CN104026009A - 一种紫色马铃薯试管微型薯诱导的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种紫色马铃薯试管微型薯诱导的方法，步骤如下：（1）无菌苗培养：将带有腋芽的无菌脱毒紫色马铃薯苗茎段进行无菌苗培养；（2）试管薯诱导成苗：将步骤（1）制备的无菌苗剪成单叶单节茎段，接种到固体培养基中，在培养器皿中诱导成苗；（3）试管薯诱导成薯：在步骤（2）的培养器皿中加入液体诱导液诱导成薯。本发明的方法同比其它诱导方式和条件，所获得的试管薯在薯重、大薯率上均大幅度提高。这为紫色马铃薯种薯的工厂化繁殖创造了条件，该方法可在实验室、符合条件的温室、育苗厂房实施微型种薯繁殖。
Description
技术领域
本发明属于组织培养，生物技术育种领域，具体涉及一种紫色马铃薯试管微型薯诱导的方法。
背景技术
紫色马铃薯除了含有普通马铃薯所具有的一切营养成分外，还含有丰富的原花青素，是维护人体健康最直接、最有效、最安全的自由基清除剂。紫色马铃薯作为一种具有保健功效的特用马铃薯品种，随着人们保健观念的不断增强，近几年发展迅速，市场前景广阔。但是，紫色马铃薯罹患病毒的退化速度较其它马铃薯品种较快，因此，建立规范科学的脱毒繁育体系是保障紫色马铃薯产业健康发展的重要手段。
选育无病毒种薯是目前防止马铃薯退化最有效的措施。马铃薯试管微型薯（简称试管薯）是利用脱毒试管苗生产出来的无病毒种薯，是继脱毒试管苗之后发展出的保存种质和生产无病毒种薯的新形式。试管薯具有体积小，重量轻，生产不受季节限制，设备简单、成本低、便于工厂化生产和长途运输等优点，在种质资源的保存交换和脱毒薯的推广应用方面具有十分重要的意义。
试管薯作为马铃薯种质资源的重要保存方式、交换及脱毒种薯的生产方式得到应用，但是在实际应用过程中，不同品种在外源激素、营养液配方以及不同诱导方式上等仍然存在着较大差别。迄今有关试管薯的形成报道虽然很多，但多数研究仅在肉色为黄色、白色马铃薯品种上开展的，关于紫色马铃薯试管薯诱导的成熟体系，研究和报道的目前尚很少。
发明内容
本发明提供了一种紫色马铃薯试管微型薯诱导的方法，为紫色马铃薯试管微型薯的诱导和生产提供了一条切实可行的途径。
本发明的一种紫色马铃薯试管微型薯诱导的方法，步骤如下：
（1）无菌苗培养：将带有腋芽的无菌脱毒紫色马铃薯苗茎段进行无菌苗培养；
（2）试管薯诱导成苗：将步骤（1）制备的无菌苗剪成茎段，接种到固体培养基中，在培养器皿中诱导成苗；
（3）试管薯诱导成薯：在步骤（2）的培养器皿中加入液体诱导液诱导成薯。
优选地，步骤（2）中所述固体培养基为含有3%白糖的MS固体培养基。
优选地，步骤（3）中所述的液体诱导液为含8-14%白糖液体的MS液体培养基。
优选地，步骤（2）中试管薯诱导成苗培养时间为20-25天。
优选地，步骤（2）中试管薯诱导成苗阶段培养条件为：25±1℃，光照强度2000Lx，光照16h/d。
优选地，步骤（3）中所述试管薯诱导成薯培养时间为50-55天。
优选地，步骤（3）中所述试管薯诱导成薯的培养条件为黑暗培养。
优选地，步骤（2）中所述培养器皿为220ml培养瓶或150ml三角瓶，每瓶茎段接种数量为10-15株。
优选地，步骤（2）中所述茎段为单叶单节茎段。
本发明的方法首先找到紫色马铃薯试管薯发生的最佳诱导方式；其次确定出最佳的诱导基质、苗龄、诱导条件和诱导周期，使得紫色马铃薯试管薯发生，结薯率达100％，同比其它诱导方式和条件，所获得的的试管薯在薯重、大薯率上均大幅度提高。这为紫色马铃薯种薯的工厂化繁殖创造了条件，该方法可在实验室、符合条件的温室、育苗厂房实施微型种薯繁殖。
本发明提供的紫色马铃薯试管微型薯诱导的方法，采用的先培养成苗再加入诱导液体诱导结薯的固液诱导方法，此方法植株的生根生长正常，结薯数量多，薯重和大薯率都较高。采用的220ml培养瓶（或150ml三角瓶）和接种密度为每瓶10—15株茎段，能够最大化的使用有限的空间和培养基养份，而不影响试管薯品质。采用的无菌苗光照培养天数，即苗龄是20—25天，以及后期诱导结薯的时间是50—55天，都是使得试管薯既能很好的产生，又缩短了诱薯周期。采用的诱导液是MS+（8—14）%白糖液体，此诱导液简单、经济，所诱导的试管薯各方面品质都有所提高。
综上所述，本发明充分考虑了诱导方式、诱导液、诱导时间以及诱导条件等对紫色马铃薯试管薯发生的影响，通过对试管薯诱导产生方法的确定，又对诱导液、诱导条件和诱导时间的优化确定，获得了一套适于紫色马铃薯试管薯诱导产生的成熟方法。对紫色马铃薯的推广和工厂化生产具有实践应用价值。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。如无特殊说明，本发明中“%”指质量百分数。
本发明中涉及的MS培养基，为常规培养基，配置后在高温灭菌锅灭菌后备用，MS培养基母液的成分如表1所示：
。
MS固体培养基：MS培养基母液成分+白糖若干+0.1g肌醇+4.5g琼脂粉，自来水定容至1L。（其中白糖含量会根据实验需要有所变化，文中已标注清楚）
MS液体培养基：MS培养基母液成分+白糖若干+0.1g肌醇，自来水定容至1L。（其中白糖含量会根据实验需要有所变化，文中已标注清楚）
本申请人对诱导方法中各参数的优化试验如下：
（1）供试材料：1、无菌脱毒紫色肉质马铃薯“03-1”试管苗；2、无菌脱毒紫色马铃薯“黑美人”试管苗；3、无菌脱毒紫色马铃薯“03-2”试管苗。
（2）无菌苗培养：将带有一个腋芽的无菌脱毒紫色马铃薯试管苗茎段接种于装有30ml的MS固体培养基中，每瓶15个茎段。所述MS固体培养基中含3%白糖，pH5.8。培养室温度25±1℃，光照强度2000Lx，光照16h/d，培养25-30天。
（3）试管薯诱导方式设置：①固体诱导法：将无菌苗培养后的脱毒试管苗剪成2叶2节茎段，无菌条件下接种至MS固体培养基+8%白糖中。②固液诱导法：将无菌苗培养后的脱毒试管苗剪成单叶单节茎段，无菌条件下接种到装有含3%白糖的MS固体培养基中，先在25±1℃，光照强度2000Lx，光照16h/d，培养20-25天，成苗后，往培养瓶中加入8%白糖溶液20ml。③液体诱导法：将无菌苗培养后的脱毒试管苗剪成2叶2节茎段，无菌条件下接种至含8%白糖的MS液体培养基中。
（4）诱导液设置：①含8%白糖的MS液体培养基；②含8%白糖的MS液体培养基+30mg/L香豆素；③8%白糖溶液；④含10%白糖的MS液体培养基；⑤12%白糖溶液；⑥14%白糖溶液；⑦16%白糖溶液。
（5）试管薯诱导中苗龄设置（即试管薯诱导中光照诱导成苗阶段的时间）：①20d；②25d；③30d；④35d；⑤40d；
（6）培养器皿设置：①100ml三角瓶；②150ml三角瓶；③220ml培养瓶。
（7）接种密度设置：① 10株/瓶；②15株/瓶；③20株/瓶。
（8）光周期设置：①8h、2000lux光照；②12h、2000lux光照；③16h、2000lux光照；④全自然光照；⑤全黑暗。
（9）黑暗诱导成薯时间设置：①45d；②50d；③55d；④60d。
试验统计内容包括：结薯数量（≧3mm）（粒/瓶）、薯重（g/瓶）、薯块直径（cm）、大薯率（%）（每瓶大薯数/每瓶结薯总数）等，薯块直径用游标卡尺测量，利用Excel和DPS(7.0)软件处理与分析数据。试验经过和最佳试验数据对应的配置分别参见表2和表3。
表2 优化实验
。
表3 最优实验结果
。
实验结果表明，诱导方式中固液诱导方式是最好的，液体诱导和固体诱导中试管苗的形成就比较困难，而固液诱导方式中试管苗生长健壮，形成的试管薯结薯率可达100%，较其它方式提高了75%以上，薯重平均提高6倍以上，大薯率提高了5倍。诱导液相比较，白糖含量在8-14%之间，且和MS液体培养基搭配使用，对试管薯的薯重会有所提高，能提高25%。苗龄以20d和25d的植株诱导结薯效果为较好，较其它苗龄结薯数提高54%。培养器皿以空间较大的150ml三角瓶和220ml培养瓶为宜，在有限的空间和营养成分条件下，相应的接种密度为10-15株/瓶的范围较好，使得试管薯薯重和大薯率保持在最佳状态。黑暗条件下使得试管薯发生可以提早5-7天发生。诱导成薯天数在50-55天，大薯率能够提高30%。
根据上述试验，本发明的一种紫色马铃薯试管薯诱导的方法步骤如下：
（1）无菌苗培养：将带有腋芽的无菌脱毒紫色马铃薯苗茎段接种于MS固体培养基中；所述MS固体培养基中含3%白糖，pH5.8；培养室温度25±1℃，光照强度2000Lx，光照16h/d，培养25-30天；
（2）试管薯诱导成苗阶段：将上述步骤（1）中生长所得的无菌苗剪成单叶单节茎段，接种到含3%白糖的MS固体培养基中，220ml的培养瓶（或150ml的三角瓶），每瓶10-15株茎段，在25±1℃，光照强度2000Lx，光照16h/d，培养20-25天，使茎段长成完整植株；
（3）试管薯诱导成薯阶段：上述步骤（2）中诱导成苗后，在成苗的培养瓶中加入液体诱导液：含（8-14）%白糖液体的MS液体培养基，黑暗培养，19±1℃，诱导50-55天，得到紫色马铃薯试管薯。
以下通过具体实施例进一步解释本发明。
实施例1
本发明的一种紫色马铃薯试管薯诱导的方法步骤如下：
（1）无菌苗培养：将带有腋芽的无菌脱毒紫色肉质马铃薯“03-1”试管苗茎段接种于MS固体培养基中；所述MS固体培养基中含3%白糖，pH5.8；培养室温度25±1℃，光照强度2000Lx，光照16h/d，培养28天；
（2）试管薯诱导成苗阶段：将上述步骤（1）中生长所得的无菌苗剪成单叶单节茎段，接种到含3%白糖的MS固体培养基中，220ml的培养瓶，每瓶15株茎段，在25±1℃，光照强度2000Lx，光照16h/d，培养25天，使茎段长成完整植株；
（3）试管薯诱导成薯阶段：上述步骤（2）中诱导成苗后，在成苗的培养瓶中加入液体诱导液：含8%白糖液体的MS液体培养基，黑暗培养，19±1℃，诱导55天，得到紫色马铃薯试管薯。
实施例2
本发明的一种紫色马铃薯试管薯诱导的方法步骤如下：
（1）无菌苗培养：将带有腋芽的无菌脱毒紫色马铃薯“黑美人”试管苗茎段接种于MS固体培养基中；所述MS固体培养基中含3%白糖，pH5.8；培养室温度25±1℃，光照强度2000Lx，光照16h/d，培养25天；
（2）试管薯诱导成苗阶段：将上述步骤（1）中生长所得的无菌苗剪成单叶单节茎段，接种到含3%白糖的MS固体培养基中，150ml的三角瓶，每瓶10株茎段，在25±1℃，光照强度2000Lx，光照16h/d，培养20天，使茎段长成完整植株；
（3）试管薯诱导成薯阶段：上述步骤（2）中诱导成苗后，在成苗的培养瓶中加入液体诱导液：含14%白糖液体的MS液体培养基，黑暗培养，19±1℃，诱导50天，得到紫色马铃薯试管薯。
实施例3
本发明的一种紫色马铃薯试管薯诱导的方法步骤如下：
（1）无菌苗培养：将带有腋芽的无菌脱毒紫色马铃薯“03-2”试管苗茎段接种于MS固体培养基中；所述MS固体培养基中含3%白糖，pH5.8；培养室温度25±1℃，光照强度2000Lx，光照16h/d，培养30天；
（2）试管薯诱导成苗阶段：将上述步骤（1）中生长所得的无菌苗剪成单叶单节茎段，接种到含3%白糖的MS固体培养基中，220ml的培养瓶，每瓶12株茎段，在25±1℃，光照强度2000Lx，光照16h/d，培养22天，使茎段长成完整植株；
（3）试管薯诱导成薯阶段：上述步骤（2）中诱导成苗后，在成苗的培养瓶中加入液体诱导液：含10%白糖液体的MS液体培养基，黑暗培养，19±1℃，诱导52天，得到紫色马铃薯试管薯。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种紫色马铃薯试管微型薯诱导的方法，步骤如下：
（1）无菌苗培养：将带有腋芽的无菌脱毒紫色马铃薯苗茎段进行无菌苗培养；
（2）试管薯诱导成苗：将步骤（1）制备的无菌苗剪成茎段，接种到固体培养基中，在培养器皿中诱导成苗；
（3）试管薯诱导成薯：在步骤（2）的培养器皿中加入液体诱导液诱导成薯。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述固体培养基为含有3%白糖的MS固体培养基。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的液体诱导液为含8-14%白糖液体的MS液体培养基。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中试管薯诱导成苗培养时间为20-25天。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中试管薯诱导成苗阶段培养条件为：25±1℃，光照强度2000Lx，光照16h/d。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中所述试管薯诱导成薯培养时间为50-55天。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中所述试管薯诱导成薯的培养条件为黑暗培养。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述培养器皿为220ml培养瓶或150ml三角瓶，每瓶茎段接种数量为10-15株。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述茎段为单叶单节茎段。
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