CN112159772A - 一株深渊盐生单胞菌13199及其CRISPR-Cas系统和应用 - Google Patents

一株深渊盐生单胞菌13199及其CRISPR-Cas系统和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株深渊盐生单胞菌13199，其保藏编号为CGMCC 1.17396，分类命名是：Salinimonas profundi。该菌株是深海来源的细菌新物种，含有一个特殊的CRISPR‑Cas系统和大量的重金属抗性基因。其Cas蛋白与经过一定程度功能研究的高质量蛋白质数据库UniProtKB/Swiss‑Prot中收录的蛋白质序列同源性均低于65％，很可能具有不同的活性和特点。本发明的菌株Salinimonas profundi 13199及其CRISPR‑Cas系统是开发利用CRISPR‑Cas系统及进行相关研究的新颖材料，同时本发明的菌株在重金属污染环境修复制剂方面有一定的应用前景。

Description

一株深渊盐生单胞菌13199及其CRISPR-Cas系统和应用
技术领域
本发明涉及一株深海来源的细菌菌株，具体为一株含有CRISPR-Cas系统的深渊盐生单胞菌13199及其CRISPR-Cas系统和应用。
背景技术
规律间隔成簇短回文重复序列及其相关蛋白(Clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats-CRISPR associated proteins, CRISPR-Cas）系统是原核生物基因组中一段特殊的DNA序列，发现于大约84%的古菌和47%的细菌中。一个完整的CRISPR-Cas系统包含三个功能元件：一系列Cas基因，一个前导区(Leader)和一个CRISPR阵列。
Leader一般位于CRISPR上游，是富含AT、长度为300～500bp的区域，被认为可能是CRISPR的启动子序列。CRISPR阵列由多个短而高度保守的重复序列区(Direct repeat,DR)和多个间隔区(Spacer)组成。DR长度一般为21～37 bp，含有回文序列，可形成发卡结构，数量有时超过100个。重复序列之间被长度为26～72bp的Spacer隔开。Spacer区域由俘获的外源DNA组成，类似免疫记忆，当含有同样序列的外源DNA入侵时，可被细菌机体识别，并被剪切使之表达沉默，达到保护自身的目的。Cas基因通常形成一个操纵子，位于CRISPR阵列的上游，可编码一系列Cas蛋白。目前发现的Cas蛋白包括Cas1～Cas13等多种类型。Cas基因与CRISPR共同进化，共同构成一个高度保守的系统。这些蛋白相互配合，共同完成Cas基因的表达、新Spacer的获得、外源核酸的识别和降解等过程。
根据使用的CRISPR RNA（crRNA）效应蛋白复合物的类型，CRIPSR-Cas系统分为Class 1（使用多效应蛋白）和2（使用单一效应蛋白）两个大类；根据Cas蛋白的组成和排布方式，又分为6个（I-VI）主要类型，并且不断有新的类型被发现。Class 1包括I、III和IV三个类型，编码多种蛋白发挥作用；Class 2包括II、V和VI三个类型，分别只编码Cas9、Cas12和Cas13一种蛋白便可以实现多效应蛋白符合物的所有功能。标志性的Cas蛋白是区分不同CRISPR-Cas系统的主要依据之一，是行使剪切目标DNA/RNA功能的蛋白，例如：I型使用Cas3，II型使用Cas9，III型使用Cas10，IV型使用Csf1，V型使用Cas12/Cpf1，VI型使用Cas13。在这些主要的类型中，又分为诸多亚型，不同的亚型有着不同的Cas蛋白和基因排布方式，主要的亚型有： I-A、I-B、I-C、I-U、I-D、I-E、I-F、II-A、II-B、II-C、III-A、III-B、III-C、III-D、V-A、V-B、V-C、V-D、V-E、V-U、VI-A、VI-B和VI-C等。几乎所有的CRISPR-Cas系统都能编码Cas1和Cas2蛋白，这两个蛋白主要是负责适应新的外源DNA/RNA并在CRISPR中插入新的Spacer。Cas1和Cas3是所有Cas蛋白中最为保守的，而其他Cas蛋白都具有很大程度的分化，这为CRISPR-Cas系统的分类带来了很多问题。但是多样化的Cas蛋白，也赋予了不同CRISPR-Cas系统不一样的特点，为人们开发利用CRISPR-Cas系统提供了更多的可能性。因此，寻找新型的CRISPR-Cas系统在其开发利用过程中是至关重要的环节。
CRISPR-Cas系统发挥作用比较典型的模式是依靠一个复合物，该复合物能在一段RNA指导下，定向识别目标DNA序列，然后将该序列进行精切切除。由于这一特性，CRISPR-Cas系统被广泛应用于基因组编辑、转录调控、检测、成像等研究领域，并迅速成为生命科学领域最热门的技术。该技术具有精准、廉价、易于使用等特点。由于使用的是单一效应蛋白发挥作用，class 1中的Cas9蛋白是目前研究中最深入的类型。而使用多效应蛋白的class2较为复杂，这在一定程度上阻碍了这类CRISPR-Cas系统的开发应用。但是由于多样性丰富、分布广泛，class 2有着更大的应用前景，尤其是I型CRISPR-Cas系统。目前，I型CRISPR-Cas系统特有的Cas3蛋白也在核酸剪切、基因编辑和基因表达调控等方面表现出了一定的应用前景。
不同来源的CRISPR-Cas系统通常会由于菌株自身的的细胞化学特性而具有不同的活性和特点，在核酸剪切、基因编辑和基因表达调控等方面都会有不同的特色。
发明内容
深海复杂多样的环境蕴藏着独特的菌种和基因资源。本发明从中国南海2918m深的沉积物环境中分离获得一株属于盐生单胞菌属（Salinimonas）的海洋细菌，该细菌是潜在的新物种，含有一个独特的CRISPR-Cas系统，是进行CRISPR-Cas系统开发利用的新颖材料。
本发明的目的是为CRISPR-Cas系统的开发利用提供一种新颖的研究材料，以深海来源的细菌菌株深渊盐生单胞菌(Salinimonas profundi) 13199的形式存在。
本发明的菌株Salinimonas profundi 13199是从中国南海2918 m深（19.69°N,119.33°E）的沉积物样品中，使用PYGV复苏培养基在28℃培养20天后挑取单菌落获得纯培养。菌株Salinimonas profundi 13199的基因组上含有一个独特的CRISPR-Cas系统。Cas基因排布方式为cas1、cas3、csy1、csy2、csy3和cas6/csy4，属于I-F型CRISPR-Cas系统。但是这些基因的氨基酸序列与已知的高质量蛋白质数据库UniProtKB/Swiss-Prot中的蛋白质同源性分别只有63.6%、47.9%、42.3%、40.8%、62.6%和46.5%。
本发明的含有CRISPR-Cas系统的细菌菌株为深渊盐生单胞菌(Salinimonas profundi) 13199，其微生物保藏号是：CGMCC 1.17396；分类命名是：Salinimonas sp.；后续研究使用的分类命名为Salinimonas profundi；保藏时间：2020年6月3日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。
本发明的含有CRISPR-Cas系统的菌株Salinimonas profundi 13199的形态特征：
菌株Salinimonas profundi 13199为革兰氏阴性球菌，细胞直径约0 .80-1.03μm，无芽孢，无鞭毛，不具有运动性。在2216E固体培养基上培养24 h后可观察到圆形、米白色、表面光滑，直径为1-2 mm的菌落，菌落粘稠，边缘整齐。其中，2216E培养基从北京索莱宝科技有限公司购买，并按照产品说明书进行配置，货号LA0341。
本发明的含有新颖CRISPR-Cas系统的菌株Salinimonas profundi 13199的培养 特性：
菌株Salinimonas profundi 13199为好氧菌，生长温度范围为4～37℃，最适生长温度范围为28～30℃。可以在0.5～18% 海盐浓度的环境中生长，2～7% 海盐浓度为最适浓度，使用NaCl替换海盐时不生长。可以在pH 5.0～10.0的环境中生长，其中最适pH为7.0～9.0。
经过梅里埃API 20NE试剂条测定：菌株Salinimonas profundi 13199可利用碳源D-葡萄糖产酸，L-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-甘露醇、N-乙酰氨基葡萄糖、D-麦芽糖、葡萄糖酸钾、癸酸、乙二酸、羟基丁二酸、三柠檬酸钠、苯乙酸等碳源无法被利用。
经过梅里埃API ZYM试剂条测定：菌株Salinimonas profundi 13199具有萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶活性、亮氨酸芳香氨基酶、缬氨酸芳香氨基酶、C4酯酶、C8酯酶活性和胱氨酸芳香氨基酶活性；无C14酯酶、胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、N-乙酰-β-氨基酸葡糖苷酶、α-甘露糖苷酶及α-岩藻糖苷酶活性。
本发明的含有CRISPR-Cas系统的菌株Salinimonas profundi 13199的细胞化学 特性：
菌株Salinimonas profundi 13199主要含极性脂为磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油和一种未知的磷脂，唯一呼吸醌为Q8，主要脂肪酸为C16:1 w7c/C16:1 w6c (27.38%)、C16:0 (23.67%)、C18:1 w7c (14.16%)。
本发明的含有新颖CRISPR-Cas系统的菌株Salinimonas profundi 13199的基因 组特征：
使用Illumina HiSeq平台对菌株Salinimonas profundi 13199的基因组进行测序，使用Ugene中的SPAdes软件组装得到的基因组包含30个contig，总长4.07M bp， G+C的含量为48.5%。将基因组上传到NCBI，得到的GenBank登录号为JABBXD000000000、BioProject登录号为PRJNA627083、BioSample登录号为SAMN14650985。通过PGAP(Prokaryotic GenomeAnnotation Pipeline, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_prok/)进行注释，发现该基因组包含基因3723个，CDS3663个（包含假基因37个），RNA基因数为60（其中rRNA为4，tRNA为51，ncRNA为5），含有一个I-F型CRISPR-Cas系统。
另外，该基因组上还包含大量的与重金属抗性相关的基因，分别是：aniA (编码铜抗性系统), cadR (镉/铅依赖的转录调控因子), chrA (铬外排泵), chrB (铬抗性蛋白), copA (铜转移ATP酶), copB (铜抗性蛋白B), copC (铜抗性蛋白C), copD (铜结合蛋白), czcA (CusA/CzcA 家族重金属外排泵), czcD (阳离子转运蛋白), merA (汞还原酶), merC (有机汞转运蛋白), merP (汞抗性系统中的周质结合蛋白), merR (二价汞依赖的转录调控因子), merT (汞转运蛋白), 和phoQ (重金属响应组胺酸激酶).其中czcA-D和copA-D基因簇出现两次，在其上游还有copCD出现了第三次。与汞抗性相关的 merR,merT, merP, merC, merA和merR出现在一个Tn6333的转座子上。这些大量的与重金属抗性相关的基因表明本发明的菌株在重金属污染环境修复制剂方面将非常具有应用前景，在土壤与水体的重金属污染修复中，都可以考虑本发明的菌株。
将16S rRNA基因序列在EzBioCloud数据库上进行分析发现，菌株Salinimonas profundi 13199与Salinimonas属中三个物种的亲缘关系最近。使用MEGA X软件分析发现，菌株Salinimonas profundi 13199的16S rRNA基因与典型菌株SalinimonaslutimarisDPSR-4T、Salinimonaschungwhensis BH030046T、Salinimonassediminis N102T的一致性分别为97.91%、97.68%和96.68%。因此，菌株Salinimonas profundi 13199很可能是Salinimonas属的新物种。
使用Jspecies软件和GGDC在线工具进行分析，结果表明Salinimonas profundi13199和Salinimonas属三个物种的ANI(Average Nucleotide Identity)和DDH(DNA-DNAhybridization)值均小于95%和70%。这表明Salinimonas profundi 13199应该代表Salinimonas属的一个新物种，建议将其命名为Salinimonas profundi。
本发明包括上述菌株Salinimonas profundi 13199及微生物保藏号为CGMCC1.17396和MCCC 1K04127的培养物、细胞内容物、细菌菌株的菌液、发酵培养液及培养液的过滤液。
以上述菌株Salinimonas profundi 13199及相关产物为活性成分的生物制剂也属于本发明的保护范围。在需要的时候，该菌剂中还可包含菌剂制备中常用的载体和辅料。
本发明的菌株还包括上述菌株Salinimonas profundi 13199的突变体、变异体或其各种代谢产物、衍生物。
本发明还包括上述菌株Salinimonas profundi 13199中cas1、cas3、csy1、csy2、csy3和cas6/csy4表达的蛋白产物和包含这些蛋白产物的各种生物制剂。
本发明的菌株Salinimonas profundi 13199是深海来源的细菌新物种，含有的CRISPR-Cas系统中的Cas蛋白与经过一定程度功能研究的高质量蛋白质数据库UniProtKB/Swiss-Prot中收录的蛋白质序列同源性均低于65%，很可能具有不同的活性和特点。因此，菌株Salinimonas profundi 13199及其CRISPR-Cas系统是开发利用CRISPR-Cas系统及进行相关研究的新颖材料，同时本发明的菌株在重金属污染环境修复制剂方面有一定的应用前景。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为菌株Salinimonas profundi 13199在2216E培养基上培养48 h的生长情况。
图2为菌株Salinimonas profundi 13199在光学显微镜下菌株13199的革兰氏染色结果。
图3为菌株Salinimonas profundi 13199基于16S rRNA基因构建的邻接法系统进化树。
图4为菌株Salinimonas profundi 13199基于120个高度保守基因构建的最大似然法系统发育树。
图5为菌株Salinimonas profundi 13199极性脂的磷钼酸试剂染色结果。
图6为菌株Salinimonas profundi 13199基因组上CRISPR-Cas系统的基因排布模式；
图7为菌株Salinimonas profundi 13199基因组上汞抗性基因簇（Tn6333）的基因排布模式。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
1、本发明的含有CRISPR-Cas系统的菌株Salinimonas profundi 13199的分离方法：
取沉积物样品2 g，置于盛有18 mL无菌人工海水（含3.0%海盐）的50 mL三角瓶中，于摇床上在28℃条件下，180rpm振荡30 min，得到的菌悬液(即为10-1的土壤稀释液，也就是稀释10倍的样品溶液)；接着用10倍梯度稀释法依次稀释得到10-3和10-4浓度梯度稀释液；然后从10-4浓度梯度悬浮液中取0.1 mL，用无菌涂布棒涂于添加了2.5%海盐的PYGV复苏培养基上。PYGV培养基每1000 mL含有矿物盐溶液20 mL，蛋白胨0.25 g，酵母提取物0.25 g，琼脂粉15 g，pH 7.0-7 2。121℃灭菌20 min，冷却至60℃左右时添加2.5%的葡萄糖溶液10 mL和维生素溶液5 mL。其中，每1000 mL矿物盐溶液含有次氮基三乙酸10 g，七水硫酸镁29.7 g，二水氯化钙3.34 g，二水钼酸钠12.67 mg，七水硫酸亚铁99 mg；每1000 mL维生素溶液含有生物素4.00 mg，叶酸4.00 mg，盐酸吡哆醇20.00 mg，核黄素10.00 mg，盐酸硫胺素10.00mg，烟酰胺10.00 mg，D-钙-泛酸酯 10.00 mg，维生素B12 0.20 mg，对氨基苯甲酸10 mg。
涂抹均匀后放到恒温箱中28℃倒置培养；培养20天后，挑取菌落形态不同的菌株，在2216E平板上进行划线纯化培养。获得深海海洋细菌菌株后，放置4℃保存备用。
2、本发明的含有CRISPR-Cas系统的菌株Salinimonas profundi 13199的鉴定方法：
（1）菌株基因组DNA的提取
按照Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司，货号B518255）操作说明提取细菌基因组DNA。
（2）16S rRNA基因扩增
用所提出的DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系如下：
Figure RE-251431DEST_PATH_IMAGE001
引物序列为(5’-3’)：
24f，CAGAGTTTGATCMTGGCT；
1492r，GGYTACCTTGTTACGACTT。
PCR扩增条件为：95℃预变性，变性1 min，55℃退火，退火30 s，72℃延伸，延伸1.5min，如此进行30个循环后，得到PCR产物。取5 μL PCR产物，在含有Goldview II型核酸染料的0.8%琼脂糖凝胶上，160 V电泳20 min，并在凝胶成像仪下观察拍照。
（3）16S rRNA序列测定及其系统发生分析
16s rRNA基因测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，使用CLASTAL软件将所得结果与EzBioCloud数据库上的获得的参比序列进行比对，使用MEGA X软件进行系统发育分析。采用Kimura双参数模型计算遗传距离，采用邻接法（Neighbour-joining, NJ）构建系统进化树。
（4）菌株最适生长条件的测定
将菌株划线接种到2216E固体培养基上，分别放入4℃、10℃、20℃、28℃、37℃以及45℃的环境中培养48 h，观察菌株在不同温度条件下的生长情况。分别配制海盐浓度为0%、0.5%、1%、2%、3%、5%、7%、10%、12%、15%、18%、20%的2216E固体培养基。将菌株划线接种到不同盐浓度的2216E固体培养基中，放入28℃的培养箱中培养48 h，观察菌株在不同盐浓度下的生长情况。
使用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH溶液将标准的2216E液体培养基分别调配出pH为4、5、6、7、8、9、10的2216E液体培养基。将菌株接种到相应的培养基中放入28℃的培养箱中培养48 h，观察菌株在不同pH值下的生长情况。
（5）菌株的极性脂分析
a）极性脂的提取
将菌株接种到2216E液体培养基中，在28℃、180rpm振荡条件下培养48 h后，采用离心法收集菌体，条件为5000 g离心10 min。使用3％的NaCl溶液洗2-3次。
称取1 g湿菌体，置于40 mL的螺口离心管中；向离心管中加入15 mL甲醇（拧紧盖子，防止水浴时液体漏出）；沸水浴5 min，自然冷却；向离心管中加入10 mL氯仿后，再不断加入2％NaCl溶液，直至离心管中出现分层现象；将离心管用力摇匀10 min；为了使磷脂沉淀更充分可以选择以8000 g离心10 min；垂直静置离心管，待分层后用移液枪取出下层无杂质的有机相，置于旋蒸瓶中，在旋转蒸发仪上30～40℃浓缩抽干；分两次向旋蒸瓶中各加入200 μL氯仿/甲醇（2:1，V/V）溶剂；将旋蒸瓶内的液体移入EP管（约100-200 μL），8000 g离心10 min，去沉淀；4℃冷藏保存备用。
b）双相点层展样
使用10*10的硅胶板(Meck公司，货号1056260001)，在距离两条相交底边1.5 cm的地方点样（5-15 μL）；用到的展层液为：第一相氯仿：甲醇：蒸馏水=65:25:4 (V/V)，第二相氯仿：冰醋酸：甲醇：蒸馏水=80:18:12:5（V/V）；展层顺序为第一相到第二相，第一相展层至顶边1.5 cm时将硅胶板从展层液中取出，自然风干后用吹风机逐行进行吹干30 min，再进行第二相展层，距顶边1.5 cm时将硅胶板从展层液中取出，自然风干后喷雾显色。
c）显色
距板10-15 cm处用喷瓶气雾状喷显色剂。
钼蓝试剂：显色时不能将硅胶板喷湿，且不需加热，蓝色斑点很快就可以显出，蓝色斑点为磷酸类脂。
茴香醛试剂：将喷好的硅胶板110℃加热6~10 min，显出的黄绿色斑点（同时钼蓝试剂显色为蓝色的）为含糖的磷脂，黄绿色斑点（同时钼蓝试剂显色不是蓝色的）为糖脂。
磷钼酸试剂：需要喷湿，180℃高温炙烤10 min，出现黄褐色斑点为极性脂。
显色剂的配方如下：
钼蓝试剂：将10 mL溶液A（40.11 g三氧化钼用于1 L 25N H2SO4（浓硫酸：水=2:1）中，煮沸1 h溶解）和10 mL溶液B（1.78 g钼粉溶于500 mL溶液A中，煮沸15 min，冷却后弃掉残余物），再加入40 mL蒸馏水，摇匀混均即为P试剂。
茴香醛试剂（现用现配，易氧化失效）：95%乙醇：浓硫酸：p-茴香醛：冰醋酸=270:15:15:3，先加乙醇、浓硫酸，感到热量后再加冰醋酸，最后加茴香醛。
磷钼酸试剂：将磷钼酸晶体溶于无水乙醇中，配成5%的磷钼酸乙醇试剂。
3、本发明的含有CRISPR-Cas系统的菌株Salinimonas profundi 13199的基因组分析方法：
将菌株接种到2216E液体培养基中，在30℃、200 r/min条件下培养72 h后，收集菌体。基因组DNA的提取和测序由广东美格基因科技有限公司完成。基因组测序使用IlluminaHiSeq平台进行。公司交付的结果为经过质控后的clean data，在Ubuntu系统中使用UGENE软件包中的SPAdes程序进行基因组组装，删除Coverage小于5或长度小于500 bp的序列后，将基因组数据提交到GenBank并使用NCBI的PGAP在线工具对基因组进行注释。分别使用Jspecies软件和GGDC在线工具(http://ggdc.dsmz.de/ggdc.php#)计算菌株Salinimonas profundi 13199与Salinimonas生效发表的三个物种的ANI值和DDH值。使用CRISPRCasFinder在线工具进行CRISPR-Cas系统基因簇分析，使用NCBI网站的blastp在线工具对菌株Salinimonas profundi 13199的Cas蛋白进行比对分析，比对过程中选择高质量的UniProtKB/Swiss-Prot数据库进行分析。根据GTDB数据库（https://gtdb.ecogenomic.org/）选择120个高度保守管家基因，并使用FastTree软件构建基因组系统发育树。以上分析如未作特别说明，均是在软件或工具的默认参数下进行。
Jspecies计算得到的菌株Salinimonas profundi 13199和相关菌株的ANI结果(%)如下表所示，列为query、行为reference。从结果可以看到菌株Salinimonas profundi13199与相关物种的ANI值均小于定义不同物种的阈值95%。
Figure RE-371833DEST_PATH_IMAGE003
使用GGDC在线工具计算得到的菌株Salinimonas profundi 13199和相关菌株的DDH结果(%)如下表所示，列为query、行为reference。从结果可以看到菌株Salinimonas profundi 13199与相关物种的DDH值均小于定义不同物种的阈值70%。
Figure RE-371145DEST_PATH_IMAGE005
4、结果分析
菌株Salinimonas profundi 13199在2216E培养基上培养48 h的生长情况如图1所示，菌苔为米白色、质地粘稠。
菌株Salinimonas profundi 13199在光学显微镜下的形态结构如图2所示，可见细胞为球形或椭球形。
菌株Salinimonas profundi 13199基于16S rRNA基因构建的邻接法系统进化树如图3所示。结果表明，菌株Salinimonas profundi 13199属于Salinimona菌属，且与属内已知的三个物种存在一定差异（一致性<98%，S. sp. KX18D6未正式发表）。
菌株Salinimonas profundi 13199基于120个高度保守基因构建的系统发育树如图4所示，结果表明了菌株Salinimonas profundi 13199在Salinimonas属内相对独立的分类地位。
菌株Salinimonas profundi 13199极性脂分析的磷钼酸试剂染色结果如。图5所示，结果表明该菌株的主要极性脂成分为磷脂酰乙醇胺（Phosphatidylethanolamine，PE），磷脂酰甘油（Phosphatidylglycerol，PG）和一种未知的磷脂（Unidentifiedphospholipid, PL）。
菌株Salinimonas profundi 13199基因组上CRISPR-Cas系统的基因排布模式如图6所示。
菌株Salinimonas profundi 13199基因组上汞抗性基因簇（Tn6333）的基因排布模式如图7所示。
菌株Salinimonas profundi 13199基因组上的Cas蛋白与UniProtKB/Swiss-Prot数据库比对分析的最佳结果如下表所示，结果表明Salinimonas profundi 13199的Cas蛋白与已知的Cas蛋白在序列水平存在明显差异。
Figure RE-235195DEST_PATH_IMAGE007
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株深渊盐生单胞菌13199，其保藏编号为CGMCC 1.17396，分类命名是：Salinimonas profundi；保藏时间：2020年6月03日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.如权利要求1所述的深渊盐生单胞菌13199，其特征在于，该菌株为革兰氏阴性球菌，无芽孢，无鞭毛，不具有运动性，在固体培养基上培养24h后可观察到圆形、米白色、表面光滑，直径为1-2mm的菌落，菌落粘稠，边缘整齐。
3.如权利要求1所述的深渊盐生单胞菌13199，其特征在于，该菌株为好氧菌，生长温度范围为4～37℃，在0.5～18％海盐浓度的环境中生长，在pH 5.0～10.0的环境中生长。
4.如权利要求3所述的深渊盐生单胞菌13199，其特征在于，该菌株为好氧菌，生长温度范围为28～30℃，在2～7％海盐浓度的环境中生长，在pH 7.0～9.0的环境中生长。
5.一株权利要求1所述的深渊盐生单胞菌13199及其培养物、细胞内容物、细菌菌株的菌液、发酵培养液及培养液的过滤液在获取CRISPR-Cas系统中的应用。
6.一株权利要求1所述的深渊盐生单胞菌13199的突变体、变异体或其各种代谢产物、衍生物在获取CRISPR-Cas系统中的应用。
7.一种新颖的CRISPR-Cas系统，其特征在于，来源于权利要求1所述的深渊盐生单胞菌13199。
8.权利要求7所述的CRISPR-Cas系统的cas1、cas3、csy1、csy2、csy3和cas6/csy4表达的蛋白产物和包含这些蛋白产物的各种生物制剂。
9.一株权利要求1所述的深渊盐生单胞菌13199及其培养物、细胞内容物、细菌菌株的菌液、发酵培养液及培养液的过滤液在重金属污染环境修复制剂中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的重金属为铜离子、铬离子或汞离子中的任意一种或多种。
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