确、灵敏的前提下，省略很多步骤，节省大量时间。

Description

一种检测水源水遗传毒性物质的简易方法

技术领域

本发明涉及环境毒理技术领域，具体涉及一种检测水源水遗传毒性物质的简易方法。

背景技术

我国目前的饮用水质标准和卫生规范与国外的三大标准基本接轨，尤其是卫生部和建设部修订后的卫生规范和城市供水标准已经大量增加了有机污染物的毒理学指标。但是，我国目前饮用水标准的执行和实施没有相关的法律法规，在执行中比较困难。另外，由于生物遗传毒性，尤其是中长期的生物遗传毒性检测需要的技术难度较大，所需时间较长，费用也较高。因此，我国通常只对常规的感官、微生物和部分理化指标进行监测。上海、天津、哈尔滨等大城市已经报道的饮用水源监测范围大致如此。对于饮用水源中的复合污染物长期积累导致的污染和生物遗传毒性等检测则只有零星的研究，如蚕豆根尖微核试验、Ames试验和小鼠后代细胞彗星试验等。

有机污染物本身有一定的生物积累性、毒性和致癌、致畸、致突变的“三致”作用，一些有机物对人的生殖功能产生不可逆的影响，是人类的隐型杀手。自70年代Simmon发现自来水中存在致突变性有机污染物以来，在自来水及其水源水中先后发现多种遗传毒性物质。美国EPA水质调查发现供水系统中有机污染物2110种，饮用水中含765种。1994年以来，美国在饮用水中发现了100多种合成有机物，如多氯联苯、多环芳烃等，具有“三致”作用。

水源水和自来水中的有机物种类和数量相当大，污染问题相当突出。水源水中的污染物主要来自有机物，南京水源水中发现有机污染物，阳性水样中存在有多种美国EPA所列的129种优先污染物，以及其它黑名单上的有毒有害物质，水源水质已受到污染。

目前用于遗传毒性研究的方法已经超过200种，传统的毒理学分析方法大多局限于对单一物质的作用检测，在药物、有机污染物的毒性检测中常用。而对于饮用水源等环境样品的遗传毒性检测来说，有其特殊性：第一，水样中并非单一物质的污染，大多数是以混合物的形式出现；第二，混合物导致的毒性效应并非简单的单因素效应累加，各种物质和因素之间有可能存在协同或拮抗作用，依靠单个物质的分析方法并不能对环境样品的毒性做出正确的评价；第三，饮用水源中的致毒性物质是微量的。因此，必须根据我国的国情，探讨适合于饮用水的准确、快速、灵敏、实用的生物遗传毒性和环境激素类等有机污染物检测新技术，对饮用水的安全性做出及时地预警预报，使社会能够及时应对各种水污染的出现并加以有效的控制。

生物遗传毒性检测方法虽然很多，但真正经过验证、有合适灵敏度和特异度的大概不到10种。研究进展表明，对于常用的检测基因突变的Ames试验，各国学者都在研究敏感性和特异性更强、稳定性更高和操作更方便的方法。例如：常规的试验采用4个测试菌株，最近有人发现增加测试菌株TA1535(Salmonella typhimurium鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型菌株)更适合用于检测混合物的致突变性。为了克服S9(不加体外代谢活化系统)制备上的困难和不稳定性，Josephy等将沙门氏菌的芳香胺N-乙酰转移酶基因和人类细胞色素P-450基因CyplAZ引入细胞，构建了新的Ames测试株(Josephy PD，Gruz P，Nohmi T.Recent advances in theconstruction of bacterial genotoxicity.Muta Res，1997，(386)：1-223)。Quillardet则提出使用sfiA-lacZ融合基因的SOS显色检测法，弥补了Ames试验需要使用多种菌株的缺点(QullardetP，Hofnung M.The SOS Chromotest，a colorimetric bacterial assay for genotoxins：procedures.MutatRes，1985，147(3)：65-78)。在此基础上，Oda等人又建立了SOS/Umu测试法，使试验的样品量减少，无菌操作要求降低，更方便进行数量多的水样的检测(Oda Y，et al；Evaluation of the newsystem(umu-test)for the delection of environmental mutagens and carcinogens；MutatRes；1985：147(50)：129)。最近几年来也有一些研究者使用生物标记的方法检测环境污染物的遗传毒理效应，国内外已有诸多研究报道：Clements等用蝌蚪细胞DNA损伤研究除草剂对水生生物的遗传毒性(Clements C，Ralph S，Petras M，1997.Genotoxicity of select herbicides in Ranacatesbeiana tadpoles using the alkaline sing-cell gel DNA electrophoresis(Comet)assay.Environ.Molec.Mutag.29：277-288)；Mitchelmore等利用鱼和水生生物的DNA损伤作为检测遗传毒性的生物标记物研究水污染的致癌作用(Mitchelmore C L，Birmelin C，Chipman J K，etal.Evidence for cytochrome P450 catalysis and free radical involvement in the production of DNAstrand breaks by involvement in the production of DNA strand breaks by benzo[a]pyrene andnitroaromatics in mussel(Mytilus edulis L)digestive gland cells.Aquat Toxicol，1998，41：193-212)；Hartmann等曾用单细胞凝胶电泳(SCGE)和姐妹染色单体交换(SCE)技术研究重金属污染的遗传毒理效应(Hartmann A，Plappert U，Poetter F，et al.2003.Comparative study with the alkalinecomet assay and the chromosome aberration test[J].Mutat Res，536：27-38)。

综合上述材料可以看出：Ames试验和SOS/Umu测试试验法均是检测DNA的损伤程度的方法，Ames致突变试验是目前广泛使用的一种测试方法，但由于其所需菌株较多，操作复杂，检测费用高而限制了其应用；SOS/Umu试验的标准方法操作过程非常繁琐，在操作过程中需要多次转化培养板以及菌体所需培养基的配置和保存的条件比较苛刻，所用的试剂，生物标记物的特异性不够显著且花费相当高。因此，为了快速、准确的检测水源水中的遗传毒性物质，迫切需要建立一种简便、快速的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测水源水中的遗传毒性物质的方法，该方法简单易行，在保持试验操作常规化的前提下，可以节省大量时间。

为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：

一种检测水源水中遗传毒性物质的简易方法，包括以下步骤：

1)将菌株TA1535接种到液体LB或者营养肉汤培养基里，振荡培养过夜得到菌悬液，用无菌水调整菌悬液浓度至OD₅₉₅为0.2-0.3；

2)取至少四个浓度梯度的水样样品浓缩物各100μl，分别加入到550-650μl步骤1)所述的菌悬液中，35±2℃振荡培养2-3h，以DMSO为溶剂对照，以4-NQO为阳性对照；

3)振荡培养后加入2.5-3.0ml B-Buffer混匀，再加入5-10μl氯仿振荡混匀，加入500-800μlONPG溶液，35±2℃温育显色30-50min；

4)加入300-500μl Na₂CO₃溶液终止显色，测定显色后溶液的OD₄₂₀和OD₅₅₀；

5)计算样品和溶剂对照的酶活性，并计算诱导率IR，若IR≥2.0，且具有剂量反应关系时，表明水样样品含有遗传毒性物质。

其中，步骤1)是将菌株TA1535接种到LB液体培养基里，振荡培养过夜14-18小时得到菌悬液。

优选地，步骤1)中所述菌悬液OD₅₉₅为0.28-0.3。

优选地，步骤2)中设置四个浓度梯度的水样样品浓缩物，分别相当于水样样品的2L、1L、0.5L和0.25L。

优选地，步骤3)中氯仿的体积为8-10μl。

优选地，步骤3)为37℃温育显色50min。

与现有技术相比，本发明具有以下的有益效果：

1)本发明检测水源水中遗传毒性物质的简易方法，可以在保持试验操作常规化，测试结果精确、灵敏的前提下，省略很多步骤，节省大量时间；

2)本发明检测水源水中遗传毒性物质的简易方法，操作简单，整个试验操作过程无菌要求低。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步阐述，其目的仅在于更好地理解本发明的内容，因此，本发明的保护范围包括并不仅限于所举之例。

实施例1一种检测水源水遗传毒性物质的简易方法

本实施例所述检测水源水遗传毒性物质的简易方法主要包括如下步骤：

1)将菌株TA1535(购买于德国菌种保藏中心DSMZ，保藏编号是DSM 9274)接种到液体LB培养基里过夜培养(14-18小时)得菌悬液，其中LB培养基的配方为：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L。

2)调整菌悬液的浓度，使其OD₅₉₅达到0.28-0.30。

吸取过夜培养的TA1535菌悬液100μl于1.5ml离心管里，5000rpm离心5min收集菌体，用无菌水稀释到1.0ml，测定其OD₅₉₅的值。然后利用菌体和无菌水调整其浓度，使其OD₅₉₅达到0.28-0.30。分别取600μl该菌悬液到5ml试管里用于下一步试验。

3)取100μl四个梯度浓度的水样样品浓缩物(分别相当于水样样品的2L、1L、0.5L和0.25L)，分别加到装有菌悬液的5ml试管里，混匀后用报纸包好，放在37℃摇床振荡培养3h。另外，取100μl DMSO(二甲基亚砜)加到装有菌悬液的5ml试管里作为溶剂对照，取100μl 4-NQO(4-硝基喹啉-1-氧化物)(1mg/1mlDMSO)加到装有菌悬液的5ml试管里作为阳性对照。

4)3小时后，再往每个试管中加入2.7ml B-buffer，混匀后加入10μl氯仿，振荡混匀。其中B-buffer的主要成分是：磷酸氢二钠20.18g/L，磷酸二氢钠5.5g/L，氯化钾0.75g/L，硫酸镁0.25g/L，用之前需要加2-疏基乙醇(270ul/100ml)。

5)往每个试管中加入600μl ONPG溶液，放在37℃温箱中温育显色50分钟。

其中ONPG溶液是将45mg ONPG(邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷)溶解在10ml磷酸盐缓冲液中；

磷酸盐缓冲液的配方为：磷酸氢二钠4.344g，磷酸二氢钠2.172g，无菌水400ml，pH7.0±0.2，121℃高压灭菌20分钟。

6)显色后往每个试管中加入400μl终止试剂，终止显色反应。

其中终止试剂的成分为：无水碳酸钠52.995g溶于450ml无菌水后再稀释至500ml。

7)测定显色反应终止后溶液的光密度OD₄₂₀和OD₅₅₀的值，利用以下公式计算水样和溶剂对照的酶的活性，并计算诱导率IR。

$\mathrm{IU}=\frac{1000*(A420-1.75*A550)}{T*V*A595}$

其中，T为显色时间，V为菌体稀释倍数。

IR＝IU(水样样品)/IU(溶剂对照)

只有当阳性对照的IR值大于2.0时，试验结果才有效。当水样样品在2L的剂量下IR≥2.0，且具有剂量反应关系时，反应为阳性，表明水样样品中含有遗传毒性物质；当1.0＜IR＜2.0时，反应为可疑，表明水样样品中可能含有遗传毒性物质，此时需结合别的试验方法来验证；当IR≤1.0时，反应为阴性，表明水样样品中不含遗传毒性物质。

实施例2：本发明简易方法与SOS/umu标准方法可靠性、灵敏度差异比较

为了比较两种方法的可靠性和灵敏度差异，在相同试验条件下分别用两种不同的方法测定了广州某地自来水中DNA原始损伤物质，试验三次重复。

本实施例所使用的简易方法与实施例1相同，其与SOS/umu标准方法的比较结果具体见表1。

表1相同试验条件下两种方法的比较

从表1可以看出，两种方法的IR值在α＝0.05的水平上并不存在显著差异。

实施例3：本发明简易方法与SOS/umu标准方法灵敏度差异比较

为了比较两种方法的可靠性和灵敏度差异，在相同试验条件下分别用两种不同的方法测定了广州某地自来水中DNA原始损伤物质，试验三次重复。

本实施例所述的检测水源水中的遗传毒性物质的简易方法，步骤如下：

1)将菌株TA1535(购买于德国菌种保藏中心DSMZ，保藏编号是DSM 9274)接种到营养肉汤培养基里过夜培养(14-16小时)得菌悬液，其中营养肉汤培养基的配方为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH7.4。

吸取过夜培养的TA1535菌悬液100μl于1.5ml离心管里，5000rpm离心5min收集菌体，用无菌水稀释到1.0ml，测定其OD₅₉₅的值。然后利用菌体和无菌水调整其浓度，使其OD₅₉₅达到0.21-0.28。取600μl该菌悬液到5ml试管里用于下一步试验。

2)同实施例1。

3)3小时后，再往每个试管中加入2.7ml B-buffer，混匀后加入8μl氯仿，振荡混匀。其中B-buffer的主要成分是：磷酸氢二钠20.18g/L，磷酸二氢钠5.5g/L，氯化钾0.75g/L，硫酸镁0.25g/L，用之前需要加2-疏基乙醇(270ul/100ml)。

4)往每个试管中加入800μl ONPG溶液，放在35℃温箱中温育显色30分钟。

其中ONPG溶液是将45mg ONPG(邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷)溶解在10ml磷酸盐缓冲液中；

磷酸盐缓冲液的配方为：磷酸氢二钠4.344g，磷酸二氢钠2.172g，无菌水400ml，pH7.0±0.2，121℃高压灭菌20分钟。

5)显色后往每个试管中加入400μl终止试剂，终止显色反应。

其中终止试剂的成分为：无水碳酸钠52.995g溶于450ml无菌水后再稀释至500ml。

6)测定显色反应终止后溶液的光密度OD₄₂₀和OD₅₅₀的值，利用以下公式计算水样和溶剂对照的酶的活性，并计算诱导率IR。

$\mathrm{IU}=\frac{1000*(A420-1.75*A550)}{T*V*A595}$

其中，T为显色时间，V为菌体稀释倍数。

IR＝IU(水样样品)/IU(溶剂对照)

只有当阳性对照的IR值大于2.0时，试验结果才有效。当水样样品在2L的剂量下IR≥2.0，且具有剂量反应关系时，反应为阳性，表明水样样品中含有遗传毒性物质；当1.0＜IR＜2.0时，反应为可疑，表明水样样品中可能含有遗传毒性物质，此时需结合别的试验方法来验证；当IR≤1.0时，反应为阴性，表明水样样品中不含遗传毒性物质。

本实施例所述的简易方法与SOS/umu标准方法的比较结果，具体见表1。

表2相同试验条件下两种方法的比较

从表2可以看出，两种方法的IR值α＝0.05的水平上并不存在显著差异。

Claims (6)

1、一种检测水源水遗传毒性物质的简易方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将菌株TA1535接种到液体LB或者营养肉汤培养基里，振荡培养过夜得到菌悬液，用无菌水调整菌悬液浓度至OD₅₉₅为0.2-0.3；

2)取至少四个浓度梯度的水样样品浓缩物各100μl，分别加入到550-650μl步骤1)所述的菌悬液中，35±2℃振荡培养2-3h，以DMSO为溶剂对照，以4-NQO为阳性对照；

3)振荡培养后加入2.5-3.0ml B-Buffer混匀，再加入5-10μl氯仿振荡混匀；加入500-800μlONPG溶液，35±2℃温育显色30-50min；

4)加入300-500μl Na₂CO₃溶液终止显色，测定显色后溶液的OD₄₂₀和OD₅₅₀；

5)计算样品和溶剂对照的酶活性，并计算诱导率IR，若IR≥2.0，且具有剂量反应关系时，表明水样样品含有遗传毒性物质。

2、根据权利要求1所述的检测水源水遗传毒性物质的简易方法，其特征在于：步骤1)将菌株TA1535接种到液体LB培养基里，振荡培养过夜14-18小时得到菌悬液。

3、根据权利要求1所述的检测水源水遗传毒性物质的简易方法，其特征在于：步骤1)中所述菌悬液OD₅₉₅为0.28-0.3。

4、根据权利要求1所述的检测水源水遗传毒性物质的简易方法，其特征在于：步骤2)中设置四个浓度梯度的水样样品浓缩物，分别相当于水样样品的2L、1L、0.5L和0.25L。

5、根据权利要求1所述的检测水源水遗传毒性物质的简易方法，其特征在于：所述步骤3)中氯仿的体积为8-10μl。

6、根据权利要求1所述的检测水源水遗传毒性物质的简易方法，其特征在于：所述步骤3)为37℃温育显色50min。