CN113151341A

CN113151341A - 一种提高产赤藓糖醇亚罗解脂酵母耐热性的方法

Info

Publication number: CN113151341A
Application number: CN202011516582.0A
Authority: CN
Inventors: 张娟; 李江华; 陈坚; 堵国成
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-12-21
Filing date: 2020-12-21
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2040-12-21
Also published as: CN113151341B

Abstract

本发明公开了一种提高产赤藓糖醇亚罗解脂酵母耐热性的方法，属于微生物代谢工程领域。本发明发掘到与菌株耐热性有关的基因YALI0E32681g、YALI0E35222p、YALI0A12573g、YALI 0F26521g，将其在亚罗解脂酵母中进行不同组合的表达，从而实现了菌株耐热性的提升，使得重组菌较出发菌株在33℃热胁迫下能更好地生长，从而减少了在生产过程中的能耗损失。将此方法应用于工业化生产，有利于节约资源、提升效率。

Description

一种提高产赤藓糖醇亚罗解脂酵母耐热性的方法

技术领域

本发明涉及一种提高产赤藓糖醇亚罗解脂酵母耐热性的方法，属于微生物代谢工程领域。

背景技术

亚罗解脂酵母是一种与酵母亲缘关系较远的非常规酵母，并已获得美国食品药品监督管理局的GRAS(一般认为是安全的)认证。赤藓糖醇食品安全国家标准中，允许解脂假丝酵母(C.lipolytica)、丛梗孢酵母(M.pollinis)及类丝孢酵母(T.megachiliensis)三种菌株用于赤藓糖醇的生产。其中C.lipolytica已更名为Y.lipolytica，即为本专利所称的亚罗解脂酵母，在赤藓糖醇生产中应用最为广泛。亚罗解脂酵母的发酵温度一般为28-30℃，在夏季就会面临降温难题，造成大量的水耗、能耗，并且容易引起染菌倒灌等问题，成为推高生产成本的重要因素。

酵母发酵温度低，是一种普遍性问题。目前对于酵母耐热性的研究主要还是集中在酿酒酵母，例如，Caspeta等人报道酿酒酵母在温度升高时瞬时改变了上千个基因的表达。这种反应取决于温度升高的程度和温度与完全抑制生长温度的接近程度。高温条件下部分蛋白编码基因通常会过表达，这些蛋白与恢复未折叠蛋白、海藻糖合成、恢复膜的微流控状态、恢复DNA结构、保护剪接不受破坏以及防止过度能量消耗有关。编码核糖体和蛋白质合成成分以及参与细胞周期进程的基因，在高温条件下表达水平会降低。Xu等人在酿酒酵母中组合表达编码泛素和热激蛋白的基因thif、ibpa、gros2、ATG8、UBC4、RS5构建人工蛋白质量控制系统(APQC)，工程菌株在37℃高温下可以稳定的生产乙醇，同时产量提高了2.4％。

但是，关于提高亚罗解脂酵母热耐受性的研究非常少。菌株的常规筛选往往需要经过诱导突变、驯化等很长的时间，才可能从大量的诱变菌株中筛选出合适的菌株。因此，如何简化筛选的过程，提供一种快速获得目的菌株的方法仍然是本领域中需要解决的问题。

发明内容

硫胺素在细胞中的活性形式为焦磷酸硫胺素(TPP)，它是细胞物质和能量代谢中多个关键酶的辅因子(图1)，本发明利用了硫胺素途径基因，分别为：YALI0E32681g、YALI0E35222p、YALI0A12573g、YALI 0F26521g，建立了基因与菌株耐热性之间的联系。

本发明提供了一种提高亚罗解脂酵母耐热性的方法，在亚罗解脂酵母中表达YALI0E32681g、YALI0E35222p、YALI0A12573g、YALI 0F26521g中的一个或多个基因。

在本发明的一种实施方式中，将YALI0E32681g与YALI0E35222p或YALI0A12573g同时表达。

在本发明的一种实施方式中，将YALI0E32681g和YALI0A12573g进行表达，并表达YALI0F26521g或YALI0E35222p。

在本发明的一种实施方式中，将YALI0E32681g、YALI0E35222p、YALI0A12573g和YALI0F26521g同时表达。

在本发明的一种实施方式中，利用启动子pTEF启动基因的表达。

在本发明的一种实施方式中，启动子pTEF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，以XPR2为终止子。

在本发明的一种实施方式中，终止子XPR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，以pYLXP为表达载体。

在本发明的一种实施方式中，载体pYLXP记载于Yang Gu等《EngineeringYarrowialipolytica as a Chassis for De Novo Synthesis of Five Aromatic-Derived Natural Products and Chemicals》(公开于2020年9月)。

在本发明的一种实施方式中，以亚罗解脂酵母Po1f或亚罗解脂酵母BBE-17为出发菌株。

在本发明的一种实施方式中，所述亚罗解脂酵母BBE-17公开于授权公告号为CN107164249B的专利中。

本发明提供了所述一种提高亚罗解脂酵母耐热性的方法得到的重组菌。

本发明提供了构建所述重组菌的方法，将YALI0E32681g、YALI0E35222p、YALI0A12573g、YALI 0F26521g中的一个或多个基因在亚罗解脂酵母中表达。

在本发明的一种实施方式中，将所述基因连接至pYLXP载体，得到重组质粒。

在本发明的一种实施方式中，将得到的重组质粒转入亚罗解脂酵母中得到重组菌。

在本发明的一种实施方式中，所述亚罗解脂酵母包括亚罗解脂酵母Po1f和亚罗解脂酵母BBE-17。

在本发明的一种实施方式中，所述亚罗解脂酵母Po1f为yarrowialipolyticapo1f。

本发明提供了一种生产赤藓糖醇的方法，其特征在于，利用所述重组菌发酵生产赤藓糖醇。

在本发明的一种实施方式中，以葡萄糖为底物，发酵生产赤藓糖醇。

本发明的有益效果：

在模式菌Po1f中，单独及组合表达YALI0E32681g、YALI0E35222p、YALI0A12573g、YALI 0F26521g，发现YALI0E32681g、YALI0A12573g、YALI 0F26521g组合表达时，所构菌株在33℃热胁迫下其稳定期生长OD是对照菌株的3.7倍，菌株热耐受性提升明显。将优选基因组合在野生菌BBE-17中表达，33℃热胁迫下，所构建菌株的产量是对照菌株的3倍，有效提高了亚罗解脂酵母在高温生产赤藓糖醇的能力。

附图说明

图1为硫胺素活性形式TPP的主要作用图；

图2为不同硫胺素途径优化的Po1f菌株摇床培养细胞浓度图；

图3为不同热胁迫处理条件下各改造菌株的存活率实验图；

图4为不同温度下BBE-17T和BBE-17的生理特性；(a)：30及33℃下BBE-17T的生长曲线；(b)：30及33℃下BBE-17的生长曲线；(c)：30及33℃下BBE-17T细胞内的ATP变化；(d)：30及33℃下BBE-17细胞内的ATP变化。

图5为BBE-17T与BBE-17在摇瓶中赤藓糖醇的产量。

具体实施方式

(一)培养基：

1、YPD培养基：酵母粉10g/L,蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。固体培养基额外添加20g/L的琼脂。

2、CSM-Leu(C/N＝80)培养基：葡萄糖40g·L^-1，硫酸铵1.1g·L^-1，YNB(不含硫酸铵和氨基酸)1.7g·L^-1，CSM-Leu 0.69g·L^-1。

3、CSM-Leu固体培养基：葡萄糖20g·L^-1，硫酸铵5g·L^-1，YNB(不含硫酸铵和氨基酸)1.7g·L^-1，CSM-Leu 0.69g·L^-1，琼脂20g·L^-1。

4、CSM-Ura(C/N＝80)培养基：葡萄糖40g·L^-1，硫酸铵1.1g·L^-1，YNB(不含硫酸铵和氨基酸)1.7g·L^-1，CSM-Ura 0.69g·L^-1。

5、CSM-Ura固体培养基：葡萄糖20g·L^-1，硫酸铵5g·L^-1，YNB(不含硫酸铵和氨基酸)1.7g·L^-1，CSM-Ura 0.69g·L^-1，琼脂20g·L^-1。

6、发酵培养基：葡萄糖150-300g·L-1，酵母粉10g·L^-1，柠檬酸铵5g·L^-1，硫酸镁0.5g·L^-1，磷酸二氢钾0.25g·L^-1。

(二)赤藓糖醇滴度测定方法：采用高效液相色谱(HPLC)对赤藓糖醇进行检测，使用有机酸柱，流动相为5mM/L的稀硫酸，流速0.5ml/min，示差检测器。

实施例1

将YALI0E32681g(GeneID:2911801)、YALI0E35222p(Gene ID:2912348)、YALI0A12573g(GeneID:2906361)和YALI0F26521g(GeneID:2908353)在模型菌株Po1f中，单独或联合表达。

(1)单基因表达菌株的构建

将YALI0E32681g、YALI0E23522g、YALI0A12573g和YALI0F26521g分别利用Gibson组装连接至酵母载体pYLXP，构建得到重组载体，将重组载体转化至Po1f中，并在CSM-Leu固体培养基中，在30℃培养至长出单克隆，挑取单克隆并进行测序，测序正确后的即为阳性转化子。分别从阳性转化子中提取质粒，将提取得到的质粒转化至菌株Po1f中，分别构建了YALI0E32681g、YALI0E23522g、YALI0A12573g和YALI0F26521g的过表达菌株po1f11、po1f7、po1f9、po1f110。

(2)双基因表达菌株的构建

从YALI0E32681g、YALI0E23522g、YALI0A12573g和YALI0F26521g任选两个基因，分别连接至酵母载体pYLXP，再按照步骤(1)的方法，构建得到重组质粒，将重组质粒转化至菌株Po1f中，分别构建得到po1f17、po1f19、po1f110、po1f79、po1f710、po1f910。

(3)三基因表达菌株的构建

从YALI0E32681g、YALI0E23522g、YALI0A12573g和YALI0F26521g任选三个基因，分别连接至酵母载体pYLXP，再按照步骤(1)的方法，构建得到重组质粒，将重组质粒转化至菌株Po1f中，构建得到菌株po1f179、po1f1710、po1f1910、po1f7910。

(4)四基因表达菌株的构建

参见步骤(1)的构建步骤，将YALI0E32681g、YALI0E23522g、YALI0A12573g和YALI0F26521g共同连接至酵母载体pYLXP，构建得到重组质粒，将重组质粒转化至菌株Po1f中，构建得到菌株po1f17910。

实施例2

(1)菌株的耐热性

将实施例1中构建得到的菌株挑取单克隆接种至CSM-Leu(C/N＝80)培养基，在33℃下培养24h，培养结束后测定菌液OD值，如图2所示，对照菌株的OD值为1.1，菌株po1f1910、po1f17、po1f179、po1f19、po1f17910的OD₆₀₀显著高于对照，分别为4.30、4.10、3.42、3.35、2.80，而菌株po1f1710和po1f710的OD值仅分别为0.50、0.30。

(2)菌株的应激存活性能

将稳定期的菌株在45℃下热胁迫处理，分别培养15、30、45、60、90min，利用流式细胞仪测定存活率，如图3所示，热胁迫下各菌株的存活率与生长OD值呈正相关。也就是说，细胞生长OD越高，存活率越高。

实施例3

在野生型菌株BBE-17中表达基因组合(YALI0E32681g、YALI0E35222p、YALI0F26521g)。用pTEF启动子(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)分别对这三个基因进行过表达，以XPR2为终止子(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，将基因YALI0E32681g、YALI0E35222p、YALI0F26521g连接至酵母载体，按照实施例1的步骤(1)，构建得到重组质粒，将重组质粒转化至菌株BBE-17中，将构建的菌株命名为BBE-17T。

将菌株BBE-17和BBE-17T在30℃活化，将活化后的OD₆₀₀为1的菌液以10接种量接种至CSM-Leu(C/N＝80)培养基，分别在33℃和30℃培养，实时测定OD值。

如图4所示，BBE-17T在33℃时的对数期较30℃时延迟了约5h，稳定期OD值可达55；BBE-17在33℃时、在28h时达到对数期，稳定期OD值为20，BBE-17在30℃时、在19h时达到对数期，稳定OD值为51。在30℃时，BBE-17T的OD值与原菌株BBE-17相似且略高于原菌株BBE-17；但BBE-17在33℃时生长受到严重抑制，在稳定期OD值仅为20，小于30℃时OD的1/2(图4b)。

对数生长期伴随着细胞内ATP的迅速下降，稳定期后ATP维持在较低的生长水平。在33℃时，BBE-17T的ATP水平高于BBE-17，表明细胞内处于对数生长期的ATP对热应激下细胞的生长起着重要的促进作用。

采用500ml三角瓶进行摇瓶发酵，装液量为10％，发酵时采用发酵培养基，将OD₆₀₀为5的菌株以10ml/100ml的接种量接种至发酵培养基中，在33℃下进行，发酵时间为116h。BBE-17T的赤藓糖醇滴度为32g/L，是BBE-17(11g/L)的3倍左右(图5)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种提高产赤藓糖醇亚罗解脂酵母耐热性的方法

<130> BAA201168A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 406

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agagaccggg ttggcggcgc atttgtgtcc caaaaaacag ccccaattgc cccaattgac 60

cccaaattga cccagtagcg ggcccaaccc cggcgagagc ccccttctcc ccacatatca 120

aacctccccc ggttcccaca cttgccgtta agggcgtagg gtactgcagt ctggaatcta 180

cgcttgttca gactttgtac ttgtttcttt gtctggccat ccgggtaacc catgccggac 240

gcaaaataga ctactgaaaa tttttttgct ttgtggttgg gactttagcc aagggtataa 300

aagaccaccg tccccgaatt acctttcctc ttcttttctc tctctccttg tcaactcaca 360

cccgaaatcg ttaagcattt ccttctgagt ataagaatca ttcaaa 406

<210> 2

<211> 419

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tccatggcct gtccccacgt tgccggtctt gcctcctact acctgtccat caatgacgag 60

gttctcaccc ctgcccaggt cgaggctctt attactgagt ccaacaccgg tgttcttccc 120

accaccaacc tcaagggctc tcccaacgct gttgcctaca acggtgttgg catttaggca 180

attaacagat agtttgccgg tgataattct cttaacctcc cacactcctt tgacataacg 240

atttatgtaa cgaaactgaa atttgaccag atattgttgt aaatagaaaa tctggcttgt 300

aggtggcaaa atgcggcgtc tttgttcatc aattccctct gtgactactc gtcatccctt 360

tatgttcgac tgtcgtattt cttattttcc atacatatgc aagtgagatg cccgtgtcc 419

Claims

1.一种提高亚罗解脂酵母耐热性的方法，其特征在于，在亚罗解脂酵母中表达YALI0E32681g、YALI0E35222p、YALI0A12573g和YALI 0F26521g中的一个或多个基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将YALI0E32681g与YALI0E35222p或YALI0A12573g同时表达。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将YALI0E32681g和YALI0A12573g进行表达，并表达YALI 0F26521g或YALI0E35222p。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将YALI0E32681g、YALI0E35222p、YALI0A12573g和YALI 0F26521g同时表达。

5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，以亚罗解脂酵母Po1f或亚罗解脂酵母BBE-17为出发菌株。

6.权利要求1-5任一所述方法得到的重组菌。

7.构建权利要求6所述重组菌的方法，其特征在于，将YALI0E32681g、YALI0E35222p、YALI0A12573g和YALI 0F26521g中的一个或多个基因在亚罗解脂酵母中表达。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将所述基因连接至pYLXP载体，得到重组质粒。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将得到的重组质粒转入亚罗解脂酵母中得到重组菌。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述亚罗解脂酵母包括亚罗解脂酵母Po1f和亚罗解脂酵母BBE-17。