CN108002542B - 菌株的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及环境工程领域，特别涉及利用一株厌氧微生物处理水环境中的有机胂污染物。本发明公开了一种利用希瓦氏菌去除水环境中对硝基苯胂酸的方法，利用Shewanella oneidensis MR‑1的异化金属还原能力，通过Mtr电子传递途径，在厌氧条件下完成对水中污染物对硝基苯胂酸的完全降解，生成毒性较低的阿散酸，从而实现降低对硝基苯胂酸的潜在环境威胁的目标。本发明所述的Shewanella oneidensis MR‑1是首株被报道能够应用于对硝基苯胂酸降解的细菌，其优点在于具有高效降解水中对硝基苯胂酸的功效，且本专利中提到的主要功能蛋白能够为基因工程菌株的改造提供重要参考。

Description

菌株的应用
技术领域
本发明涉及环境工程领域，特别涉及利用一株厌氧微生物处理水环境中 的有机胂污染物。
背景技术
砷是一种类金属元素，在自然界中分布广泛，通常与各种金属矿物结合 在一起，如铜、铁等。砷及其化合物具有很强的毒性，被广泛应用于农药、 除草剂、杀虫剂中。此外，砷和含砷金属的开采、冶炼，用砷或砷化合物作 原料的玻璃、颜料、原药、纸张的生产以及煤的燃烧等过程，产生含砷废水、 废气和废渣，对环境造成污染。含砷废水、农药及烟尘也会污染土壤造成砷 在土壤中累积并由此进入农作物组织中最终在食物链中富集。砷和砷化物还 可通过水、大气等途径进入人体，从而造成危害。含砷农药和饲料添加剂的 生产及使用，也增加了环境中的砷污染量。
苯胂酸化合物是一类有机胂物质，具有低毒、在动物体内低残留、促进 饲料转化、抵抗寄生虫和其他传染疾病、沉色素等多种效果，而被广泛用作 鸡、猪等禽畜的养殖饲料添加剂。目前被广泛应用于养殖业的苯胂酸类化合 物有：对硝基苯胂酸，洛克沙胂，阿散酸和卡巴胂。四种化合物结构相似， 进入动物体内后几乎不会被消化道所吸收，故不会残留在禽畜肉产品中，曾 被认为是一种对人类健康和环境高度安全的化合物。美国食品和药物管理局 最早于1946年批准洛克沙胂用于鸡饲料，1983年批准用作猪、鸡的促生长剂， 后陆续批准其他三种有机砷化合物应用于禽畜的饲料添加剂。随后，这四种 苯胂酸类化合物被包括我国在内的世界各国广泛应用。据统计，美国每年用 于饲料添加剂的苯胂酸类化合物用量可以到达到400吨。
2011年美国媒体披露市场上的部分鸡肉可能含有少量致癌物质-无机砷。 FDA在对当时市场上的鸡肉中砷含量进行调查后发现，在饲养中食用过洛克 沙胂的鸡，其肝脏和其他部分中均含有一定含量的无机砷，且含量远高于未 使用洛克沙胂的鸡。尽管卫生部门声称鸡肉中砷的含量微小不至于危害健康， 但生产洛克沙胂的辉瑞公司在2011年停止了该产品的生产。2013年9月，FDA 宣布禁止洛克沙胂、阿散酸以及卡巴胂在动物饲料添加方面的使用，对硝基 苯胂酸成为唯一未被禁止的有机砷饲料添加剂。2015年FDA禁止对硝基苯胂 酸在动物饲养中的使用许可，自此美国已经全线禁止了苯胂酸类化合物在动 物饲养中的使用。
我国从上世纪80年代末将苯胂酸类化合物引进国内，1996年正式批准 其用于禽畜养殖。农业部于2001年7月3日发布了《饲料药物添加剂使用规 范》，该规范对苯胂酸类化合物的使用做出了规定。例如饲料中使用洛克沙胂 应先制成10％预混剂，同时要求每1000g预混剂中含洛克沙胂50g或100g， 蛋鸡产蛋期禁用，休药期5天。近些年我国农业部无公害生猪养殖已将猪最 常用的苯胂酸类化合物——洛克沙胂列为禁用品，但苯胂酸类化合物在养殖 业中的滥用仍然屡见不鲜。
尽管苯胂酸类化合物已经在国内外禁止多年，但由于多年来苯胂酸类化 合物在养殖业的大量使用，苯胂酸类化合物对人类健康和环境安全造成的负 面影响不可小觑。长期食用有机砷添加剂的动物，会在体内产生一定量的无 机砷，虽然目前尚未证实该水平的无机砷含量是否对人体有害，但无机砷通 过肉食进入人体的危害不容忽视；最值得注意的是，大部分苯胂酸类化合物 在动物体内均未发生变化便随排泄物进入土壤和地表水中，原本低毒性的苯 胂酸类化合物经过长时间的环境转化生成剧毒的无机砷，将会直接对环境造 成污染。
在四种常见的苯胂酸类化合物中，对硝基苯胂酸被禁止的时间较晚，针 对这种有机胂化合物的微生物处理方法仍未见报道，因此找到一种有效处理 养殖废水和其他环境中对硝基苯胂酸的方法具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了菌株的应用。利用Shewanella oneidensis MR-1 的异化金属还原能力，通过Mtr电子传递途径，在厌氧条件下完成对水中污 染物对硝基苯胂酸的完全降解，生成毒性较低的阿散酸，从而实现降低对硝 基苯胂酸的潜在环境威胁的目标。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了希瓦氏菌在降解水环境中对硝基苯胂酸中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，所述希瓦氏菌为Shewanella oneidensis MR-1。
在本发明的一些具体实施方案中，所述降解通过Mtr电子传递途径。
在本发明的一些具体实施方案中，所述降解的靶标选自蛋白CymA、 MtrA、MtrB、MtrC或OmcA。
本发明还提供了一种降解水环境中对硝基苯胂酸的方法，取希瓦氏菌接 种于所述水环境。
在本发明的一些具体实施方案中，降解水环境中对硝基苯胂酸的方法中 采用的希瓦氏菌为Shewanella oneidensis MR-1。
在本发明的一些具体实施方案中，降解水环境中对硝基苯胂酸的方法的 反应条件为：在厌氧环境下，营养条件不大于5mM乳酸钠，pH为6.5～8， 温度为25～37℃，时间不少于24h。
在本发明的一些具体实施方案中，降解水环境中对硝基苯胂酸的方法的 反应条件为：在厌氧环境下，pH为7.2，温度为30℃，时间不少于24h。
在本发明的一些具体实施方案中，降解水环境中对硝基苯胂酸的方法具 体为：取希瓦氏菌接种于所述水环境，将对硝基苯胂酸降解为阿散酸，再将 所述阿散酸降解为无机砷和苯胺。
本发明还提供了一种固定水环境中无机砷的方法，取希瓦氏菌接种于所 述水环境。
在本发明的一些具体实施方案中，固定水环境中无机砷的方法中采用的 希瓦氏菌为Shewanella oneidensis MR-1。
在本发明的一些具体实施方案中，固定水环境中无机砷的方法的反应条 件为：在厌氧环境下，营养条件不大于5mM乳酸钠，pH为6.5～8，温度为 25～37℃，时间不少于24h。
在本发明的一些具体实施方案中，固定水环境中无机砷的方法的反应条 件为：在厌氧环境下，pH为7.2，温度为30℃，时间不少于24h。
在本发明的一些具体实施方案中，固定水环境中无机砷的方法具体为： 取希瓦氏菌接种于所述水环境，将对硝基苯胂酸降解为阿散酸，再将所述阿 散酸降解为无机砷和苯胺。
本发明还提供了降解水环境中对硝基苯胂酸的靶标，其选自蛋白CymA、 MtrA、MtrB、MtrC或OmcA。
本发明公开了一种利用希瓦氏菌去除水环境中对硝基苯胂酸的方法。利 用Shewanella oneidensis MR-1的异化金属还原能力，通过Mtr电子传递途径， 在厌氧条件下完成对水中污染物对硝基苯胂酸的完全降解，生成毒性较低的 阿散酸，从而实现降低对硝基苯胂酸的潜在环境威胁的目标。该菌株将对硝 基苯胂酸首先降解为阿散酸，然后进一步将生成的阿散酸降解为微量的无机 砷和苯胺。该菌株通过独特的Mtr电子传递途径将对硝基苯胂酸降解，其主要 的作用蛋白为CymA、MtrA、MtrB、MtrC以及OmcA。本发明所述的Shewanella oneidensis MR-1是首株被报道能够应用于对硝基苯胂酸降解的细菌，其优点在 于具有高效降解水中对硝基苯胂酸的功效，且本专利中提到的主要功能蛋白 能够为基因工程菌株的改造提供重要参考。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实 施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示Shewanella oneidensis MR-1厌氧条件下对硝基苯胂酸降解示意图；
图2示降解产物的高效液相色谱结果示意图；
图3示降解产物的高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光检测仪联用的结 果示意图；
图4示降解产物的质谱分析图；
图5示对硝基苯胂酸降解的机理图；
图6示降解产物毒性检测结果示意图；
图7示Shewanella oneidensis MR-1的多种基因敲除菌株的降解结果示意 图；
图8示突变株还原柱状图；
图9示Shewanella oneidensis MR-1对硝基苯胂酸降解的分子机制示意图。
具体实施方式
本发明公开了菌株的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改 进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术 人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用 已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精 神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和 应用本发明技术。
为了找到一种高效优质的方法降解对硝基苯胂酸，本专利以研究降低水 环境中对硝基苯胂酸的环境毒性和环境残留量为技术背景，从微生物降解环 境污染物的技术角度出发，选择一株环境中广泛分布的异化金属还原菌对环 境浓度的对硝基苯胂酸进行降解，并通过多种检测手段分析对硝基苯胂酸降 解后的产物。从而得到一株能够应用于对硝基苯胂酸生物处理的模式微生物， 同时实现对降解产物进行环境毒性的预判。
本发明的第一个目的是提供一株能够有效降解对硝基苯胂酸的模式微生 物奥奈达希瓦氏MR-1(Shewanella oneidensis MR-1)，该菌株在GenBank中 的序列号为AE014299.2。
该菌株是一株具有异化金属还原能力的模式菌株，在水环境中分布广泛， 能够在厌氧条件下高效还原和降解多种高价态重金属及其氧化物、偶氮染料 等有机物污染物。其主要的生物学特性有：革兰氏阴性细菌，兼性厌氧，通 过复杂的胞外电子传递网络进行胞外呼吸，在厌氧条件下能够利用多种物质 作为终端电子受体，从而实现不同类型胞外电子受体的还原或降解。这种独 特的胞外呼吸能力使其成为水污染生物修复的模式细菌。
该菌株的对硝基苯胂酸降解特性：在厌氧条件下，该菌株能够在以对硝 基苯胂酸作为唯一电子受体、乳酸钠作为唯一电子供体的液体矿物盐培养基 中实现对对硝基苯胂酸的有效降解。接种4～5％的MR-1细菌到30mL希瓦氏 矿物盐培养基中，静置培养48～72h，希瓦氏菌能够完全降解0.2mM的对硝 基苯胂酸。
该菌株的对硝基苯胂酸降解机理：使用高效液相色谱、氢化物发生-原子 荧光检测仪-高效液相色谱联用以及高分辨质谱等方法，分析该菌株在72h的 培养过程中对硝基苯胂酸的降解产物。高效液相色谱结果表明，对硝基苯胂 酸的含量随着培养时间的延长而不断减少，产物含量不断增加；通过与标准 品比对，确定对硝基苯胂酸的主要降解产物为阿散酸。利用氢化物发生-原子 荧光检测仪和高分辨质谱对最终产物进行分析，发现其他三种降解产物 As(III)、As(V)和苯胺的存在。通过对对硝基苯胂酸和其他四种产物的分子结 构对比，最终得出该菌株对硝基苯胂酸的降解途径如图5所示，Shewanella oneidensisMR-1先将对硝基苯胂酸苯环上的硝基还原为氨基后生成阿散酸， 而后进一步还原部分阿散酸苯环基团上的砷酸基团为亚砷酸基团，最终因为 亚砷酸基团的不稳定性导致无机砷和苯胺的生成。
本发明的第二个目的是解析Shewanella oneidensis MR-1厌氧降解对硝基 苯胂酸的分子机制。
本发明通过基因敲除的手段，对Shewanella oneidensis MR-1降解对硝基 苯胂酸的电子传递通路进行了系统的解析，从而为该菌株的基因改造和类似 污染物的生物处理提供可靠的改进方向和实践参考。
Shewanella oneidensis MR-1降解对硝基苯胂酸后生成毒性明显降低的阿 散酸以及尚未达到环境浓度的微量无机砷，微量无机砷可以通过物理化学的 方法快速去除。本发明是处理水体中对硝基苯胂酸的合理方案，在水污染生 物处理过程中具有非常好的实用价值和参考价值。
本发明所述菌株的应用中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从 商业途径得到。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1、厌氧条件下Shewanella oneidensis MR-1降解对硝基苯胂酸
本实例中所使用的LB培养基配方如下：10g/L蛋白胨、10g/L NaCl、5 g/L酵母膏，121℃高压灭菌20min后用于菌种的扩大培养。
厌氧培养所使用的培养基主要成分如下：11.91g/L HEPES缓冲盐，NaCl 0.46g,K2HPO4 0.05g/L,KH2PO4 0.035g/L,(NH4)2SO4 0.225g/L,MgSO4·H2O 0.117g/L以及微量元素混合液(pH＝7.2)。本实例中以乳酸钠作为唯一的电 子供体加入厌氧培养基中以维持细菌生长(终浓度5mM/L)。
本实例中所使用的厌氧反应体系为装有30mL矿物盐培养基的血清瓶， 在曝氮气15min后，用丁基橡胶塞和铝盖对血清瓶进行封装以保证反应体系 中稳定的厌氧环境。装有培养基的血清瓶经121℃高压灭菌20min后，用注 射器加入0.2mM/L的对硝基苯胂酸(需要经过0.22μm的滤膜过滤除菌)待 用。
菌种活化：将固体培养基上的菌种用接种环刮取后接种于100mL的LB 培养基，随后置于温度为30℃，转速为200rpm的摇床上培养16小时，获 得活化菌液。
过夜培养后，将LB培养基中的细菌离心收集(6000rpm，5min)，用 灭菌后矿物盐培养基对收集后的细菌进行多次洗涤后，确定菌液浓度。将一 定量洗涤后的菌液用注射器加入矿物盐培养基，使得30mL厌氧反应体系中 的细菌浓度为OD600＝0.4。将血清瓶置于30℃的恒温培养箱中静置培养，定 时用注射器抽取样品进行检测。
如图1、表1所示，本实例中Shewanella oneidensis MR-1能够降解对硝 基苯胂酸，24h内细菌已经将对硝基苯胂酸完全降解。说明Shewanella oneidensis MR-1能够在厌氧条件下高效降解对硝基苯胂酸。
表1
Figure BDA0001489412480000071
实施例2、厌氧条件下Shewanella oneidensis MR-1对硝基苯胂酸的降解产物 以及降解机制分析
本实例中主要通过多种分析手段对降解产物进行定性分析。
1.产物的高效液相色谱检测
前一实例所述样品，经过0.22μm滤膜过滤后用于高效液相色谱、氢化物 发生-原子荧光检测仪的检测。高效液相色谱(HPLC,Essentia LC-16, SHIMADZA,Japan)分析条件为：色谱柱(ZORBAX Eclipse Plus C18：4.6×250 nm，5μm，Agilent，USA)，流动相为用纯净水配制的10mM/L磷酸二氢钾 溶液(pH7.2)，测定流速为1.0mL/min，测试进样量为20μL，对硝基苯胂 酸和阿散酸的测试波长均为450nm，柱温设置为30℃。
本实例中高效液相色谱图谱结果如图2所示，样品中对硝基苯胂酸的保 留时间与标准样品一致，其中48h样品中对硝基苯胂酸的峰面积明显减少， 新出现的产物峰面积明显上升。通过比对阿散酸标准品，可以证实主要的降 解产物为阿散酸。
2.产物的高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光检测仪检测结果
如上所述的样品，经过滤处理后方可进行检测。
高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光检测仪(HPLC-HG-AFS)，其主要 测试条件如表2所示：
表2
Figure BDA0001489412480000081
样品的测试结果如图3、表3所示，对硝基苯胂酸经Shewanella oneidensis MR-1降解后有As(III)和As(V)的生成，其生成浓度最高为22.5μg/L。此外， 无机砷生成量呈现先上升后下降的趋势，其中最后一个取样时间点84h上清 液中的无机砷含量趋近于零，可以判断无机砷可能吸附或进入细菌胞内。因 而Shewanella oneidensis MR-1还原对硝基苯胂酸后，可以对生成的无机砷进 行生物固定，减少微生物转化生成的无机砷对环境的威胁，是一种有效的有 机胂处理手段。
表3
Figure BDA0001489412480000091
3.产物的高分辨质谱结果
本实例中的样品处理方法如下：
对厌氧培养84h的培养基上清液进行离心除菌收集(6500rpm，10min)， 得到的全部上清液后需经过0.22μm的滤膜过滤，对过滤后的上清液进行固相 萃取后溶于5mL的甲醇待测。
所得样品送至中国科学技术大学理化试验中心进行高分辨质谱的检测， 检测结果如图4所示。84h的样品中检测到微量苯胺的存在，证实有部分阿散 酸发生进一步降解，从而产生了无机砷以及苯胺。
4.对硝基苯胂酸降解机制示意图
如图5所示，根据以上测试结果，Shewanella oneidensis MR-1降解对硝 基苯胂酸的反应为两步反应：对硝基苯胂酸—阿散酸—As(III)、As(V)和苯胺； 其中第一步反应为主要反应，降解产物大部分为阿散酸，仅有少量阿散酸经 第二步还原反应后生成As(III)、As(V)和苯胺。值得注意的是，反应进行84h 后，第二步反应生成的无机砷在上清液中含量趋近于零，说明细菌能够对生 成的无机砷进行固定，降低了无机砷产物对环境的潜在威胁，在实际应用中 具有积极意义。
实施例3、Shewanella oneidensis MR-1对硝基苯胂酸降解产物的毒性检测
本实例应用一株自体发光细菌Salmonella typhimurium Sal94对Shewanellaoneidensis MR-1对硝基苯胂酸的降解产物的毒性进行检测。
Salmonella typhimurium Sal94是一株被广泛应用于水样遗传毒性检测的 模式菌株，水体中所含物质的毒性越强，其自体发光的强度越低，是一种灵 敏的产物毒性评估方法。
本实例中Salmonella typhimurium Sal94菌株的活化如下所述：该菌株在 LB培养基中活化时，需要添加30μg/ml的卡那霉素保证质粒的稳定性，在恒 温摇床(30℃，200rpm)过夜培养后，以1:100的接种量接入新鲜的LB培养 基中继续培养5～6小时备用(26℃，200rpm)。
本实例以96孔细胞培养板为实验体系，分别进行0h降解产物、48h降 解产物、84h降解产物三组对照实验，每组加入100μL待测溶液以及100μL 的Salmonella typhimuriumSal94活化菌液，每组设三个平行实验；96孔细胞 培养板置于酶标仪(Synergy HT,BioTek,USA)中进行培养和发光强度测定 (26℃，静置培养，30min检测一次)。
图6、表4为毒性测试结果，相较于0h样品而言，48h和84h样品组的 荧光强度随着培养时间的增长有明显的升高，说明随着样品中的对硝基苯胂 酸的降解，新生成的产物毒性较对硝基苯胂酸而言更低，对细菌的毒害作用 也随之降低。
表4
Figure BDA0001489412480000101
Figure BDA0001489412480000111
Figure BDA0001489412480000121
Figure BDA0001489412480000131
本实例有力的证明了Shewanella oneidensis MR-1对硝基苯胂酸的降解过 程是去毒过程，证实该菌株可以应用于实际水环境中的苯胂酸类污染物的降 解。
实施例4、厌氧条件下Shewanella oneidensis MR-1不同突变株对硝基苯胂酸 的降解速率对比
Shewanella oneidensis MR-1作为一种具有异化金属还原能力的细菌，其 还原降解电子受体的主要途径是通过细胞膜内外以及周质空间的细胞色素C 蛋白完成电子的传递。目前已知最为重要的电子传递途径为Mtr途径，本实 例中利用多种Mtr途径蛋白敲除株降解对硝基苯胂酸，用以判断被敲除的蛋 白在Shewanella oneidensis MR-1降解对硝基苯胂酸中的作用，从而在分子层 面解析对硝基苯胂酸的降解机制。
本实验通过同源重组的敲除方式获取到以下突变株：
表5
Figure BDA0001489412480000132
图7、图8、表6、表7表明，利用突变株进行对硝基苯胂酸的降解实验， 其中四种突变株细菌的扩大培养以及厌氧降解对硝基苯胂酸实验的步骤同实 施例一中所述，即于LB培养基中进行有氧扩大培养后，在厌氧培养基中完成 厌氧降解实验。为完全体现出野生株细菌与突变株细菌在还原能力上的不同， 在该实例中30mL厌氧反应体系中的细菌浓度调整为为OD600＝0.3，取样方 法如前例所述。图7、图8为五株细菌厌氧降解对硝基苯胂酸的实验结果，四 种突变株的还原能力均表现出不同程度的下降。其中两种突变株，ΔmtrA、 ΔcymA的还原能力较野生株下降均超过60％，说明在MR-1还原对硝基苯胂 酸的过程中，蛋白MtrA、CymA以及Mtr途径主要蛋白发挥了重要作用。
表6
Figure BDA0001489412480000141
表7
Figure BDA0001489412480000142
图9为Shewanella oneidensis MR-1对硝基苯胂酸降解机制的简略示意图： MR-1自身厌氧呼吸代谢产生的电子经由胞内蛋白CymA传递至内膜蛋白 MtrA；内膜蛋白MtrA将电子传递至跨膜蛋白MtrB，从而通过外膜蛋白MtrC 与OmcA将电子传递至胞外电子受体对硝基苯胂酸，最终将其还原。
本发明利用一株异化金属还原菌Shewanella oneidensis MR-1完成了对新 型污染物对硝基苯胂酸的降解，所得产物阿散酸较对硝基苯胂酸的毒性明显 下降，且微量剧毒产物无机砷可以被菌体吸附固定便于去除。Shewanella oneidensis MR-1是首株能够有效去除水环境中对硝基苯胂酸污染的高效降解 菌株，在水处理中具有重要的应用价值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种降解水环境中对硝基苯胂酸的方法，其特征在于，取希瓦氏菌接种于所述水环境；
所述希瓦氏菌为Shewanella oneidensis MR-1；
所述方法的反应条件为：在厌氧环境下，营养条件不大于5 mM乳酸钠，pH为6.5~8，温度为25~37℃，时间不少于24h；
所述降解通过Mtr电子传递途径。
2.一种固定水环境中无机砷的方法，其特征在于，取希瓦氏菌接种于所述水环境，将对硝基苯胂酸降解为阿散酸，再将阿散酸降解为微量的无机砷和苯胺；所述降解通过Mtr电子传递途径；
所述希瓦氏菌为Shewanella oneidensis MR-1；
所述方法的反应条件为：在厌氧环境下，营养条件不大于5 mM乳酸钠，pH为6.5~8，温度为25~37℃，时间不少于24h。
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