CN114369606B - 一种CadR基因突变体、含突变体的重组载体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种CadR基因突变体，具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，或与其互补的核苷酸序列。本发明的CadR基因突变体对镉有更高的响应灵敏度和特异性，含上述CadR基因突变体的重组载体及其工程菌作为镉诱导型生物传感器能够提升检测灵敏度，同时削弱其他重金属对传感器检测的影响，可以对安全标准范围内的镉进行检测；作为重组蛋白的表达载体能够以微量的镉作为诱导剂诱导目的蛋白的表达；其在镉污染监测和调控蛋白表达方面都具有应用价值。

Description

一种CadR基因突变体、含突变体的重组载体及其应用
技术领域
本发明涉及生物传感及环境污染物检测技术领域，尤其涉及一种CadR基因突变体、含突变体的重组载体及其应用。
背景技术
镉污染作为一项重要的环境风险因素，因其能在土壤及水体中快速积累并最终通过食物链进入人体且对人体产生严重健康危害而被广泛关注。因此，环境中镉的检测显得尤为重要并被视作衡量环境污染程度的一种标准，现有的原子吸收光谱(AAS)、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)等传统理化方法存在样品处理过程复杂、检测成本高、易产生有害副产物等缺点。
细菌由于其种群丰富度高、生长快速、成本低、易于培养以及其独特的基因操作能力等优势使其成为生物检测的理想选择。全菌生物传感器是以合适的细菌为底盘微生物，通过构建污染物响应及信号放大系统来针对环境中的特定污染物作出响应并输出信号的生物传感模式。全菌生物传感器一般由响应元件及报告元件构成，对于重金属离子的全菌生物传感器而言，其主要的工作机理是，能特异性识别重金属的响应元件(一般为金属结合蛋白)在识别到外界环境中的重金属离子后，能够与报告模块中其特异性结合的启动子结合或脱落，这时启动子后的报告基因便会启动表达，通过检测报告基因的表达便可实现整个通路的信号检测，即报告基因信号的表达量反映了环境中重金属离子的浓度，通过这样一条信号识别及输出通路即可使用全菌生物传感器来实现重金属离子的检测，利用合成生物学的方法通过替换不同重金属的特异性响应元件对通路进行改造理论上可以完成对不同重金属的特异性识别与检测。但是，由于大多数金属结合蛋白在作为响应元件时其特异性较差，同家族的金属结合蛋白往往对多种重金属离子均具有结合能力，难以形成针对特定重金属离子响应的专一性，此外，细菌体内的蛋白表达效率以及信号通路的信号放大程度等都限制了重金属全菌生物传感器的开发，导致目前开发的重金属全菌生物传感器仍具有灵敏度差、特异性低的问题，这也限制了重金属全菌生物传感器在实际环境样品检测中的应用。
因此，为了使生物传感器能够实际应用于镉含量的检测，如何提高其针对镉的特异性以及灵敏度成为关键问题，而构建在低浓度镉条件下具有高表达水平的镉敏感元件有助于解决这一问题。此外，由于在重组蛋白的表达中目前应用最广泛的是E.coli的原核表达系统，而该系统在表达重组蛋白的过程中存在表达速度过快、肽链的非正确折叠以及多肽链的疏水区存在相互作用等问题，这导致所表达的重组蛋白多以包涵体的形式存在，而无法满足获得可溶性蛋白的需求，并且E.coli表达系统通常需要以IPTG诱导重组蛋白的表达，而IPTG 的价格较昂贵，在大体积的生产发酵中使用IPTG也会使成本增加。镉敏感元件的构建可以通过添加微量镉作为诱导剂来诱导目的蛋白的表达，为实现对目的蛋白表达水平进行有效调控提供了一条可行性的途径。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种CadR基因突变体、含突变体的重组载体及其应用。
本发明提出的一种CadR基因突变体，所述基因突变体具有如SEQ ID NO:6 所示的核苷酸序列，或与其互补的核苷酸序列。
一种含所述的CadR基因突变体的重组载体，所述重组载体中还含有组成型启动子、pCadR启动子和目的基因，所述组成型启动子与CadR基因突变体可操作性地连接，且CadR基因突变体位于组成型启动子下游，所述pCadR启动子与目的基因可操作性地连接，且目的基因位于pCadR启动子下游。
其中，CadR基因是镉特异性响应蛋白CadR的编码基因，pCadR启动子是CadR 特异性启动子。
优选地，所述重组载体为双向表达重组载体；其中，所述重组载体中组成型启动子和pCadR启动子的转录方向相反。
优选地，所述组成型启动子为启动子J23109。
优选地，所述重组载体的出发载体为PSB1K3载体。
优选地，所述目的基因为报告基因；优选地，所述报告基因为GFP基因、 RFP基因或者mcherry基因。
一种所述的重组载体在以镉作为诱导剂诱导蛋白表达中的应用，或者一种所述的重组载体作为镉诱导型生物传感器在检测镉含量中的应用。
一种含有所述的重组载体的工程菌。
优选地，所述工程菌的底盘细胞为大肠杆菌，更优选为E.coli JudeI。
一种含有所述的重组载体的工程菌在以镉作为诱导剂诱导蛋白表达中的应用，或者一种含有所述的重组载体的工程菌作为镉诱导型生物传感器在检测镉含量中的应用。
一种检测镉含量的方法，以含有所述的重组载体的工程菌作为镉诱导型生物传感器进行检测，其步骤包括：
S1、以处于对数生长期的工程菌菌液作为检测菌液，将镉标准溶液加入所述检测菌液中，得到含梯度浓度镉离子的诱导体系，然后进行诱导培养，诱导培养结束后检测菌体中的荧光值，绘制标准曲线；
S2、将与镉标准溶液相同体积的待测样品溶液加入所述检测菌液中，得到诱导体系，然后进行诱导培养，诱导培养结束后检测菌体中的荧光值，根据标准曲线计算待测样品溶液中的镉含量。
优选地，所述含梯度浓度镉离子的诱导体系中的镉离子浓度范围为0-20μ g/L。
所述处于对数生长期的工程菌菌液可以通过常规培养方法制备得到，具体制备方法可以是：将放置在4℃保存的含有所述的重组载体的工程菌挑取单克隆于3mL含Kana抗性的LB培养基中活化，条件为37℃、200rpm震荡培养12-14h，然后将活化后的菌液使用含Kana抗性的MOPS培养基按照1：10的比例进行稀释，37℃震荡培养2h左右使细菌处于对数生长期，得到检测菌液。
优选地，所述检测镉含量的方法具体可以为：
S1、以处于对数生长期的工程菌菌液作为检测菌液，将镉标准溶液加入检测菌液中，得到含梯度浓度镉离子的诱导体系，然后于37℃培养箱中200rpm震荡培养2h进行诱导培养，诱导结束后取1mL菌液，12000rpm离心1min后弃上清，再使用1mL无菌PBS缓冲液将菌团重悬，取100μL细菌重悬液加入到96 孔板中，以加入与镉标准溶液相同体积的水在同样条件下培养得到的细菌重悬液作为对照，使用酶标仪检测重悬菌液的OD600与荧光值，根据相对荧光强度公式计算各孔中重悬菌液的FIR，绘制标准曲线；
S2、将与镉标准溶液相同体积的待测样品溶液加入检测菌液中，得到诱导体系，然后于37℃培养箱中200rpm震荡培养2h进行诱导培养，诱导结束后取 1mL菌液，12000rpm离心1min后弃上清，再使用1mL无菌PBS缓冲液将菌团重悬，取100μL细菌重悬液加入到96孔板中，以加入与待测样品溶液相同体积的水在同样条件下培养得到的细菌重悬液作为对照，使用酶标仪检测重悬菌液的OD600与荧光值，根据相对荧光强度公式计算重悬菌液的FIR，根据标准曲线计算待测样品溶液中的镉含量。
其中，若待测样品溶液测得的荧光值不在标准曲线的范围内，可通过梯度稀释使其测得的荧光值位于标线上的可信区间上，再通过方程计算其浓度。
本发明中，所述的可操作性连接是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如，启动子区域被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域与该核酸序列可操作性地连接。
定向进化基因表达工程在蛋白性能的改造方面表现出了优异的能力，常被用于酶的改造以及微生物传感器的改进。本发明定向进化改进镉全菌生物传感器检测灵敏度的基本策略为：利用易错PCR技术构建镉敏感元件突变文库，并使用流式细胞仪进行高通量筛选得到相同污染浓度下高表达水平的突变体。经过n轮定向进化，最终筛选得到相较于野生型菌株对低浓度污染物具有更高检测灵敏度的突变子。镉全菌生物传感器的工作原理以及定向进化原理如图1所示。
本发明的有益效果如下：
本发明采用易错PCR的方式对CadR基因序列进行易错突变并建立包含不同突变位点的突变体文库，使用BD流式细胞仪对突变体库进行筛选，筛选得到在相同浓度镉诱导下相较于wtCadR具有更高荧光响应的突变子，并继续以该突变子进行易错建库，镉诱导浓度随建库轮数增加而递减，最终筛选得到在低浓度下能够对镉具有荧光响应的高灵敏度CadR基因突变体，并命名为epCadR5。
本发明的CadR基因突变体对镉有更高的响应灵敏度和特异性，含上述CadR 基因突变体的重组载体及其工程菌可以作为镉诱导型生物传感器，能够提升镉离子的检测灵敏度，同时削弱其他重金属对传感器检测的影响，可以对安全标准范围内的镉含量进行检测；还可以作为重组蛋白的表达载体应用于重组蛋白的表达中，能够以微量的镉作为诱导剂诱导目的蛋白的表达，既能实现对目的蛋白表达水平的有效调控，而且由于微量的镉离子更易于去除，对蛋白表达体系所产生的毒性较小，具有一定的实际应用前景；因此，本发明的CadR基因突变体、含上述CadR基因突变体的重组载体及其工程菌在镉污染监测和调控蛋白表达方面都具有应用价值。
附图说明
图1是镉全菌生物传感器的工作原理以及定向进化原理图。
图2是本发明所构建的野生型镉诱导型重组载体的质粒图谱。
图3是本发明使用的PSB1k3-mAID-GFP的质粒图谱。
图4是野生型镉全菌生物传感器wtCadR的镉响应流式检测结果图。其中图 4a-e分别代表空白对照组、1mg/L、10mg/L、50mg/L、100mg/L诱导组。
图5是经五轮定向进化及高通量筛选后的突变子epCadR5的CadR基因编码序列位点分析图。
图6是epCadR5与wtCadR的梯度浓度镉响应结果以及特异性验证结果。
图7是使用不同浓度镉标准溶液诱导epCadR5表达绿色荧光蛋白后的荧光显微镜拍照结果。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例
1.野生型镉诱导型重组载体的构建
野生型镉诱导型操纵子基因的扩增：
使用AKTAoligopilotplus全自动DNA寡核苷酸合成仪进行目的基因片段CadR(含特异性启动子pCadR)的合成，CadR(含pCadR)的序列为5’ -GCCAACCCTCCTCCAATCGCCGACGCGGCTACCCGAATTGGCAGTACCGCTTGACTCTGTAGTTGCT ACAGGGTGTGCAATCGCACCCAACACGTCAAACGGGAATTGTTTCCATGAGCCACGAACACGCCGACA CTTGCTGTCACGGTCACGGTCACGGACATGATCATGGGCACCGCCACGCGCCTCGCCCGGCGGTGGCC GCCATCGGAACCCTGATGAAGATCGGTGAGCTGGCGAAGAGAACCGGTTGCCCGGTGGAGACCATCCG CTACTACGAGCGCGAAGGCCTGTTGCCCGAGCCCGCGCGTAGCGAAGGCAACTATCGGCAATACACCC TGGCGCATGTCGAGCGCCTGTCGTTCATCCGTCACTGCCGCTCGCTGGACATGACCCAGGAGGAAATC CGTACCCTGCTGGCGTTGCGCGACCGTCCCGAGGCGGATTGCGGCACCGCCAACCGGTTGATCGACGAGCACCTGCATCACGTCGAGGTGCGCATCGCCGAACTCCAGGCATTGCGCGAGCAACTGCGGGATCTCG GCTCACGCTGTACGGTCGCCGGCAACAGCCAGGCCTGCGGCATCCTCCGCGAACTGGAGCAGCCCGCG CCGCTGTCGCCAATCGCCGAGGAATGCGCCGAGGCCGGGCACATGCACGTCCCCGGCGTGCACCGCCG GCATGGCTGA-3’，共含有689个碱基，再通过双酶切及酶连将目的片段克隆至载体PUC18-KanR的对应位点上，得到质粒PUC18-CadR-KanR，由南京金斯瑞公司合成，其中KanR为卡那霉素和新霉素抗性基因。
以质粒PUC18-CadR-KanR为模板，设计所述引物SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8 特异性扩增镉特异性响应蛋白CadR的编码序列，设计所述引物SEQ ID NO:9与 SEQ ID NO:10特异性扩增启动子pCadR。PCR反应条件：95℃预变性5min，循环步为95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，共进行25个循环，最后继续72℃延伸5min，终止反应，4℃保存PCR产物。
SEQ ID NO:7:F-CadR-ScaⅠ：TCAGTACTatgaagatcggtgagctggc
SEQ ID NO:8:R-CadR-BamHI：TCCAGGATCCtcagccatgccggcg
SEQ ID NO:9:F-pCadR-SalI：TAGTCGACgccaaccctcctccaatcg
SEQ ID NO:10:R-pCadR-BglII：TAAGATCTcagggttccgatggcgg
PCR产物的琼脂糖凝胶电泳及切胶回收：使用电子天平称取0.75g琼脂糖于烧杯中，加入50ml的1×TAE缓冲液并于微波炉中加热至溶液中颗粒完全溶解，冷却至手感温度适宜后加入微量EB染液，充分混匀后均匀铺于已经插入合适大小梳子的电泳板上，待凝固后轻轻拔去梳子并将胶块拿出置于电泳槽中，取20 μL PCR产物加入4μL的10×DNAbuffer，混匀后轻轻加进凝胶中的小孔里，选择250bp marker作为扩增目的条带的参考。电泳参数设定：电压90V，电流 50mA，电泳时间10min。跑胶结束后将胶块置于凝胶成像仪中观察目的条带是否处于正确位置。观察为正确的目的条带使用手术刀小心切下，置于1.5mlep管中，使用Axygene胶回收试剂盒回收并纯化目的DNA片段。
胶回收产物及载体酶切与连接：分别使用对应的的酶对CadR及pCadR进行双酶切，同样使用对应酶对PSB1k3-mAID-GFP进行酶切，酶切产物使用T4连接酶进行连接，使CadR与pCadR构建到载体中的对应位置上，获得野生型镉诱导型重组载体wt-PSB1k3-CadR-PCadR-GFP，质粒图谱如图2所示。
其中，PSB1k3-mAID-GFP是采用实验室常规方法构建得到，其质粒图谱如图 3所示。mAID是无意义序列，不具有唯一性，可以是任意不具有完整蛋白翻译功能的基因片段。
2.野生型镉诱导型重组载体表达宿主的构建
连接产物通过电转化法转化至宿主E.coli JudeI感受态细胞。电转化步骤：取5μL回收的连接产物加入80μL的JudeI感受态中，然后转到预冷的2mm 电转杯中，2.5Kv电击即可。电转后的菌液37℃摇床摇1h后取40μL涂含有抗生素Kana的LB平板，平板置于37℃培养箱中培养过夜，次日，挑取单菌落经菌落PCR鉴定阳性克隆子，鉴定为阳性的克隆子命名为wtCadR。鉴定为阳性的单克隆吸取1μL的菌液于新鲜的含有Kana的液体培养基中，37℃摇床200rpm 振荡培养过夜，其余菌液送苏州金唯智公司测序鉴定。第二天使用生工质粒小提试剂盒提取质粒，获得野生型镉诱导型重组载体wt-PSB1k3-CadR-PCadR-GFP。
3.野生型镉诱导型全菌生物传感器的诱导表达
通过化转方法将提取的质粒转到E.coli JudeI感受态细胞中，待平板中长出单克隆后挑单克隆接种于3mL含有Kana抗性的LB液体培养基中，37℃摇菌培养过夜。第二天按照1：10的比例取300μL的过夜菌液使用含Kana抗性的 MOPS培养基稀释至3mL，继续培养约2h至OD600为0.4-0.6，此时的细菌处于对数生长期。使用镉标准溶液添加到对数期菌液中使终浓度呈梯度变化，设置 1mg/L、10mg/L、50mg/L、100mg/L系列梯度作为诱导组，同时使用ddH2O按照相同比例添加至对数期菌液中作为空白对照，37℃下诱导2h。诱导结束后取1mL菌液12000rpm离心，弃上清并使用PBS溶液重悬菌体，流式细胞仪检测检测传感器的荧光表达。
由图4可以看出，a-e分别代表空白对照组、1mg/L、10mg/L、50mg/L、100mg/L 诱导组，所构建的野生型镉诱导型全菌生物传感器对镉有响应，在1mg/L的镉标准溶液诱导下响应比例达到89％；当诱导体系镉浓度超过50mg/L时，由于过高的镉所产生的毒性作用使得细菌无法生长。这说明野生型镉全菌生物传感器在一定的浓度范围内对镉具有荧光响应。
4.定向进化及高通量筛选
易错PCR扩增镉诱导型操纵子：以wt-PSB1k3-CadR-PCadR-GFP为模板，设计所述易错引物SEQ ID NO:11与SEQ ID NO:12扩增含组成型启动子的CadR序列，易错PCR反应体系较普通PCR添加适宜浓度的Mg2+与Mn2+以使得在PCR的过程中引入随机的碱基突变。PCR反应条件：95℃预变性5min，循环步为95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，共进行25个循环，最后继续72℃延伸5min，终止反应。易错PCR产物电泳后使用Zymo胶回收试剂盒进行回收。
SEQ ID NO:11:CadR-BamHI-Primer：aataatgGATCCTCAGCCATGCCGGCGG
SEQ ID NO:12:CadR-ApaI-Primer：tattatgggcccTTTACAGCTAGCTCAGTCCTAGG
突变体文库的构建：将回收后的易错PCR产物使用BamHI及ApaI进行双酶切，载体同样使用同种酶进行双酶切，酶切产物跑胶后回收，回收后的酶切产物使用T4DNA连接酶进行连接，连接时间为1h，连接产物使用Zymo公司的DNA 纯化试剂盒进行纯化。把连接产物分装至1.5mL的离心管(10μL/管)，加入 70μL/管的感受细胞，电击转化(1.2mLSOB)，同时电击转化一管PUC19标准质粒作为测定感受态效率使用。将1.2mL的转化子移到10mL的塑试管中，37℃情况下220rpm于恒温振荡培养箱中复苏1h。取50μL涂板，epCadR与PUC19 转化子分别用于计算库容量以及感受态效率，剩下的菌液全部涂100mm平板，第二天刮下突变子，使用生工质粒大提试剂盒提取质粒。
荧光激活细胞分选技术对突变体文库进行分选：对于突变体文库的筛选使用荧光激活细胞分选技术(Fluorescence activated cell sorting,FACS)，通过488nm激发光和520nm发射光检测绿色荧光的荧光表达量可以定量的反映出诱导后的镉全菌生物传感器对不同浓度的镉的响应情况，再通过流式细胞仪中的分选模块对具有较高荧光响应的细菌群进行分选，所分离得到的细菌群中存在对相同浓度镉具有更高响应的突变子，对该细菌群进行挑菌诱导检测即可挑选出性能更优的突变子，即完成蛋白的定向进化。具体操作为：取大提后的突变体文库质粒1μL使用电转化法转到E.coli JudeI感受态细胞中，添加含有Kana的培养基后摇菌培养过夜，第二天对菌液按照1：10的比例进行扩大培养，待菌液的OD600达到0.4-0.6时，向菌液中添加镉标准溶液使终浓度为筛选需要浓度，诱导时间为37℃下200rpm震荡培养2h。诱导完的菌液取1μL离心，离心后弃上清并使用PBS重悬，重复使用PBS清洗3遍后最后使用1mL的 PBS重悬制成悬液进行上机检测。以超纯水替代相同体积的镉标准溶液加入到菌液中，设置为对照组，以未诱导下传感器的背景荧光为基础进行划门，所划门为P2，P2左侧区域为阴性区域，而右侧区域为阳性区域，即高于阳性对照的荧光强度才能被计入统计范围。对于诱导组来说，在阳性区域划门为P3，P3区域包括了阳性区域的部分，但也应尽量靠近阴性区域右侧以防止最终分选出的突变子大多数为不受调控型。使用流式细胞仪的分选模块将P3区域从整体中分出，分出细菌数约5万个。所分出细菌团全部涂100mm平板。
流式高通量筛选及验证：对分选后的平板进行挑单克隆按照如前所述的野生型传感器诱导方式进行摇菌过夜、扩大培养、诱导以及流式检测等实验操作，以分选所使用的镉离子浓度作为当轮筛选所使用的诱导浓度，以当轮进化所使用模板作为对照，筛选所挑取单克隆中对相同浓度镉离子具有更高响应的突变子，经流式检测后较模板响应提高的突变子会被保留，对每一轮突变体库共筛选100个克隆，其中初步筛得可能具有更优性能的突变子将会被提取质粒后重新使用化学转化方法转入E.coli JudeI感受态细胞中，之后重复三遍相同浓度的诱导实验，经检测相较于模板具有更高荧光响应强度且响应稳定性好的突变子将会被保留作为本轮筛选最终所得到的最优突变子，随后将该突变子送去公司测序以分析编码CadR蛋白的序列基因突变位点以及氨基酸突变情况。若单次筛选得到多个具有更优性能的突变子，则在下一轮进化中选择突变子中响应强度最高的一个作为下一轮进化的模板，其他突变子提取质粒后保存在-20℃以作备用。共进行5轮进化，其中每一轮进化所使用的镉浓度随着进化轮数的增加逐渐递减，分别为500μg/L、200μg/L、100μg/L、10μg/L、5μg/L，五轮进化所得突变子分别命名为epCadR1-epCadR5，最终通过序列比对分析五轮进化过程中CadR序列的碱基突变以及氨基酸突变情况。
未发生突变的原始CadR基因编码序列如SEQ ID NO:1所示，前四轮进化得到的突变子epCadR1-4的CadR基因编码序列如SEQ ID NO:2-5所示，五轮进化得到最终突变子epCadR5的CadR基因编码序列如SEQ ID NO:6所示。由图5可以看出，五轮进化得到最终突变子epCadR5的CadR基因编码序列上共发生9处碱基突变，其中3处(228、285、453位)为密码子优化，6处碱基突变引起氨基酸突变。
5.epCadR5与wtCadR的性能差异验证
为验证最终进化后所得到的突变子epCadR5与wtCadR的性能差异，从两个方面进行实验对比以确定进化后的镉生物传感器是否具有显著的性能改进。具体验证步骤如下：
1)epCadR5与wtCadR的灵敏度验证
分别于wtCadR以及epCadR5平板挑取3个单克隆使用含Kana抗性的LB培养基摇菌过夜，过夜培养菌液使用含Kana抗性的MOPS培养基按照1：10进行稀释后扩大培养，每个克隆共扩大培养13管，待菌液培养至OD600为0.4-0.6 时，向其中12管菌液中添加镉标准溶液使镉离子终浓度呈梯度变化(梯度范围为0-200μg/L)，向剩余1管中添加相同体积的超纯水作为空白对照，诱导时间为2h，诱导结束后取1mL菌液离心弃上清后使用1mL的PBS缓冲液进行重悬，细菌悬液取100μL于96孔板中，使用酶标仪测定各孔中细菌悬液的相对荧光值(RFU)以及OD600。
2)epCadR5与wtCadR的特异性验证
按照如前所述方法将epCadR5以及wtCadR培养至对数生长期，向对数期菌液中分别加入镉、铅、锌、铜四种重金属标准溶液使各重金属离子终浓度为0.01、0.1、1、10μM，于37℃摇床中200rpm震荡培养2h。诱导结束后取1mL菌液离心弃上清后使用1mL的PBS缓冲液进行重悬，细菌悬液取100μL于96孔板中，使用酶标仪测定各孔中细菌悬液的相对荧光值(RFU)以及OD600。
数据处理：进化前后的传感器镉响应荧光强度比较采用相对荧光强度(FIR) 来作为评价标准，其中样品的检测相对荧光值(RFU)与样品的吸光度OD600的比值定义为该样品的检测荧光值(AFU)，对照的检测相对荧光值(RFU)与样品的吸光度OD600的比值定义为该样品的检测荧光值(AFU)，对照组的检测荧光值(BFU)定义为阴性对照组中检测的相对荧光值(RFU)与阴性对照的吸光度OD600，则通过公式FIR＝AFU/BFU可计算样品的相对荧光强度。
由图6可知，进化后所得到的突变子epCadR5具有更高的检测灵敏度，且检测限也得到提升，使用LOD公式计算wtCadR的检测限为1.2μg/L，进化后 CadRep5的检测限为0.34μg/L。在低浓度镉存在的情况下，CadRep5的荧光强度为wtCadR的两倍左右。图6展示了进化前后突变子对不同重金属响应的情况，未进化之前的野生型镉诱导型生物传感器wtCadR的专一性较差，其对Pb以及 Zn在一定浓度下均有响应，且在高浓度情况下还表现对Zn的高响应，故在实际检测中会受到其他重金属干扰，影响传感器的检测准确性。而进化后所得到的突变子epCadR5对镉的响应不仅有显著提升，而且受其他重金属的影响更小。
6.通过微量镉离子调控蛋白表达的应用
在epCadR5平板挑取3个单克隆使用含Kana抗性的LB培养基摇菌过夜，过夜培养菌液使用含Kana抗性的MOPS培养基按照1：10进行稀释后扩大培养，每个克隆共扩大培养4管，待菌液培养至OD600为0.4-0.6时，向其中3管菌液中分别添加镉标准溶液使镉离子终浓度为1μg/L、5μg/L、10μg/L以诱导 GFP的表达，另一管使用相同体积的超纯水作为空白对照，诱导时间为2h，诱导结束后各管取1mL菌液12000rpm离心后弃上清并使用无菌PBS重悬，取10 μL重悬液滴加在载玻片上，在酒精灯火焰上方灼烧1-2秒以固定细菌，盖上盖玻片后使用荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况。
由图7可以看出，低剂量的镉能诱导绿色荧光蛋白的表达，且随着镉浓度的提升，GFP的表达量逐渐提升，而在5μg/L的镉浓度下，GFP的表达量已接近上限，这说明安全浓度范围内的镉对epCadR5突变体的诱导蛋白表达具有显著的作用，可通过调控微量镉浓度实现重组蛋白表达的目的，且该浓度的镉不会对菌体本身产生毒副作用。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院合肥物质科学研究院
<120> 一种提升镉生物传感器性能的定向进化及筛选方法
<130> 2021.9.1
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 471
<212> DNA
<213> Pseudomonas aeruginosa
<400> 1
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<212> DNA
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<211> 471
<212> DNA
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<400> 6
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<211> 28
<212> DNA
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aataatggat cctcagccat gccggcgg 28
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
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<400> 12
tattatgggc cctttacagc tagctcagtc ctagg 35

Claims (10)

1.一种CadR基因突变体，其特征在于，所述基因突变体的核苷酸序列为如SEQ ID NO:6所示。
2.一种含权利要求1所述的CadR基因突变体的重组载体，其特征在于，所述重组载体中还含有组成型启动子、pCadR启动子和目的基因，所述组成型启动子与权利要求1所述的CadR基因突变体可操作性地连接，且CadR基因突变体位于组成型启动子下游，所述pCadR启动子与目的基因可操作性地连接，且目的基因位于pCadR启动子下游。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为双向表达重组载体；其中，所述重组载体中组成型启动子和pCadR启动子的转录方向相反。
4.根据权利要求2所述重组载体，其特征在于，所述组成型启动子为启动子J23109。
5.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的出发载体为PSB1K3载体。
6.根据权利要求2-5任一项所述的重组载体，其特征在于，所述目的基因为报告基因；所述报告基因为GFP基因、RFP基因或者mcherry基因。
7.一种如权利要求2-6任一项所述的重组载体在以镉作为诱导剂诱导蛋白表达中的应用，或者一种如权利要求6所述的重组载体作为镉诱导型生物传感器在检测镉含量中的应用。
8.一种含有如权利要求2-6任一项所述的重组载体的工程菌。
9.一种含有如权利要求2-6任一项所述的重组载体的工程菌在以镉作为诱导剂诱导蛋白表达中的应用，或者一种含有如权利要求6所述的重组载体的工程菌作为镉诱导型生物传感器在检测镉含量中的应用。
10.一种检测镉含量的方法，其特征在于，以含有如权利要求6所述的重组载体的工程菌作为镉诱导型生物传感器进行检测，其步骤包括：
S1、以处于对数生长期的工程菌菌液作为检测菌液，将镉标准溶液加入所述检测菌液中，得到含梯度浓度镉离子的诱导体系，然后进行诱导培养，诱导培养结束后检测菌体中的荧光值，绘制标准曲线；
S2、将与镉标准溶液相同体积的待测样品溶液加入所述检测菌液中，得到诱导体系，然后进行诱导培养，诱导培养结束后检测菌体中的荧光值，根据标准曲线计算待测样品溶液中的镉含量。
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