CN101486989B - 荧光示踪多功能脱色的脱色希瓦氏工程菌及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种荧光示踪多功能脱色的脱色希瓦氏工程菌及其构建方法，旨在提供一种对偶氮、蒽醌和三苯基甲烷三大类染料都具有高效脱色能力，并且具有荧光示踪功能的基因工程菌。本发明的技术方案是将外源融合基因SPrtpmD’整合进入脱色希瓦氏菌S12，所述的融合基因SPrtpmD’是在脱色希瓦氏菌S12的NAD(P)H脱氢酶基因启动子序列之后连接三苯基甲烷染料脱色酶修饰基因tpmD’构成，所述的三苯基甲烷染料脱色酶修饰基因tpmD’，是在三苯基甲烷染料脱色酶基因tpmD的5’端起始密码子前加有SD序列，在3’端终止密码子之前加有能螯合双砷荧光染料的编码6个氨基酸的小标签。本发明用于环境修复和治理中。

Description

荧光示踪多功能脱色的脱色希瓦氏工程菌及其构建方法

技术领域：

本发明属于生物技术领域及环境工程领域，具体涉及一种荧光示踪多功能脱色的脱色希瓦氏工程菌及其构建方法。

背景技术：

染料和染料废水对环境的污染以及对人类的危害已广为世人所关注，已经成为全球性的生态环境问题。控制和消除这一污染已引起各国学者的高度重视。实践证明，厌氧一好氧生物强化处理体系是最经济有效的技术。生物强化技术的实现途径有：①投加有效降解的微生物；②优化现有处理系统的营养供给；③投加基因工程菌。

目前，印染废水处理生物强化最为普遍的方式为直接投加经过筛选、驯化后对目标污染物具有降解能力的微生物。这种方式整体水平上效率低、脱色率不高、脱色范围单一、处理时间长。

偶氮、蒽醌和三苯基甲烷类染料是目前应用最为广泛的三大类染料。脱色希瓦氏菌(Shewanella decolorationis)S12是本发明人的研究团队分离的、已在实验室水平和工程实践中证明的可有效进行生物强化的优秀高效菌株，该菌株对目前应用广泛的偶氮和蒽醌两大类染料的脱色能力较强，但对三苯基甲烷染料脱色能力较弱。嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophilasubsp DN322是本发明人的研究团队从印染废水处理厂的活性污泥中分离到的一株对结晶紫、碱性品红、灿烂绿及孔雀绿等多种三苯基甲烷类染料具有高效脱色能力的嗜水气单胞菌。从该菌中分离到一种新的三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD，三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD蛋白分子量为58.8kDa，等电点为5.6。酶蛋白是由两个相同分子量的亚基组成的二聚体，每个亚基的分子量为29.4kDa。该酶能够催化结晶紫、碱性品红、灿烂绿及孔雀石绿等多种三苯基甲烷类染料脱色降解，对底物具有结构专一性，能够高效脱色降解三苯基甲烷染料的菌株，但由于这类菌对鱼类、蛙类具有潜在的致病性，从而限制了该菌株在环境生物修复中的应用。因此构建能够应用于实现生物强化的具有脱色范围广、脱色效率高、遗传稳定性好的新的基因工程菌显得非常必要。

由于目前生物强化用基因工程菌(genetically engineered microorgantsms，GEMS)在各种处理系统中的存活情况和时空数量变化的监控和追踪仍然是目前的技术难点，因此赋予遗传稳定性好、降解效率高、降解范围广的基因工程菌可示踪性对于生物强化技术进一步发展具有重要意义。

发明内容：

本发明的目的是在对脱色希瓦氏菌S12和嗜水气单胞菌DN322对不同染料的脱色特点研究的基础上，通过基因工程技术，提供一种对偶氮、蒽醌和三苯基甲烷类染料三大类染料都具有高效脱色能力，并且具有荧光示踪功能的基因工程菌及其构建方法。

本发明通过下述方案予以实施的：

本发明所述的荧光示踪多功能脱色的脱色希瓦氏工程菌是将外源基因整合进入染色体中，所述的外源基因是融合基因SPrtpmD’，所述的融合基因SPrtpmD’是在脱色希瓦氏菌S12的NAD(P)H脱氢酶基因启动子序列SPr之后连接三苯基甲烷染料脱色酶修饰基因tpmD’构成，所述的三苯基甲烷染料脱色酶修饰基因tpmD’，是在三苯基甲烷染料脱色酶基因tpmD的5’端起始密码子ATG前加有SD序列，在3’端终止密码子之前加有能螯合双砷荧光染料的编码6个氨基酸(CCPGCC)的小标签，所述的tpmD序列如SEQ1所示，所述的NAD(P)H脱氢酶基因启动子序列如SEQ2所示，所述的SD序列如SEQ7所示，所述的螯合双砷荧光染料编码CCPGCC六个氨基酸的碱基序列如SEQ6所示，所述的工程菌能分泌能螯合双砷荧光染料的三苯基甲烷染料脱色酶。

所述的荧光示踪多功能脱色的脱色希瓦氏菌工程菌的构建方法，其步骤如下：

a)tpmD’序列的获取：应用PCR技术，以嗜水气单胞菌DN322的DNA为模板，扩增出三苯基甲烷染料脱色酶基因tpmD，在其5’端的起始密码子前加有SD序列，在其在3’端终止密码子之前加螯合双砷荧光染料的编码CCPGCC六个氨基酸的碱基序列，将此序列命名为tpmD’。

b)脱色希瓦氏菌S12的NAD(P)H脱氢酶基因启动子SPr的获取：以脱色希瓦氏菌S12基因组DNA为模板PCR扩增NAD(P)H脱氢酶基因的启动子序列。

c)片段EFA的获取：以脱色希瓦氏菌S12基因组DNA为模板，PCR扩增而得片段EFA。

d)片段EFB的获取：以脱色希瓦氏菌S12基因组DNA为模板，PCR扩增而得片段EFB。

e)SPrtpmD’的构建：利用TP-PCR技术，在tpmD’序列5’端前加脱色希瓦氏菌S12的NAD(P)H脱氢酶基因启动子SPr，从而构建成SPrtpmD’。

f)EFASPrtpmD’的构建：利用TP-PCR技术，在SPrtpmD’的5’端前加片段EFA而构建成。

g)EFASPrtpmD’EFB的构建，利用TP-PCR技术，在EFA SPrtpmD’的3’端加片段EFB。

h)将构建好的EFASPrtpmD’EFB电击转化到脱色希瓦氏菌S12中。

i)利用同源重组使EFASPrtpmD’EFB整合到脱色希瓦氏菌S12基因组染色体。

j)通过PCR验证，脱色能力测定，荧光筛选，获得脱色希瓦氏菌S12基因工程菌。

所述的片段EFA是脱色希瓦氏菌S12一不编码蛋白的基因间区上半部分，其序列如SEQ3所示，所述的片段EFB是脱色希瓦氏菌S12一不编码蛋白的基因间区下半部分，其序列如SEQ4。

所述的PCR验证筛选是通过以荧光示踪多功能脱色的脱色希瓦氏菌S12工程菌的基因组DNA为模板PCR扩增EFASPrtpmD’EFB，SPrtpmD’，tpmD’片段测定分析的，选取能同时扩增出EFASPrtpmD’EFB，SPrtpmD’，tpmD’片段的菌株为目的菌株。

所述的脱色能力筛选是通过将脱色希瓦氏菌S12基因工程菌对偶氮、蒽醌和三苯基甲烷类染料进行脱色能力测定，选取对偶氮、蒽醌和三苯基甲烷类染料具有高效脱色作用的为目的菌株。

所述的荧光筛选是通过显微镜对脱色希瓦氏菌S12基因工程菌进行分析的，选取具有四半胱氨酸-双砷荧光标记的菌株为目的菌株。

用于本发明的嗜水气单胞菌DN322和脱色希瓦氏菌S12，其中嗜水气单胞菌DN322已经在文献中公开记载(参考文献：“细菌脱色酶TpmD对三苯基甲烷类染料脱色的酶学特性研究”，任随周，郭俊，王亚丽，岑英华，孙国萍微生物学报，第46卷第3期，第385～389页，2006年4月；“细菌脱色酶TpmD的酶学特性研究”，任随周，郭俊，王亚丽，岑英华，孙国萍微生物学报，第46卷第5期，第823～826页，2006年10月)，其中脱色希瓦氏菌S12也在文献中公开记载(参考文献：“脱色希瓦氏菌(Shewanella decolorationis)S12的脱色特性”，许玫英，钟小艳，曹渭，郭俊，岑英华，孙国萍；微生物学通报，第32卷第1期，第5-9页，2005年)上述两微生物本申请人持有，并且保证可以在本发明申请日起20年内向公众提供。

本发明构建的荧光示踪多功能脱色的脱色希瓦氏菌S12工程菌通过实验证明，该细菌具有脱色范围广，对偶氮、蒽醌和三苯基甲烷三大类染料都具有脱色作用，并且具有脱色效率高，其对上述三种染料脱色能力与嗜水气单胞菌DN322对三苯基甲烷染料和脱色希瓦氏菌S12对偶氮和蒽醌类染料的的脱色能力相当，遗传稳定性好等优点。由于选择的是S12染色体上一段没有功能的区域作为同源重组位点，这样不会对脱色希瓦氏菌S12的任何功能造成破坏和影响，同时又利用了S12自身的组成型强表达基因的启动子来启动外源基因的表达，这样既不会造成表达量不够的问题，也解决了表达量太高而造成的对宿主菌的伤害的问题，能够安全的对环境中的染料进行脱色，由于荧光示踪标记的加入，使得能够对工程菌在处理系统中的存活情况和时空数量变化进行监控和追踪，精确的控制处理系统，使其在生物强化应用时的跟踪和检测更为方便、快捷。

附图说明：

图1是PCR产物电泳分析图，图中，M1：DNA Marker(DL5000)；P+T’：Spr和tpmD’的连接产物；EFA：EF383142A的PCR产物；EFB：EF383142B的PCR产物；EFAPTEFB：EFA，SPrtpmD’，EFB3个片段的连接产物；M2：DNAMarker(DL2000)；

图2是PCR产物电泳图，图中，M1：DNAMarker(DL5000)；1：以脱色希瓦氏菌S12-tpmD’-1基因组为模板，S.V.up，S.V.down为引物扩增的PCR产物；2：以脱色希瓦氏菌S12-tpmD’-79基因组为模板，S.V.up，S.V.down为引物扩增的PCR产物；3：以S12-tpmD’-91基因组为模板，S.V.up，S.V.down为引物扩增的PCR产物；4：以脱色希瓦氏菌S12基因组为模板，S.V.up，S.V.down为引物扩增的PCR产物；5：以脱色希瓦氏菌S12-tpmD’-1基因组为模板，EF383142AF，EF383142BR为引物扩增的PCR产物；6：以脱色希瓦氏菌S12-tpmD’-79基因组为模板，EF383142AF，EF383142BR为引物扩增的PCR产物；7：以脱色希瓦氏菌S12-tpmD’-91基因组为模板，EF383142AF，EF383142BR为引物扩增的PCR产物；8：以脱色希瓦氏菌S12基因组为模板，EF383142AF，EF383142BR为引物扩增的PCR产物；9：以脱色希瓦氏菌S12-tpmD’-1基因组为模板，prometerEF，TpmDC4ER为引物的PCR产物；10：以脱色希瓦氏菌S12-tpmD’-79基因组为模板，prometerEF，TpmDC4ER为引物扩增的PCR产物；11：以脱色希瓦氏菌S12-tpmD’-91基因组为模板，prometerEF，TpmDC4ER为引物扩增的PCR产物；12：以脱色希瓦氏菌S12基因组为模板，prometerEF，TpmDC4ER为引物扩增的PCR产物；M2：DNA Marker(DL2000)；

图3是米氏酮、DMAP、NADH的混合物为混合标样的HPLC的分析图；

图4是脱色希瓦氏菌S12-tpmD’-1对结晶紫的降解中间产物的HPLC的分析图；

图5是脱色希瓦氏菌S12-tpmD’-1对结晶紫的降解产物的HPLC的分析图；

图6是脱色希瓦氏菌S12-tpmD’-1菌体四半胱氨酸-双砷荧光标记显微镜照片(1000×)；

图7是脱色希瓦氏菌S12菌体四半胱氨酸-双砷荧光标记显微镜照片(1000×)；

具体实施方式：

本实施例是对本发明的进一步解释，不是对本发明的限制。

实施例1

(1)常规方法提取脱色希瓦氏菌S12和嗜水气单胞菌DN322的总DNA。

(2)脱色希瓦氏菌S12的NAD(P)H脱氢酶基因启动子序列Spr的获取。

根据Shewanella sp.ANA-3基因组序列数据，第0316阅读框的Promoter序列，设计引物：

上游引物：prometerEF：5’TTTTTCTTTTTTATGGGCTA 3’；

下游引物：prometerER：5’TTTAGACATAATCTGCTCCG 3’；

以脱色希瓦氏菌S12基因组DNA为模板，PCR扩增NAD(P)H脱氢酶基因的Promoter序列，命名为SNDPromoter(SPr)。

PCR反应条件为：95℃变性4min后进入30个循环：93℃变性30s，43℃退火30s，72℃延伸45s，最后延伸7min，扩增产物为98bp，电泳图见图1。

(3)修饰的tpmD基因片段tpmD’的获取

根据tpmD基因序列，设计上下游引物为：

tpmDEF：CACCTAAGAAGGAGATATACATCCCATGATGTCAATTGCGGTG

tpmDC4ER1：CTTGCAACAACCAGGGCAACATGCAGCCATTTTCAGGGCTTG

在上游引物5’端含有SD序列，下游引物含有可结合双砷荧光染料的两对半胱氨酸的编码序列(引物tpmDEF中斜体加下划线的为SD序列，引物TpmDC4ER1中斜体加下划线的为含编码CCPGCC的序列)。

PCR扩增体系总体积为(100μL)：超纯水73.5μL，10×PCR buffer 10μL，2.0mmol/L dNTP8μL，TpmDEF引物2μL，TpmDC4ER1引物2μL，1U/μL Taq酶2.5μL，菌株DN322的总DNA稀释50倍后取2μL，反应为30个循环，94℃预变性5min后进入30个循环：94℃变性45s，52℃退火45s，72℃延伸1min30s，最后72℃延伸10min。

回收扩增出来的919bp的产物，将其命名为tpmD’。

(4)SPr和tpmD’两片段的融合连接

设计引物Bridge：5’GCCCATAAAAAAGAAAAAGGGGGAGGTATTGAGAAG 3’，该引物与prometerEF和TpmDC4ER1进行三引物PCR扩增。

扩增体系总体积为(50μL)：超纯水35μL，10×PCR buffer 5μL(with MgCl₂)，10.0mmol/LdNTP 2μL，引物prometerEF和TpmDC4ER1的终浓度为20μM，而引物bridge1的终浓度则为50nM，10U pfu Taq酶，模板Promoter和tpmD’各1.0μL(100ng/μL)，PCR反应条件为94℃预变性5min后进入30个循环：94℃变性1min，52℃退火1.0min，72℃延伸2.0min，最后72℃延伸10min。

回收1017bp的PCR产物，将其命名为SPrtpmD’，其电泳图见图1。

将PCR反应扩增获得的融合基因片段SPrtpmD’克隆到pMD18 T simple载体中，转化大肠杆菌E coli DH5α，获得的阳性克隆抽提质粒委托上海生工生物工程技术有限公司测序，其序列如SEQ5所示，其中1-98位核苷酸是脱色希瓦氏菌S12的NAD(P)H脱氢酶基因Promoter序列SNDPromoter(SPr)；106-123位核苷酸为SD序列；127-987位核苷酸为tpmD基因阅读框终止密码子之前的序列；988-1014位核苷酸为编码CCPGCC的碱基序列；TGA为终止密码子，测序结果完全符合预期，命名为SPrtpmD’，并予以保存。

(5)EF383142A和EF383142B的获取

EF383142序列是根据希瓦氏菌属模式菌株Shewanella oneidensis MR-1全基因组序列中位于基因SO0500和SO0501间的一段1300bp不编码蛋白的基因间区序列设计引物，然后从S12中PCR扩增出来的，其全长为1012bp，其登陆号EF383142。其中EF383142A是EF383142上半部分的555bp的碱基，其序列如SEQ3所示，而EF383142B是EF383142的下半部分的441bp的碱基，其序列如SEQ4所示。

(a)EF383142A的获得：

设计引物：

EF383142AF：5’＞AACAACCGATAGCAAGC＜3’，；

EF383142AR：5’＞GGGGGAGGTATTGAGAAG＜3’；

以脱色希瓦氏菌S12基因组DNA为模板，EF383142AF，EF383142AR为引物PCR扩增EF383142A序列，扩增的555bp序列命名为EFA。PCR反应条件为：95℃预变性3min后进入30个循环：93℃变性1min，48℃退火45s，72℃延伸1min；最后延伸10min，电泳图见图1。

(b)EF383142B的获得：

设计引物：

EF383142BF：5＞GTTGGTAGCGGGTGTAAG＜3；

EF383142BR：5＞ATCAAAGTAATCGGCGGG＜3；

以脱色希瓦氏菌S12基因组DNA为模板，EF383142BF，EF383142BR为引物PCR扩增EF383142B序列，命名为EFB。PCR反应条件为：94℃预变性5min后进入30个循环：93℃变性1min，50℃退火45s，72℃延伸1min；最后延伸10min，电泳图见图1。

(6)EFASPrtpmD’EFB的构建。

prometerEF：5＞TTTTTCTTTTTTATGGGCTA＜3，

TpmDC4ER：5＞CTATTACTTGCAACAACCAGGGCAACATGCAGCCATTTTCAGGGC＜3；

根据EF383142A，SPrtpmD’，EF383142B序列，设计引物：

bridge1：5＞GCCCATAAAAAAGAAAAAGGGGGAGGTATTGAGAAG＜3；

bridge2：5＞CTTACACCCGCTACCAACTTACTTGCAACAACCAGGGCAAC＜3；

(a)EFASPrtpmD’的构建：

提取从步骤(4)获得的已转入SPrtpmD’片段的大肠杆菌Ecoli DH5α中的质粒。以质粒pSPrtpmD’为模板，prometerEF，TpmDC4ER为引物PCR扩增SPrtpmD’序列。PCR反应条件为：95℃预变性3min后进入30个循环：93℃变性1min，51℃退火60s，72℃延伸90s；最后延伸10min。

以EFA和SPrtpmD’为模板，EF383142AF，TpmDC4ER，bridge1为引物，进行三引物PCR扩增EFASPrtpmD’序列。PCR反应条件为：95℃预变性4min后进入30个循环：93℃变性1min，52℃退火60s，72℃延伸120s；最后延伸10min。

回收1572bp的EFASPrtpmD’序列。

(b)EFASPrtpmD’EFB的构建：

以EFASPrtpmD’和EFB为模板，EF383142AF，bridge2，EF383142BR为引物PCR扩增EFASPrtpmD’EFB序列。PCR反应条件为：95℃预变性4min后进入30个循环：93℃变性1min，52℃退火60s，72℃延伸120s；最后延伸10min。

将PCR反应扩增获得的1.9kb左右的重组片段EFASPrtpmD’EFB克隆到T载体pMD18 T simple vector中，转化大肠杆菌Ecoli DH5α，予以保存。获得的质粒测序验证完全符合预期，命名为pEFASPrtpmD’EFB。

(7)重组EFASPrtpmD’EFB片段的获得：

以质粒pEFASPrtpmD’EFB为模板，PCR扩增获得1.9kb左右重组片段EFASPrtpmD’EFB；引物为EF383142AF，EF383142BR，PCR反应条件为：95℃预变性4min后进入30个循环：93℃变性1min，52℃退火60s，72℃延伸120s；最后延伸10min，电泳图见图1。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后回收目标片段，回收产物使用超纯水溶解，调整浓度为1μg/μl。

(8)电击转化：

将由步骤(7)获得的重组DNA片段EFASPrtpmD’EFB加入到100μL S12片段电击转化入S12电转感受态细胞中，用加样器轻微吹打混匀DNA和细胞；快速加入到预冷的转化杯(1mm gap)中，60S后电击，注意电击杯应保持干燥，2400伏特电击转化。转化后的S12感受态细胞迅速转移到预热到30℃的800μl SOC培养基中，放于30℃摇床缓慢震荡培养(90rpm)2小时，然后取适量涂LB+Amp营养琼脂平板，30℃倒置培养过夜。

(9)重组子筛选和鉴定

用PCR制备的线状单操纵子片段EFASPrtpmD’EFB经电穿孔转化S12，重组的线形片段EFASPrtpmD’EFB进入到S12菌体以后，会发生同源重组。该线形片段虽然没有采用抗生素作为选择标记，但是可高效降解三苯基甲烷染料的特点为筛选提供了方便；在没有抗生素的选择压力下，所有的细胞都将获得生长，使菌体在平板上以单个菌落的形式生长。菌落长到1～2mm时，挑取单菌落接种于含100mg/L的三苯基甲烷类染料的LB培养基中检测脱色能力，初步筛选后，选取脱色能力强的克隆子，得到有脱色功能的S12重组子克隆；由于获得的重组子生长在密集的菌苔上，首要要将其纯化。先挑出重组子在平板上培养，然后在液体LB中培养，获得菌液经过稀释以后涂平板以获得纯化菌落。重复上述纯化步骤至获得一致形态菌落。经过4次连续纯化后仍对三苯基甲烷和偶氮染料高效脱色能力以及可荧光示踪的重组子，命名为脱色希瓦氏菌S12-tpmD’。

(10)重组子的验证

以筛选到的重组子-脱色希瓦氏菌S12-tpmD’的基因组DNA作为模板，分别使用引物对EF383142AF，EF383142BR和TpmDEF，TpmDC4ER1以及根据插入位点上下游设计验证引物(S.V.up：caagtcacggttgagaatg；S.V.down：gcctgaagacagtaataagca)用相应的PCR程序进行扩增，并对扩增产物进行电泳分析，以确认同源重组是否成功。

提取重组子的总DNA做为模板，分别扩增重组后的SPrtpmD’基因，用于同源重组的1.9kb左右的DNA序列以及根据插入位点上下游设计上下游验证引物S.V.up，S.V.down理论上可扩出2.5K左右的片段。理论上PCR可以检测到一个模板的存在，灵敏度不弱于southern blot。从图2PCR产物电泳图分析的结果显示在S12启动子控制下的tpmD’基因即EFASPrtpmD’EFB片段已经重组到脱色希瓦氏菌染色体上。

经过验证，本发明人获得了将片段EFASPrtpmD’EFB已整合进入脱色希瓦氏菌S12染色体DNA中的重组子，将这些细菌分别命名为脱色希瓦氏菌S12-tpmD’-1，S12-tpmD’-79，S12-tpmD’-91。

(11)基因工程菌染料脱色能力的测定。

(a)菌悬液的制备：经过纯化的脱色希瓦氏菌S12-tpmD’-1，S12-tpmD’1-79，S12-tpmD’-91菌株与供体菌株嗜水气单胞菌DN322及受体菌株脱色希瓦氏菌S12分别在LB培养基中培养过夜，取相同OD值的菌液于6000r/min下离心10min收集菌体，用PBS(pH＝8.0)洗菌体2次，重悬于PBS(pH＝8.0)中。

(b)脱色实验：将各菌悬液分别接种于30mL染料培养基中，30℃下静置培养。每隔1h取样测定上清的吸光值。

染料培养基

酵母抽提物        0.2g      KH₂PO₄         2.66g

NaCl              2.5g      (NH₄)₂SO₄      0.5g

Na₂HPO₄·7H2O     4.32g     H2O            200mL

121℃蒸汽灭菌20min，按需加入灭过菌染料贮备液。

(c)脱色率的测定：培养液用8000×g离心去除菌体，用紫外-可见分光光度计分别在各染料的最大吸收峰处测定各上清液的吸光值，并以不加菌的染料培养基为对照，按以下公式计算脱色率η。

η＝(A-B)/A×100％    (1)

式中，A为不加菌的染料培养上清液的吸光值，B为加菌的染料培养上清液的吸光值。

三苯基甲烷类染料脱色率测定结果见表1，2，3，4。

表1.3种细菌对结晶紫的脱色率

表2 3种细菌对孔雀石绿的脱色率

表3 3种细菌对灿烂绿的脱色率

表4 3种细菌对碱性品红的脱色率

由表1，2，3，4可以看出，工程菌株对三苯基甲烷染料脱色速率和脱色效率都明显高于野生型脱色希瓦氏菌S12，达到了野生型脱色希瓦氏菌DN322相似的水平。

对偶氮染料苋菜红脱色率测定结果见表5，

表5.3种细菌对偶氮染料苋菜红脱色率

由表5可以看出工程菌与野生型脱色希瓦氏菌S12对苋菜红的脱色速率与效率没有明显差别，说明插入序列对脱色希瓦氏菌S12没有造成影响。

由此可见本发明构建的工程菌对偶氮、蒽醌和三苯基甲烷类染料都具有脱色能力，其对上述三种染料的脱色能力与嗜水气单胞菌DN322对三苯基甲烷染料和脱色希瓦氏菌S12对偶氮和蒽醌类染料的的脱色能力相当。

(d)重组子结晶紫脱色产物HPLC分析

以甲醇∶水(90∶10)为流动相时，进样量为10μL，以米氏酮、DMAP、NADH的混合物为混合标样，对酶催化的脱色反应产物以及中间产物进行HPLC分析，结果如图3，4，5的所示。反应产物色谱图(图5)中的第三个峰与标样米氏酮的保留时间和光谱图一致，表明结晶紫脱色产物之一为四甲基米氏酮，这说明通过同源重组使S12中获得的三苯基甲烷染料脱色降解机理与DN322是一致的，脱色希瓦氏菌S12-tpmD’-79，S12-tpmD’-91结果同脱色希瓦氏菌S12-tpmD’-1。

(12)基因工程菌荧光示踪性的检测。

脱色希瓦氏菌S12-tpmD’菌株和脱色希瓦氏菌S12菌株于30℃，LB液体培养基分别振荡培养过夜，取1mL菌液离心收集菌体，将菌体重悬于约20μL的LB液体培养基中。取各菌悬液1～2μL接种至200μL含有5μM EDT和2μM ReAsH-EDT₂的LB液体培养基中，30℃避光振荡培养过夜；离心收集菌体，用1mL含有50μM的EDT的LB液体培养基重悬，避光旋转振荡约10min，再用1mL不含EDT的LB液体培养基洗涤，重悬菌体，取样显微镜镜检(激发波长：593nm，发射波长：608nm)。其菌体的四半胱氨酸-双砷标记显微镜照片见图6，7，由图6，7可以看出在黑背景下观察到脱色希瓦氏菌S12-tpmD’-1菌体发出红色荧光，而在同样条件下观察不到S12菌体发荧光，脱色希瓦氏菌S12-tpmD’-79，S12-tpmD’-91结果同脱色希瓦氏菌S12-tpmD’-1。

通过上述实验证明本发明构建的基因工程菌，对偶氮、蒽醌和三苯基甲烷类染料三大类染料都具有高效脱色能力，并且能发荧光。

序列表

<110>广东省微生物研究所

<120>荧光示踪多功能脱色的脱色希瓦氏工程菌及其构建方法

<160>7

<210>1

<211>864

<212>DNA

<213>嗜水气单胞菌DN322(Aeromonas hydrophila subsp.DN322)

<220>

<221>CDS

<400>1

ATGTCAATTG CGGTGACGGG TGGTACTGGT CCACTCGGTG GGCTTGTGAT TCAACATTTG  60

CTCAAAAAAG TTCCCGCCAG TCAAATCATT GCCATCGTGC GTAATGTTGA AAAAGCCTCT  120

ACTCTTGCCG ATCAAGGCGT GGAAGTTCGC CATGGCGACT ATAATCAACC GGAATCTCTT  180

CAAAAGGCTT TTGCAGGTGT CTCCAAGCTG CTCTTTATCT CAGGTCCGCA TTATGATAAT  240

ACGCTTCTTA TCGTTCAACA TGCAAATGTC GTAAAAGCTG CCAGAGATGC GGGAGTCAAA  300

CATATTGCTT ACACAGGATA TGCCTTTGCT GAGGAATCAA TAATTCCCCT TGCACACGTA  360

CATTTAGCAA CGGAATATGC CATCCGTACG ACCAATATCC CGTATACTTT CCTGCGTAAT  420

GCCTTATATA CGGACTTTTT TGTAAATGAG GGGCTGCGCG CATCCATAGA GTCTGGAGCA  480

ATTGTTACGA ATGCGGGAAG CGGGATCGTT AATTCAGTAA CACGCAATGA ACTTGCTTTG  540

GCTGCCGCAA CGGTTCTTAC AGAGGAAGGG CATGAAAACA AAACGTATAA CCTTGTTTCC  600

AATCAACCGT GGACCTTTGA TGAACTTGCC CAAATTCTCT CCGAGGTTTC CGGCAAAAAA  660

GTCGTGCATC AGCCTGTCTC ATTCGAAGAA GAGAAAAATT TCCTCGTAAA CGCTGGTGTC  720

CCTGAGCCGT TTGCTGAAAT TACGGCAGCG ATCTATGACG CGATTTCCAA AGGAGAAGCG  780

TCCAAAACAT CAGATGGTCT GCAAAAACTG ATCGGATCCT TGACCCCTCT GAAGGAAACC  840

GTAAAACAAG CCCTGAAAAT GTAA                                         864

<210>2

<211>98

<212>DNA

<213>脱色希瓦氏菌(Shewanella decolorationis)S12

<400>2

TTTTTCTTTT TTATGGGCTA ATAAACTAAG CCCATAGAGT CGAGAGCAAG TTGAAAGACT  60

CTCAAGAATT TCAATTTTCG GAGCAGATTA TGTCTAAA                          98

<210>3

<211>555

<212>DNA

<213>脱色希瓦氏菌(Shewanella decolorationis)S12

<400>3

AACAACCGAT AGCAAGCATT TAAGTTGTTG TTTAAATGGT TGCCAGGTAA TGCCAACTTG 60

GCACAGAGAG TTTCCCTTGG CTGGCAACGT TTACCCGTGC CCGTAATCGC GGTGTTGGAA 120

GGTTGCTGTT ATGGCGGTGG CATGCAAATC GCATTAGGTG CTGATTTTAG AATTGCAAGT 180

CCTGACAGTA AGTTATCTAT TATGGAAGCC AAATGGGGGC TAGTGCCGGA CATGGCTGGC 240

TTAGTGACGC TCAGGCAAAT TATGCCTAAG GATCAGGCGA TGTTACTCAG CCTTACGGCC 300

AAAGTCTTAT CGGGTGAAGA AGCTAAAAAC TTGGGATTAG TGACTCAGTT AAGTGATAAC 360

CCAATGTTAA GCGCGCAGCA ATTGGCCCAA GAGCTTCTCA ATACCTCCCC CGATGCCGCC 420

GCGGCGATTA AGTTGAGCAT CAACCGAAGT TGGACTGCGT CGATTCGTGC ACTGTTATGC 480

CGTGAGTCGT GGAGCCAAGT CAGACTGTTA CCCGGAAAAA ATCGTGTAGA AGGTAAGCTT 540

AAATTTTATC CGCTT                                                  555

<210>4

<211>441

<212>DNA

<213>脱色希瓦氏菌(Shewanella decolorationis)S12

<400>4

GTTGGTAGCG GGTGTAAGTT AGTTGGTTAG AAAGCCGTGG CAATGGATAG CTTAGGTTTA 60

TAAGGCTCAC ACCTTAATAG GCGCCGCTCA TGCGGGCGGC GAATCCTCTA ATGGCCGTTA 120

AACAATTCTG CCATGCACTC TCGTTATCCA GATTTAACGC CAATGTCGTT TGCCGATAAT 180

TCGGCGCTTC TAAGGTCACC GCGAGAGTTT TGCGTTGTGC AGCTGTTTCT ATCGATGCAG 240

GATGGCCATC GGGTGATTGA ATATCGAGTA TCGGCATAGT GAGCTTGGCC AGCTTTTCGG 300

CGATGGCTTG ATTACGTGTC TCATCTTCGC TGTAGGGATT GATGACAATC AATACATCTG 360

GATCGGCAAT TTTGTTTTGG CTTAATAGGC TTATCAACAA TCCCGCACTT TGATCTGCAG 420

TGATCAACAC CTCCGTTTAA T                                           441

<210>5

<211>1017

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

TTTTTCTTTT TTATGGGCTA ATAAACTAAG CCCATAGAGT CGAGAGCAAG TTGAAAGACT 60

CTCAAGAATT TCAATTTTCG GAGCAGATTA TGTCTAAACA CCTAAGAAGG AGATATACAT 120

CCCATGATGT CAATTGCGGT GACAGGTGCT ACTGGTCCAC TCGGTGGGCT TGTGATTCAA 180

CATTTGCTCA AAAAAGTTCC CGCCAGTCAA ATCATTGCCA TCGTGCGTAA TGTTGAAAAA 240

GCCTCTACTC TTGCCGATCA AGGCGTGGAA GTTCGCCATG GCGACTATAA TCAACCGGAA 300

TCTCTTCAAA AGGCTTTTGC AGGTGTCTCC AAGCTGCTCT TCATCTCAGG TCCGCATTAT 360

GATAATACGC TTCTTATCGT TCAACATGCA AATGTCGTAA AAGCTGCCAG AGATGCGGGA 420

GTCAAACATA TTGCTCACAC AGGATATGCC TTTGCTGAGG AATCAATAAT TCCCCTTGCA 480

CACGTACATT TAGCAACGGA ATATGCCATC CGTACGACCA ATATCCCGTA TACTTTCCTG 540

CGTAATGCCT TATATACGGA CTTTTTTGTA AATGAGGGGC TGCGCGCATC CATAGAGTCT 600

GGAGCTATTG TTACGAATGC GGGAAGCGGG ATCGTTAATT CAGTAACACG CAATGAACTT 660

GCTTTGGCTG CCGCAACGGT TCTTACAGAG GAAGGGCATG AAAACAAAAC GTATAACCTT 720

GTTTCCAATC AACCGTGGAC CTTTGATGAA CTTGCCCAAA TTCTCTCCGA GGTTTCCGGC 780

AAAAAAGTCG TGCATCAGCC TGTCTCATTC GAAGGAGAGA AAAATTTCCT CGTAAACGCT 840

AGTGTCCCTG AGCCGTTTGC TGAAATTACG GCAGCGATCT ATGACGCAAT TTCCAAAGGA 900

GAAGCGTCCA AAACATCAGA TGATCTGCAA AAACTGATCG GATCCTTGAC CCCTCTGAAG 960

GAAACCGTAA AACAAGCCCT GAAAATGGCT GCATGTTGCC CTGGTTGTTG CAAGTAA    1017

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

GCTGCATGTT GCCCTGGTTG TTGCAAG                                     27

<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

GAAGGAGATA TACATCCC                                               18

Claims (5)

1.一种荧光示踪多功能脱色的脱色希瓦氏工程菌，其特征在于所述的工程菌是将外源基因整合进入染色体中，所述的外源基因是融合基因SPrtpmD’，所述的融合基因SPrtpmD’是在脱色希瓦氏菌(Shewanella decolorationis)S12的NAD(P)H脱氢酶基因启动子序列SPr之后连接三苯基甲烷染料脱色酶修饰基因tpmD’构成，所述的三苯基甲烷染料脱色酶修饰基因tpmD’，是在三苯基甲烷染料脱色酶基因tpmD的5’端起始密码子ATG前加有SD序列，在3’端终止密码子之前加有能螯合双砷荧光染料的编码6个氨基酸CCPGCC的小标签，所述的tpmD序列如SEQ1所示，所述的NAD(P)H脱氢酶基因启动子序列如SEQ2所示，所述的SD序列如SEQ7所示，所述的螯合双砷荧光染料编码CCPGCC六个氨基酸的碱基序列如SEQ6所示，所述的工程菌能分泌能螯合双砷荧光染料的三苯基甲烷染料脱色酶。

2.如权利要求1所述的脱色希瓦氏工程菌的构建方法，其特征在于包括下列步骤：

a)tpmD’序列的获取：应用PCR技术，以嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila subsp)DN322的DNA为模板，扩增出三苯基甲烷染料脱色酶基因tpmD，在其5’端的起始密码子前加有SD序列，在其在3’端终止密码子之前加螯合双砷荧光染料的编码CCPGCC六个氨基酸的碱基序列，将此序列命名为tpmD’；

b)脱色希瓦氏菌S12的NAD(P)H脱氢酶基因启动子SPr的获取：以脱色希瓦氏菌S12基因组DNA为模板PCR扩增NAD(P)H脱氢酶基因的启动子序列；

c)片段EFA的获取：以脱色希瓦氏菌S12基因组DNA为模板，PCR扩增而得片段EFA，该片段的序列如SEQ3所示；

d)片段EFB的获取：以脱色希瓦氏菌S12基因组DNA为模板，PCR扩增而得片段EFB，该片段的序列如SEQ4所示；

e)SPrtpmD’的构建：利用TP-PCR技术，在tpmD’序列5’端前加脱色希瓦氏菌S12的NAD(P)H脱氢酶基因启动子SPr，从而构建成SPrtpmD’；

f)EFASPrtpmD’的构建：利用TP-PCR技术，在SPrtpmD’的5’端前加片段EFA而构建成；

g)EFASPrtpmD’EFB的构建，利用TP-PCR技术，在EFA SPrtpmD’的3’端加片段EFB；

h)将构建好的EFASPrtpmD’EFB电击转化到脱色希瓦氏菌S12中；

i)利用同源重组使EFASPrtpmD’EFB整合到脱色希瓦氏菌S12基因组染色体；

j)通过序列筛选，脱色能力筛选，荧光筛选，获得脱色希瓦氏菌S12基因工程菌。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于所述的序列筛选是通过以脱色希瓦氏菌S12基因工程菌的基因组DNA为模板PCR扩增EFASPrtpmD’EFB，SPrtpmD’，tpmD’片段测定分析的，选取能扩增出EFASPrtpmD’EFB，SPrtpmD’，tpmD’片段为目的菌株。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于所述的脱色能力筛选是通过将脱色希瓦氏菌S12基因工程菌对偶氮、蒽醌和三苯基甲烷类染料进行脱色能力鉴定，选取对偶氮、蒽醌和三苯基甲烷类染料具有脱色作用的为目的菌株。

5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于所述的荧光筛选是通过荧光显微镜对脱色希瓦氏菌S12基因工程菌进行分析的，选取具有荧光四半胱氨酸-双砷标记的菌株为目的菌株。

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