CN113462688A

CN113462688A - 一种蓝光调节启动子、蓝光调节启动子的融合基因、蓝光介导调节质粒及构建方法和应用

Info

Publication number: CN113462688A
Application number: CN202110731798.7A
Authority: CN
Inventors: 张后今; 闫云君; 王志乾; 龚梦瑶; 韩娟; 张婷
Original assignee: Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2021-06-30
Filing date: 2021-06-30
Publication date: 2021-10-01
Anticipated expiration: 2041-06-30
Also published as: CN113462688B

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种蓝光调节启动子、蓝光调节启动子的融合基因、蓝光介导调节质粒及构建方法和应用。本发明提供了一种蓝光调节启动子PC120‑CYC。本发明利用基于此合成的融合基因和蓝光介导调节质粒验证了蓝光诱导调节方式在解脂耶氏酵母的基因表达与调控过程中的可行性。本发明提供的蓝光介导调节质粒非常简洁紧凑，还能够在解脂耶氏酵母单细胞水平上被蓝光诱导。蓝光介导调节质粒的应用中，无毒无害、响应快速、操作简便、可逆性好，能够有效推动解脂耶氏酵母在食品、医药、农产品加工等领域的广泛应用。

Description

一种蓝光调节启动子、蓝光调节启动子的融合基因、蓝光介导调节质粒及构建方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种蓝光调节启动子、蓝光调节启动子的融合基因、蓝光介导调节质粒及构建方法和应用。

背景技术

光作为外界环境中的一个重要因子，为地球上所有的生命物质提供能量，而在一些光敏反应过程中，光可以作为调节信号来实现结构和功能的改变。光遗传学正是研究光敏蛋白和基因回路的新兴方向，其致力于通过光学和遗传技术来实现基因的精确调控和表达。

光-氧-电压(Light-Oxygen-Voltage，LOV)域作为植物和细菌中常见的光传感模块，其具备蓝光依赖的调节作用，从而实现了蓝光调节酶和DNA结合等各种效应子的活性。LOV也可以经工程化设计和研究后作为多种外源靶标从而实现光调节与基因表达的耦联。来源于山葡萄红杆菌(Erythrobacter litoralis)的EL222光敏蛋白，其N端的LOV域能够根据外界蓝光的状态可逆地在内部黄素单核苷酸(FMN)和周围蛋白质之间形成光化学加合物，从而影响C端的螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix，HTH)DNA结合域的相对位置，并以此实现蓝光来触发影响输出活性的构象变化的效果。目前，EL222蛋白已初步在大肠杆菌及酿酒酵母中得到验证，但尚未在解脂耶氏酵母中报道其适用性。

随着对酵母这一真核生物研究的不断深入，常规酵母的发展潜力显得捉襟见肘，而解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)作为一种非常规酵母，被认证为Generallyrecognized as safe(GRAS)安全型非常规酵母。由于其广泛的碳源适用性、更接近于高等生物的蛋白质修饰、加工及分泌模式、新颖的代谢途径及调节方式受到了日益增长的关注。解脂耶氏酵母启动子的研究目前已有的报道尚处于传统的外源性化学诱导剂调节方式，但存在着非特异性、毒性、转运延迟及多效性等缺陷，不利于其在工业生产及社会生活中的应用。为了突破传统化学诱导剂的限制，迫切需要一种低毒性、易操纵、易获取、高时空分辨率的调节方式。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种蓝光调节启动子、蓝光调节启动子的融合基因、蓝光介导调节质粒及构建方法和应用。本发明提供的启动子及基于所述启动子得到的质粒能够在解脂耶氏酵母中快速、精准的实现对目的基因的蓝光诱导表达；同时由于诱导因素为蓝光，因此本发明涉及的调节方式具有低毒无害的优势。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了一种蓝光调节启动子PC120-CYC，所述蓝光调节启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种含上述启动子的融合基因，所述融合基因包括上述蓝光调节启动子PC120-CYC、待表达基因和终止子；所述报道基因包括报道基因和/或目的基因。

优选的，当所述待表达基因包括GFP时，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明提供了一种能够识别和结合上述蓝光调节启动子PC120-CYC的蓝光蛋白SV40-VP-EL，所述蓝光蛋白SV40-VP-EL的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了一种在真核生物中蓝光诱导表达蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括能够表达上述蓝光调节启动子PC120-CYC和上述蓝光蛋白SV40-VP-EL。

本发明提供了蓝光介导调节质粒，所述质粒包括上述融合基因和编码上述蓝光蛋白SV40-VP-EL的基因。

本发明还提供了上述蓝光介导调节质粒的构建方法，所述构建方法包括：

以pINA1296质粒为骨架载体，将编码蓝光蛋白SV40-VP-EL的基因替换pINA1296质粒hp4dpromoter和xpr2 terminator之间的序列，得到质粒phSVEx；

得到质粒phSVEx后，将融合基因插入质粒phSVEx的hp4dpromoter上游得到蓝光介导调节质粒。

本发明提供了上述蓝光调节启动子PC120-CYC或上述融合基因和/或上述蓝光蛋白SV40-VP-EL或上述试剂盒或上述蓝光介导调节质粒或上述构建方法构建得到的蓝光介导调节质粒在真核生物蓝光诱导表达蛋白中的应用。

本发明提供了上述蓝光调节启动子PC120-CYC或上述融合基因和/或上述蓝光蛋白SV40-VP-EL或上述试剂盒或上述蓝光介导调节质粒或上述构建方法构建得到的蓝光介导调节质粒在解脂耶氏酵母蓝光诱导表达蛋白中的应用。

本发明提供了一种蓝光调节启动子PC120-CYC，所述蓝光调节启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明利用蓝光调节启动子PC120-CYC及基于此合成的融合基因和蓝光介导调节质粒验证了蓝光诱导调节方式在解脂耶氏酵母的基因表达与调控过程中的可行性。本发明提供的蓝光介导调节质粒非常简洁紧凑，还能够在解脂耶氏酵母单细胞水平上被蓝光诱导。蓝光介导调节质粒的应用中，无毒无害、响应快速、操作简便、可逆性好，能够有效推动解脂耶氏酵母在食品、医药、农产品加工等领域的广泛应用。

本发明还提供了蓝光介导调节质粒，该蓝光介导调节质粒有助于快速可靠地将光调节工具集成到各种真菌宿主中，从而扩展合成生物学工具箱。

附图说明

图1为蓝光介导调节质粒的机制示意图。

图2为蓝光介导调节质粒phSVExPCGx(pINA1296-hp4d-SV40-VP-EL-xpr2-PC120-CYC-GFP-xpr2)的示意图；

图3为蓝光介导调节质粒phSVExPCGx转化的解脂耶氏酵母在MD平板上的克隆；

图4为解脂耶氏酵母蓝光调节工程菌基因组PCR验证阳性克隆；

图5为解脂耶氏酵母蓝光调节工程菌分别在蓝光条件和黑暗条件下诱导12h后的MD平板；其中图左为蓝光条件下的实验组，图右为黑暗条件下的对照组；

图6为解脂耶氏酵母蓝光调节工程菌分别在蓝光条件和黑暗条件下诱导培养后，进行流式细胞术分析后所得出的荧光强度与诱导时间的关系；

图7为解脂耶氏酵母蓝光调节工程菌分别在蓝光条件和黑暗条件下诱导培养，进行流式细胞术分析后所得出的荧光强度与诱导时间的关系；

图8为解脂耶氏酵母蓝光调节工程菌在蓝光诱导期间，每小时所取样品的荧光强度平均值的趋势图。

具体实施方式

本发明提供了一种蓝光调节启动子PC120-CYC，所述蓝光调节启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的蓝光调节启动子PC120-CYC能够被蓝光蛋白SV40-VP-EL识别并结合，从而实现快速、精准的蓝光诱导表达目的基因。

本发明还提供了一种含有上述启动子的融合基因，所述融合基因包括上述蓝光调节启动子PC120-CYC、待表达基因和终止子；所述待表达基因包括报道基因和/或目的基因；所述终止子优选为解脂耶氏酵母xpr2终止子。在本发明中，当所述报道基因优选包括GFP时，且终止子优选为解脂耶氏酵母xpr2终止子时，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明提供了一种能够识别和结合上述蓝光调节启动子PC120-CYC的蓝光蛋白SV40-VP-EL，所述蓝光蛋白SV40-VP-EL的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。在本发明的实施例中，所述蓝光蛋白SV40-VP-EL中的SV40为核定位信号SV40，VP为转录激活域VP16，EL为蓝光响应蛋白EL222；所述编码蓝光蛋白SV40-VP-EL的基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种在真核生物中蓝光诱导表达蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括能够表达上述蓝光调节启动子PC120-CYC和上述蓝光蛋白SV40-VP-EL的试剂。

本发明提供了蓝光介导调节质粒，所述质粒包括上述融合基因和编码上述蓝光蛋白SV40-VP-EL的基因。本发明提供的蓝光介导调节质粒的机制示意图如图1所示；蓝光介导调节质粒的结构示意图如图2所示。本发明提供的蓝光介导调节质粒能够转录翻译得到蓝光蛋白SV40-VP-EL，在蓝光照射下，蓝光蛋白SV40-VP-EL中的光敏蛋白EL222的N端(光氧化调控域)与C端(螺旋-转角-螺旋DNA结合域)相互作用，使EL222二聚并与启动子PC120-CYC结合，开启含融合基因的转录，从而获得解脂耶氏酵母蓝光诱导表达蛋白的技术效果。

在本发明中，所述融合蛋白和编码蓝光蛋白SV40-VP-EL的基因与骨架载体链接的方式优选为GibsonAssembly。本发明对具体的组装方式不作限定，提供的构建蓝光介导调节质粒的方法简单易操作。

本发明提供了上述蓝光调节启动子PC120-CYC或上述融合基因和/或上述蓝光蛋白SV40-VP-EL或上述试剂盒或上述蓝光介导调节质粒或上述构建方法构建得到的蓝光介导调节质粒在解脂耶氏酵母蓝光诱导表达蛋白中的应用。在本发明中，所述解脂耶氏酵母优选为解脂耶氏酵母Po1g。本发明通过将蓝光介导调节质粒转化导入解脂耶氏酵母中，实现了对目的基因的蓝光诱导表达，拓展了解脂耶氏酵母表达调控的方式方法，推动了解脂耶氏酵母在食品、医药、农产品加工等领域的广泛应用。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种蓝光调节启动子、蓝光调节启动子的融合基因、蓝光介导调节质粒及构建方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

对基因序列进行优化

1、融合基因由蓝光调节启动子PC120-CYC、绿色荧光蛋白GFP和解脂耶氏酵母xpr2终止子构成，核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2、将NCBI中检索到的VP16及EL222基因序列和蛋白序列，按照解脂耶氏酵母密码子偏好性进行优化，重新合成DNA序列。

具体的优化方法为：根据基因合成公司金斯瑞密码子优化软件OptimumGene^TM对基因进行优化，主要参考解脂耶氏酵母的密码子偏好性，再结合过滤元件及平衡基因GC含量最终完成对基因密码子的优化，得到融合基因SV40-VP-EL的核酸序列，如SEQ ID NO.4所示，融合基因SV40-VP-EL中，SV40表示核定位信号SV40，VP表示转录激活域VP16，EL表示蓝光响应蛋白EL222。

实施例2

构建蓝光介导调节质粒phSVExPCGx

以质粒pINA1296为骨架载体，设计并构建了蓝光介导调节质粒phSVExPCGx。

具体的构建方法为：

将实施例1中优化获得的融合基因SV40-VP-EL基因序列进行全合成，然后使用Gibson assembly技术将pINA1296质粒hp4d promoter和xpr2 terminator之间的序列替换为融合基因SV40-VP-EL，得到质粒phSVEx；

将实施例1中优化获得的融合基因的基因序列进行全合成，然后使用Gibsonassembly技术，将融合基因插入质粒phSVEx中的hp4dpromoter的上游，得到蓝光介导调节质粒phSVExPCGx，该实施例中，合成得到的携带有报道基因GFP的蓝光介导调节质粒。构建得到的蓝光介导调节质粒phSVExPCGx如图2所示，图2中，LEU是解脂耶氏酵母酵母整合位点及筛选标记；AmpR是抗生素抗性；ori是复制起始位点；hp4d是解脂耶氏酵母hp4d启动子；SV40是核定位信号；VP16是转录激活域；EL222是蓝光响应蛋白；xpr2 terminator是解脂耶氏酵母xpr2终止子；PC120-CYC是蓝光调节启动子；GFP是绿色荧光蛋白。

实施例3

对蓝光介导调节质粒phSVExPCGx进行转化、诱导表达与分析

(1)质粒的提取与定量检测

1)取10mL菌体过夜培养物，13400g离心1min弃上清液收沉淀。

2)依次加入500μL溶液Ⅰ，溶液Ⅱ及溶液Ⅲ，立即温和地上下翻转6～8次后静置5min，13400g离心10min。

其中溶液Ⅰ的组成为25mM Tris-HCl(pH＝8.0)，10mM EDTA，50mM葡萄糖；

溶液Ⅱ的组成为250mMNaOH，1％(W/V)SDS；

溶液Ⅲ的组成为3M醋酸钾，5M醋酸。

3)将上一步收集的上清液加入过滤柱中，13400g离心1min后加入450μL异丙醇混合均匀。而后加入吸附柱中，13400g离心1min后弃去废液。

4)将700μL漂洗液加入吸附柱中，13400g离心1min后弃去废液。

5)吸附柱除净漂洗液后，向吸附膜中央滴加150μL的去离子水，静置2min后13400g离心2min。

6)收集管内液体并测定质粒phSVExPCGx浓度，-20℃保存备用。

(2)质粒phSVExPCGx的线性化和回收

1)向样品中加入1/10体积的3M乙酸钠溶液和2.5倍体积的无水乙醇混匀，于-20℃放置1h。而后12000rpm离心10min，弃上清。

2)2.5倍体积的预冷75％乙醇重悬沉淀，12000rpm离心10min，弃上清。并置于超净工作台吹15min，获得线性化的phSVExPCGx质粒。

3)向管底滴加25μL的去离子水重悬，并测定质粒浓度，-20℃保存备用。

(3)解脂耶氏酵母Po1g的锂转化

1)取在YPD液体培养基中培养15h的解脂耶氏酵母Po1g菌液在YPD固体培养基上划线，28℃过夜培养。

2)挑取平板上挑取相当于50～100μL体积的菌落重悬在1mLTE缓冲液中，4℃，8000rpm离心1min，弃去上清液。

3)细胞重悬于600μL 0.1M LiAc(pH 6.0)缓冲液中，28℃水浴1h后3,000rpm离心2min，弃上清，细胞轻柔的重悬在100μL 0.1M LiAc中。

4)取35μL细胞悬液，加入预先按1:1(v/v)混匀的线性化的phSVExPCGx质粒及鲑鱼精DNA共10μL，轻柔混匀，28℃水浴10min，作为转化体系。

5)配制转化复育体系，如表1所示：

表1转化复育体系

上述体系现配现用，轻柔吹打混匀后28℃水浴1h。

6)复育体系在39℃中水浴热激10min。然后加600μL 0.1M LiAc，8000rpm离心30s，弃去800μL上清后重悬，涂布于MD平板上。

解脂耶氏酵母转化结果见图3，图3为转化效果的照片，下文中后续挑取的用于验证和表征的单菌落均随机挑选于图3的平板上。

(4)解脂耶氏酵母转化子的诱导表达与荧光强度定性分析

1)随机挑取转化出的解脂耶氏酵母转化子至接种于5mL MD液体培养基中28℃摇床培养20h。首先提取解脂耶氏酵母转化子的基因组，然后将提取得到的基因组作为模板，设计蓝光介导调节质粒phSVExPCGx上的片段作为引物SEQ ID NO.5～8进行PCR扩增，获得阳性菌株(含蓝光介导调节质粒phSVExPCGx基因的菌株)。本发明PCR所用引物见表2，其中C120-F和conls-R用于扩增hp4d-SV40-VP-EL-xpr2部分，conls-F和xpr2-R用于扩增PC120-CYC-GFP-xpr2部分，C120-F和xpr2-R用于扩增hp4d-SV40-VP-EL-xpr2-PC120-CYC-GFP-xpr2部分。

表2 PCR引物

PCR扩增结果见图4，由图4可知，上述进行挑取培养的酵母转化子中含有目的质粒(蓝光介导调节质粒phSVExPCGx)。

2)根据PCR检测结果，选取3～5个阳性克隆划线于MD培养基上，先于28℃黑暗环境下培养24h后再对阳性克隆实验组进行蓝光诱导孵育。

蓝光诱导24h后，将实验组与对照组(于黑暗条件下培养的经过转化的解脂耶氏酵母)置于475nm的激发光下进行荧光强度的定性比较，对比效果见图5。

由图5可知，经蓝光诱导后的实验组菌株在475nm的激发光下发绿色荧光，表明通过蓝光诱导后的解脂耶氏酵母细胞内转录翻译得到了绿色荧光蛋白，PC120-CYC启动子可以成功识别并结合蓝光蛋白SV40-VP-EL，精准开启报道基因的转录翻译。

(5)解脂耶氏酵母转化子的流式细胞术分析

根据步骤(4)中PCR的检测结果，选取3～4个阳性克隆，各取50～100μL培养液转接至50mLMD液体培养基中，于28℃的黑暗环境下，摇床培养至菌体OD_600nm达到0.8～1.2后进行蓝光诱导表达，即为实验组。蓝光诱导每隔1h对实验组和对照组(于黑暗条件下培养的经过转化的解脂耶氏酵母)进行取样，共诱导10h。

对所取样品进行预处理以便进行流式细胞术分析，具体操作为：样品菌液在4℃下以5000rpm离心1min，弃上清后用PBS重悬并稀释至肉眼不可见的状态，取适当体积的样品稀释液通过300目的滤网过滤后存于流式分析管中以备进行流式细胞术分析。

对实验组及对照组的样品进行流式细胞术分析后所得出的荧光强度与诱导时间的关系如表3及图6～图8所示；

图6中，(A)为蓝光诱导1h后实验组Full Light与对照组Full Dark的荧光强度；(B)为蓝光诱导4h后实验组Full Light与对照组Full Dark的荧光强度；

图7中，(C)为蓝光诱导8h后实验组Full Light与对照组Full Dark的荧光强度；(D)为蓝光诱导10h后实验组Full Light与对照组Full Dark的荧光强度；

图8中，(E)为实验组Full Light与对照组Full Dark在蓝光诱导期间每小时所取样品的荧光强度平均值的趋势图。

表3荧光强度与诱导时间的关系

由表3和图6～图8可知，在蓝光持续诱导10h的这一过程中，实验组的GFP荧光强度保持着极强的荧光激活状态，而处于黑暗环境下的对照组一直保持着极低的荧光强度。在诱导8h后，实验组的GFP强度达到最高，约为同时期对照组荧光强度的42倍，说明本发明设计的蓝光诱导系统具有优异的诱导效果。图6和图7中呈现出单一且集中的峰，说明蓝光可对携带有phSVExPCGx质粒的解脂耶氏酵母实现均匀的诱导效应。并且图6和图7中，实验组和对照组的交叉重叠部分极少，说明诱导强度较为良好。

整体而言，该流式细胞术结果说明本发明提供的蓝光介导调节质粒phSVExPCGx能够有效实现解脂耶氏酵母细胞对蓝光高效均一的响应。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 华中科技大学

<120> 一种蓝光调节启动子、蓝光调节启动子的融合基因、蓝光介导调节质粒及构建方法和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 240

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

taggtagcct ttagtccatg cgttataggt agcctttagt ccatgcgtta taggtagcct 60

ttagtccatg cgttataggt agcctttagt ccatgcgtta taggtagcct ttagtccatg 120

aagcttgcat gtgctctgta tgtatataaa actcttgttt tcttcttttc tctaaatatt 180

ctttccttat acattaggac ctttgcagca taaattacta tacttctacc cgccgccacc 240

<210> 2

<211> 1376

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taggtagcct ttagtccatg cgttataggt agcctttagt ccatgcgtta taggtagcct 60

ttagtccatg cgttataggt agcctttagt ccatgcgtta taggtagcct ttagtccatg 120

aagcttgcat gtgctctgta tgtatataaa actcttgttt tcttcttttc tctaaatatt 180

ctttccttat acattaggac ctttgcagca taaattacta tacttctacc cgccgccacc 240

atgcgaaagg gagaggagct gttcaccggt gtggtcccca tcctggtgga gctggacgga 300

gacgtcaacg gtcacaagtt ctctgtctcc ggagagggag agggtgacgc tacctacggc 360

aagctgaccc tgaagttcat ttgtaccacc ggaaagctgc ctgtgccctg gcctaccctg 420

gtcaccacct tcggctacgg agtccagtgc ttcgcccgat accccgacca catgaagcag 480

cacgacttct tcaagtccgc tatgcccgag ggatacgtgc aggagcgaac catcttcttc 540

aaggacgacg gtaactacaa gacccgagct gaggtgaagt tcgagggtga caccctggtc 600

aaccgaatcg agctgaaggg cattgacttc aaggaagacg gcaacattct gggacacaag 660

ctggagtaca actacaactc ccacaacgtg tacatcatgg ccgacaagca gaagaacgga 720

attaaggtca acttcaagat ccgacacaac attgaggacg gctctgtgca gctggctgac 780

cactaccagc agaacacccc tattggtgac ggtcctgtgc tgctgcctga caaccactac 840

ctgtctaccc agtccgccct gtctaaggac cccaacgaga agcgagatca catggtgctg 900

ctggagttcg tcaccgccgc tggtattacc cacggcatgg acgagctgta caagtaatcc 960

atggcctgtc cccacgttgc cggtcttgcc tcctactacc tgtccatcaa tgacgaggtt 1020

ctcacccctg cccaggtcga ggctcttatt actgagtcca acaccggtgt tcttcccacc 1080

accaacctca agggctctcc caacgctgtt gcctacaacg gtgttggcat ttaggcaatt 1140

aacagatagt ttgccggtga taattctctt aacctcccac actcctttga cataacgatt 1200

tatgtaacga aactgaaatt tgaccagata ttgttgtaaa tagaaaatct ggcttgtagg 1260

tggcaaaatg cggcgtcttt gttcatcaat tccctctgtg actactcgtc atccctttat 1320

gttcgactgt cgtatttctt attttccata catatgcaag tgagatgccc gtgtcc 1376

<210> 3

<211> 295

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu

1 5 10 15

Gly Asp Glu Leu His Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala

20 25 30

Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser

35 40 45

Pro Gly Pro Gly Phe Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu

50 55 60

Asp Met Ala Asp Phe Glu Phe Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly

65 70 75 80

Ile Asp Glu Tyr Gly Gly Gly Ala Asp Asp Thr Arg Val Glu Val Gln

85 90 95

Pro Pro Ala Gln Trp Val Leu Asp Leu Ile Glu Ala Ser Pro Ile Ala

100 105 110

Ser Val Val Ser Asp Pro Arg Leu Ala Asp Asn Pro Leu Ile Ala Ile

115 120 125

Asn Gln Ala Phe Thr Asp Leu Thr Gly Tyr Ser Glu Glu Glu Cys Val

130 135 140

Gly Arg Asn Cys Arg Phe Leu Ala Gly Ser Gly Thr Glu Pro Trp Leu

145 150 155 160

Thr Asp Lys Ile Arg Gln Gly Val Arg Glu His Lys Pro Val Leu Val

165 170 175

Glu Ile Leu Asn Tyr Lys Lys Asp Gly Thr Pro Phe Arg Asn Ala Val

180 185 190

Leu Val Ala Pro Ile Tyr Asp Asp Asp Asp Glu Leu Leu Tyr Phe Leu

195 200 205

Gly Ser Gln Val Glu Val Asp Asp Asp Gln Pro Asn Met Gly Met Ala

210 215 220

Arg Arg Glu Arg Ala Ala Glu Met Leu Arg Thr Leu Ser Pro Arg Gln

225 230 235 240

Leu Glu Val Thr Thr Leu Val Ala Ser Gly Leu Arg Asn Lys Glu Val

245 250 255

Ala Ala Arg Leu Gly Leu Ser Glu Lys Thr Val Lys Met His Arg Gly

260 265 270

Leu Val Met Glu Lys Leu Asn Leu Lys Thr Ser Ala Asp Leu Val Arg

275 280 285

Ile Ala Val Glu Ala Gly Ile

290 295

<210> 4

<211> 888

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgcccaaga agaagcgaaa ggtggcccct cccaccgacg tctctctggg cgacgagctg 60

cacctggacg gagaggacgt ggccatggct cacgccgacg ctctggacga cttcgacctg 120

gacatgctgg gagacggaga ctctcctggt cctggtttca cccctcacga ctctgctcct 180

tacggtgctc tggacatggc tgacttcgag ttcgagcaga tgttcaccga cgctctggga 240

atcgacgagt acggcggagg tgccgacgac acccgagtgg aggtccagcc tcccgctcag 300

tgggtcctgg acctgatcga ggcttccccc attgcctctg tggtgtctga ccctcgactg 360

gctgacaacc ctctgatcgc tattaaccag gccttcaccg acctgaccgg ttactctgag 420

gaagagtgtg tgggccgaaa ctgccgattc ctggctggat ccggtaccga gccctggctg 480

accgacaaga tccgacaggg tgtccgagag cacaagcccg tgctggtcga gattctgaac 540

tacaagaagg acggaacccc cttccgaaac gctgtgctgg tcgcccccat ttacgacgac 600

gacgacgagc tgctgtactt cctgggatct caggtggagg tcgacgacga ccagcccaac 660

atgggtatgg ctcgacgaga gcgagccgct gagatgctgc gaaccctgtc tccccgacag 720

ctcgaggtga ccaccctggt ggcttctgga ctgcgaaaca aggaagtggc cgctcgactg 780

ggtctgtctg agaagaccgt gaagatgcac cgaggcctgg tcatggagaa gctgaacctg 840

aagacctctg ctgacctggt gcgaattgct gtggaggctg gcatttag 888

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggaatggtaa gcttctagag gtacc 25

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccaggaccat ctgaatcatg c 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcatgattca gatggtcctg g 21

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

caaacatgag aattcggaca cgg 23

Claims

1.一种蓝光调节启动子PC120-CYC，其特征在于，所述蓝光调节启动子PC120-CYC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.含权利要求1所述的启动子PC120-CYC的融合基因，其特征在于，所述融合基因包括权利要求1所述的蓝光调节启动子PC120-CYC、待表达基因和终止子；所述待表达基因包括报道基因和/或目的基因。

3.根据权利要求2所述的融合基因，其特征在于，当所述报道基因包括GFP时，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种能够识别和结合权利要求1所述蓝光调节启动子PC120-CYC的蓝光蛋白SV40-VP-EL，其特征在于，所述蓝光蛋白SV40-VP-EL的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.一种在真核生物中蓝光诱导表达蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括能够表达权利要求1所述的蓝光调节启动子PC120-CYC和权利要求4所述的蓝光蛋白SV40-VP-EL的试剂。

6.蓝光介导调节质粒，其特征在于，所述质粒包括权利要求2或3所述的融合基因和编码权利要求4所述的蓝光蛋白SV40-VP-EL的基因。

7.权利要求6所述的蓝光介导调节质粒的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：

以pINA1296质粒为骨架载体，将编码蓝光蛋白SV40-VP-EL的基因替换pINA1296质粒hp4d promoter和xpr2 terminator之间的序列，得到质粒phSVEx；

得到质粒phSVEx后，将融合基因插入质粒phSVEx的hp4d promoter上游得到蓝光介导调节质粒。

8.权利要求1所述的蓝光调节启动子PC120-CYC或权利要求2或3所述的融合基因或权利要求4所述的蓝光蛋白SV40-VP-EL或权利要求5所述的试剂盒或权利要求6所述蓝光介导调节质粒或权利要求9所述的构建方法构建得到的蓝光介导调节质粒在真核生物蓝光诱导表达蛋白中的应用。

9.权利要求1所述的蓝光调节启动子PC120-CYC或权利要求2或3所述的融合基因或权利要求4所述的蓝光蛋白SV40-VP-EL或权利要求5所述的试剂盒或权利要求6所述蓝光介导调节质粒或权利要求9所述的构建方法构建得到的蓝光介导调节质粒在解脂耶氏酵母蓝光诱导表达蛋白中的应用。