CN104024421B - 二萜化合物、美白剂及二萜化合物的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种以下述式(VII)表示的二萜化合物,是美白效果优异的新型二萜化合物。本发明提供基于新型二萜化合物的美白剂及新型二萜化合物的制造方法。可以将甜叶菊植物或甜叶菊植物提取物进行酵母菌发酵而调制甜叶菊酵母菌发酵物,该化合物可以作为美白剂使用。
Description
技术领域
本发明涉及新型二萜化合物、以新型二萜化合物作为有效成分的美白剂、以及所述二萜化合物的制造方法。
背景技术
皮肤的颜色依赖于存在于皮肤中的黑色素。可以认为,老年斑、雀斑或日晒后的色素沉着是因紫外线等而过量地生成的黑色素沉着于表皮的结果所造成的。当酪氨酸酶作用于存在于黑色素细胞中的酪氨酸时,就会变为多巴、多巴醌、多巴色素、吲哚醌,最终氧化、聚合而成为黑褐色的黑色素。由此,作为抑制体内的老年斑、雀斑的生成本身的成分,可以认为是要阻碍黑色素生成过程、或将已经生成的黑色素淡白化或漂白。作为阻碍酪氨酸酶活性的物质,已知有曲酸、鞣花酸、谷胱甘肽等硫化合物或氢醌制剂,作为将已经生成的黑色素淡白化或漂白的物质,已知有过氧化氢、抗坏血酸或其衍生物。此外,作为具有黑色素产生抑制作用的物质,可以将作为局部结构含有1-ene-3-ol的橙花叔醇、异植醇、四甲基十六碳四烯醇等化合物(专利文献1)、或以泪柏醇(manool)作为起始物质合成的13-氧代-14,15-二去甲-8-(17)-半日花烷(专利文献2)等作为黑色素产生抑制剂使用。
另一方面,有过在甜叶菊提取物中含有美白成分的报告(专利文献3)。甜叶菊是原产南美的菊科甜叶菊属的多年生草本,作为甜味成分,包含具有蔗糖的300倍的甜度的甜菊醇配糖体,是作为砂糖的替代物用于节食用食品或糖尿病患者用菜单等中的植物。在所述甜菊醇配糖体中,含有甜菊糖苷、甜菊双糖苷A、甜菊双糖苷C、以及杜尔可苷A等成分。专利文献3中公开有如下的内容,即,对甜叶菊的叶子(干燥物)的水提取成分、50%乙醇提取成分及乙醇提取成分的酪氨酸酶活性阻碍率进行了评价,酪氨酸活性阻碍率分别约为50~58%,相对于皮肤来说的安全性及美白作用优异。
另外,还有含有甜叶菊的提取物的黑色素生成抑制剂(专利文献4)。评价了将甜叶菊的叶子及茎的粉碎物用50%乙醇溶液提取而得的提取液的黑色素生成抑制率,其结果是约为20%,该抑制效果可以说比黑色素生成抑制率约为10%的曲酸更加优异。
此外,还有由黄烷酮G、矢车菊黄素(centaureidin)和抗坏血酸构成的美白化妆品(专利文献5)。矢车菊黄素可以从甜叶菊或西洋蓍草(yarrow)、雪莲果(yacon)等中提取,从5kg的甜叶菊的根茎中得到1.6g的含有矢车菊黄素的无定形物。上述美白化妆品利用矢车菊黄素和黄烷酮G,提高抗坏血酸类的黑色素产生抑制作用,具有预防、改善伴随着炎症的色素异常的效果,作为次要的效果可以说是,在炎症平定之后,皮肤表面状态也会明显地改善。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本专利第3236130号公报
专利文献2:日本专利第4235602号公报
专利文献3:日本特开平9-77636号公报
专利文献4:日本特开平11-335233号公报
专利文献5:日本专利第4471722号公报
发明内容
发明的概要
发明所要解决的问题
但是,上述的借助曲酸、鞣花酸等得到的黑色素合成抑制效果极低。当为了获得足够的效果而提高含量时,就会有存在由溶解度等造成的配合的极限的情况。另外,专利文献1、专利文献2中记载的成分是合成品。美白成分等是作用于人的皮肤的物质,因而优选使用来源于天然物的成分,安全性优异。
所以,为了确保安全性而着眼于可以食用的甜叶菊时,即如所述专利文献3或专利文献4中所示,甜叶菊干燥叶的乙醇提取物的酪氨酸活性阻碍作用是公知的。这里,在用于直接涂布在皮肤等上的外用剂中的情况下,优选使用不含有其他的夹杂物的纯粹的成分,这样也可以除去过敏成分等。但是,专利文献3是将乙醇提取液的冷冻干燥物原样不变地使用而算出酪氨酸酶活性阻碍率,没有特别规定为化合物。另外,专利文献4也没有公示出具体的化合物。所以,希望开发出美白效果优异的新型化合物。
此外,专利文献5的特征在于,是通过将由从甜叶菊中提取的矢车菊黄素、从豆科植物中提取的黄烷酮G、以及抗坏血酸得到的黑色素产生抑制作用并用而借助复合成分产生的效果,并非矢车菊黄素等成分单独地具有黑色素产生抑制效果。所以,希望开发出单独地具有美白效果的新型化合物。
另外,美白剂被作为基础化妆品或彩妆化妆品用于多个方面,最好可以稳定地供给。所以,希望开发出廉价的制造方法。
鉴于上述现状,本发明的目的在于,提供一种安全性及美白效果优异的新型化合物。
另外,本发明的目的还在于,提供一种以美白效果优异的新型化合物作为有效成分的美白剂。
此外,本发明的目的还在于,提供一种美白效果优异的新型化合物的制造方法。
用于解决问题的方法
本发明人等对甜叶菊植物进行了详细研究,结果发现,在将甜叶菊植物用酵母菌发酵而得的发酵液中含有与甜叶菊植物不同的成分,在甜叶菊酵母发酵液中,含有发挥出极高的黑色素产生抑制效果的二萜化合物,该化合物的细胞毒性低,可以作为美白剂使用,从而完成了本发明。
即,本发明提供以下述式(VII)表示的二萜化合物、或它们的在医学上可以容许的盐。
[化1]
另外,本发明还提供将以上述式(VII)表示的二萜化合物、或它们的在医学上可以容许的盐作为有效成分的美白剂。
另外,本发明还提供所述二萜化合物的制造方法,其特征在于,将甜叶菊植物或甜叶菊植物萃取物用酵母菌发酵而制造甜叶菊酵母菌发酵物,从所述甜叶菊酵母菌发酵物中回收以上述式(VII)表示的二萜化合物。
发明的效果
根据本发明,可以提供以上述式(VII)表示的新型二萜化合物。该化合物的黑色素产生抑制效果优异,可以作为美白剂使用。
附图说明
图1是说明在实施例1中制造以式(VII)表示的化合物时的分离工序及产量的图。
具体实施方式
本发明的第一发明是由下述式(VII)表示的二萜化合物、或它们的在医学上可以容许的盐。
[化2]
本发明中,所谓“在医学上可以容许的盐”是指,是在药理学上可以容许、并且对于被给药的受试者几乎无毒的本发明的化合物的盐形态。在上述二萜化合物的在医药上可以容许的盐中,有由恰当的无毒的有机酸或无机酸或无机碱形成的以往的化学计量的酸追加盐或碱追加盐。恰当的无机酸例如为盐酸、硫酸、或磷酸等氢卤酸。恰当的有机酸例如为羧酸、膦酸、或磺酸,例如为乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、羟基丁酸、苹果酸、马来酸、丙二酸、水杨酸、富马酸、琥珀酸、己二酸、酒石酸、柠檬酸、戊二酸、2-或3-甘油磷酸、以及本领域人员所周知的其他的无机物的酸。对于盐,由于是利用以往的方式生成盐,因此可以通过使自由碱的形态与足够量的所需的酸接触来制造。包含酸性取代基的化合物也可以利用无机碱或有机碱来形成盐。在适合形成盐的碱的例子中,作为并非限定性的例子,有碱或碱土类金属(例如钠、钾、锂、钙、或镁)氢氧化物等无机碱、以及由氢氧化铵导出的物质(例如四甲基氢氧化铵等季铵盐氢氧化物)。另外,还可以考虑由氨、烷基胺、羟基烷基胺、N-甲基葡糖胺、苄胺、哌啶、以及吡咯烷酮等在医药上可以容许的胺形成的盐。具有羧基或苯酚性羟基的化合物等某些化合物是酸性。苯酚的盐可以通过利用本领域人员所周知的手续,与上述的碱的任意一种一起加热酸性化合物来制成。
虽然上述化合物可以利用化学合成来制造,然而例如可以从甜叶菊植物的酵母发酵物中提取。也可以取代甜叶菊植物,而使用预先从甜叶菊植物中用水等溶剂提取甜菊醇配糖体及其他物质而得的甜叶菊植物提取物。即,本发明的第二发明提供一种二萜化合物的制造方法,其特征在于,将甜叶菊植物或甜叶菊植物提取物用酵母菌发酵而调制甜叶菊酵母菌发酵物,从所述甜叶菊酵母菌发酵物中回收以上述式(VII)表示的二萜化合物。
酵母是从糖分中排出醇和二氧化碳气体的微生物,利用该作用可以制作日本酒、啤酒、葡萄酒等酒类、味增、酱油、奶酪、泡菜等发酵食品、面包等。本发明中,详细地分析了将甜叶菊植物利用酵母发酵而得的酵母发酵液,其结果是,发现产生了以上述式(VII)表示的二萜化合物,它是不存在于甜叶菊植物中的成分,美白作用极为优异。作为酵母,优选使用酵母属(Saccharomyces)类。
本发明中使用的甜叶菊植物(学名:Stevia rebaudiana)是原产南美的菊科甜叶菊属的多年生草本。从甜叶菊植物中提取的甜菊糖苷、甜菊双糖苷A等甜菊醇配糖体被作为甜味料使用,现在在日本、中国、韩国等亚洲地区也有栽培。本发明中,特别可以优选使用甜叶菊(Stevia Rebaudiana Bertoni)及其类缘植物。作为甜叶菊植物,也可以使用甜叶菊植物的茎、叶、含苞待放前的全草、成熟了的植物的根或花。
成为发酵的对象的所谓“甜叶菊植物提取物”,是从甜叶菊植物中用水或其他溶剂提取特定成分而得的提取物。甜叶菊植物包含可以作为甜味料使用的甜菊醇配糖体,有从甜叶菊植物中用水等高浓度地提取甜菊醇配糖体而得的粗甜菊醇配糖体等。本发明中,作为甜叶菊植物提取物,可以使用此种粗甜菊醇配糖体。本发明中,即使向此种甜叶菊植物提取物中添加酵母菌而使之发酵,也可以从该发酵物中回收上述二萜化合物。
上述甜叶菊植物可以直接以生的状态不变地使用适期采收的,也可以使用采收后干燥了的。干燥物的保存性优异,因而合适。将干燥甜叶菊植物利用切割、粉碎及其他操作细切或粉碎为给定尺寸,向所得的物质中加入酵母菌而搅拌时,就会开始发酵。甜叶菊植物优选选择使用叶部及茎部。
在以干燥物为原料的情况下,可以通过向细切或粉碎了的干燥甜叶菊粉末中加入水和酵母后搅拌、放置来进行。加入的水的量只要有对于发酵所必需的量即可,如果是将整体湿润的程度的量则足够。发酵前的甜叶菊植物因甜菊醇配糖体而具有甜味,而随着发酵的进行,甜味消失。本发明中,以甜味的消失作为发酵末期的标志。此种甜味的消失在常温下为2~3周。而且,酵母菌除了在发酵最初添加以外,也可以在发酵的途中追加。
本发明中,除了向甜叶菊植物中添加酵母菌而进行发酵以外,也可以将粉碎干燥甜叶菊植物后煮沸提取而得的煮沸提取液、或浸渍于温水中而得的浸渍液、从甜叶菊植物中用水或其他溶剂提取的给定的级分作为甜叶菊植物提取物使用,向其中添加上述酵母菌而使之发酵。该情况下,也可以利用甜味的消失来确认发酵的末期。
然后,将上述甜叶菊酵母发酵物干燥。在甜叶菊酵母发酵物中含有酵母菌,然而通过将其干燥,就可以终止酵母菌的活性。干燥优选利用风干、自然干燥或其他方法,在5~35℃的温度范围中干燥。可以避免甜叶菊酵母发酵物中所含的化合物的分解、变质或其他情况。
在甜叶菊酵母发酵物中,含有本发明的上述二萜化合物。
作为该二萜化合物的提取溶剂,既可以使用极性溶剂、非极性溶剂的任意一种,也可以将它们混合使用。作为提取溶剂,除了水以外,还有甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等碳数1~12的也可以具有支链的醇类;乙二醇、丙二醇、丁二醇等多元醇类;丙酮、甲乙酮等酮类;乙酸甲酯、乙酸乙酯等酯类;四氢呋喃、二乙醚等醚类;聚乙二醇等聚醚类;二氯甲烷、氯仿、四氯化碳等卤化烃类;己烷、环己烷、石油醚等烃类;苯、甲苯等芳香族烃类;吡啶类;超临界二氧化碳;油脂、石蜡或其他油类。它们既可以单独使用,也可以组合使用。
本发明中,优选使用醇。作为醇,适合为碳数1~5的一元醇。其中,特别优选为乙醇。醇也可以是含有水的含水醇。使用含水醇时的醇浓度优选为30~99(v/v)%,更优选为50~90(v/v)%。对于借助醇或含水醇的提取,适合为相对于上述甜叶菊酵母发酵物1质量份(干燥重量)添加0.1~100质量份、优选为1~50质量份的溶剂,在5~35℃的温度下浸渍3~30天。
向醇或含水醇中浸渍后,利用离心分离或过滤等将固形物与提取液分离。在提取液中含有本发明的二萜化合物。例如,除去提取液的溶媒,可以将液液分配、柱色谱、液相色谱、凝胶过滤、活性炭处理、精密蒸馏或其他方法单独地、或组合多种地进行。这些方法可以根据所用的提取溶剂的种类或其他性质适当地选择。由于上述二萜化合物是亲油性成分,因此可以适于能够溶解上述二萜化合物的亲油性溶媒来提取,通过将该提取物提纯而有效地分离出上述二萜化合物。
作为能够溶解此种二萜化合物的亲油性溶媒,有二氯甲烷、氯仿、四氯化碳等卤化烃类;己烷、环己烷、石油醚等烃类;苯、甲苯等芳香族烃类。本发明中,可以合适地使用氯仿。这是因为,如果利用溶媒提取,则可以适用于大容量,并且二萜化合物的回收率优异。亲油性溶媒提取液可以除去溶媒而作为亲油性级分使用,然而也可以将亲油性溶媒提取液水洗,然后除去亲油性溶媒而作为亲油性级分。
而且,也可以取代亲油性溶媒,而是用亲油性溶媒-亲水性溶媒混合液来提取,所述亲油性溶媒-亲水性溶媒混合液是相对于亲油性溶媒100质量份,在60~100容量份的范围中添加了水、甲醇或乙醇等碳数1~3的醇类;乙二醇等多元醇类;丙酮、甲乙酮等酮类;乙酸甲酯、乙酸乙酯等酯类;四氢呋喃、二乙醚等醚类;它们的混合物;其他的亲水性溶媒而得的。亲油性溶媒和亲水性溶媒因混合后的静置而有分离为两层的情况,通过将此种亲油性溶媒和亲水性溶媒组合,可以在将目标物转移到亲油性溶媒层的同时,将甜叶菊酵母发酵物中所含的乙酸或其他的水溶性成分转移到亲水性溶媒层。作为此种亲油性溶媒有氯仿,作为亲水性溶媒,有水、甲醇。当将氯仿与水以9:3.5~5(容量比)混合了的混合液在提取后放置时,就会分离为氯仿层和水层,因此可以在氯仿层中回收目标成分的同时,将亲水性溶媒转移到水层,简便地进行与水溶性成分的分离。
可以从亲油性级分中利用公知的方法回收本发明的新型二萜化合物。提纯例如也可以利用硅胶柱层析或反相柱,基于极性的差别将上述二萜化合物与其他的成分分离,或者利用分子量进行分离,或者使用多种溶解性不同的溶媒而进行基于溶解度的差别的提纯等。本发明的二萜化合物由于黑色素产生抑制效果优异,因此可以对各级分利用TLC或其他方法确认夹杂物的有无,或同时地评价黑色素产生抑制效果,将其作为指标来提纯目标成分。
本发明的第三发明提供一种将以上述式(VII)表示的二萜化合物作为有效成分的美白剂。本发明的第一发明的二萜化合物如后述的实施例所示,黑色素产生抑制效果优异,并且细胞毒性低。由此,上述化合物可以作为黑色素产生抑制剂或美白剂使用。本发明的美白剂除了涂布等经皮给药以外,也可以是口腔内给药或舌下给药等经口给药。
作为美白剂的外用的剂型,有软膏、液剂、喷雾剂、硬膏、油脂、粉末剂等。作为美白剂,也可以是化妆水、乳液、乳霜、面膜等基础化妆品、底妆、防晒霜、粉底、白粉等彩妆化妆品、洗发水、洗面乳等洗净剂等。上述二萜化合物相对于这些美白剂的配合量可以根据基材适当地选择,然而可以是0.000001~20质量%,优选为0.00001~10质量%,更优选为0.0001~5质量%,特别优选为0.0001~3质量%。
对于构成美白剂的其他成分,可以根据剂型或其他方面配合通常的化妆品、医药部外品、医药品等配合到美白剂中的成分。作为此种成分,有对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯氧基乙醇、百里酚等防腐剂、亚硫酸氢钠、抗坏血酸、生育酚、二丁基羟基甲苯、乙二胺四乙酸钠水合物、苯并三唑等抗氧化剂、单硬脂酸甘油酯、失水山梨醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯固化蓖麻油60、聚山梨醇酯60等表面活性剂、柠檬酸水合物、柠檬酸钠水合物、酵母、二异丙醇胺、乙酸、乙酸钠水合物等pH调节剂、保湿剂、增稠剂、无机填充剂、着色剂、香料、紫外线吸收剂、细胞活化剂、各种皮肤营养成分等。此外还可以适当地添加基材等,制备成外用液剂、外用固形剂、喷雾剂、软膏剂、乳霜剂、凝胶剂、贴附剂、或其他的任意形式。
实施例
(实施例1)
(1)甜叶菊酵母发酵物的制备
将日本北海道产的甜叶菊植物(学名:Stevia rebaudiana)的茎和叶干燥,将所得的干燥甜叶菊植物粉碎为约1cm以下。向粉碎甜叶菊植物2,000g中加入酵母菌(Saccharomyces)45g、水4,500g,在温度为25~35℃的条件下搅拌时,即开始发酵。将其在温度25~35℃下静置14天而使之发酵。甜味从发酵物中消失,将其设为发酵末期。将上述的发酵物在温度25~35℃下干燥10天,停止酵母发酵。
(2)含水乙醇提取
向10质量倍量的28.5(v/v)%乙醇中加入所述干燥发酵物的全部量,在温和地搅拌的同时,在常温下浸润数天。浸润后,以140目左右的大小过滤。将所得的液体在60℃左右减压浓缩(60mmHg),吸附在Diaion HP20色谱柱上后用85.5%含水乙醇液溶出,将其作为含水乙醇提取液。
(3)氯仿提取
将上述含水乙醇提取液的蒸馏除去了溶媒的提取物(40g)作为甜叶菊发酵精华,向其中加入氯仿1000mL,在温度23~28℃(室温)下提取。利用过滤除去残渣,分出氯仿层,将蒸馏除去了溶媒的物质作为氯仿提取液(12.1g)。
(4)目标物的分离
将上述(3)中得到的氯仿提取液(12.1g)利用下式分离条件(1)中所示的硅胶柱层析分离为10个级分。
分离条件(1):
柱子:内径7cm、高22cm
填充物:硅胶(KANTO CHEMICAL公司制、Silica Gel60N(球状,中性)、粒径63~210μm)、320g
溶出溶媒:以氯仿:甲醇=100:1→50:1→30:1→15:1→7:1→5:1→0:1的混合溶液作为洗脱液,依次在柱子中每次各流过溶媒1000mL,每次200mL地分出。
分出物:对分出的各烧瓶内容物进行了TLC(MERCK Silica Gel60F254)。TLC是在用氯仿:甲醇=10:1的溶媒展开后,用50%硫酸喷雾,在110℃下加热后检测。基于检测结果,分级为斑点近似的a~j的10个级分。将各级分的产量表示于图1中。
将d级分(1,784mg)利用下述分离条件(2)中所示的硅胶柱层析分离为6个级分。
分离条件(2):
柱子:内径5.2cm、高20cm
填充物:硅胶(KANTO CHEMICAL公司制、Silica Gel60N(球状,中性)、粒径63~210μm)、160g
溶出溶媒:以正己烷:丙酮=7:1→4:1→2:1→1:1→0:1的混合溶液作为洗脱液,依次在柱子中每次各流过溶媒700mL,每次150mL地分出。
分出物:对分出的各烧瓶内容物进行了TLC(MERCK Silica Gel60F254)。TLC是在用氯仿:甲醇=10:1的溶媒展开后,用50%硫酸喷雾,在110℃下加热后检测。基于检测结果,分级为斑点近似的d-1~d-6的6个级分。由于d-4级分产生了沉淀,因此将其滤掉。由于在d-4级分的滤液(d-4-fil.)和d-5级分中,确认有TLC的RF值近似的斑点,因此将d-4-fil.与d-5合并。将该级分称作d-(4,5)。d-(4,5)的产量为380.9mg。为了分离出主斑点,进行了以下的分离3。
对d-(4,5)(380.9mg),利用下述分离条件(3)中所示的硅胶柱层析分离为7个级分。
分离条件(3):
柱子:内径1.0cm、高21cm
填充物:硅胶(YMC GEL ODS-A、12nm、S-75μm、AA12S75)、16g
溶出溶媒:以水:甲醇=5:5(100mL)→4:6(100mL)→3:7(100mL)→2:8(100mL)→0:1(100mL)的混合溶液作为洗脱液,依次在柱子中每次各流过溶媒700mL,每次20mL地分出。
分出物:对分出的各烧瓶内容物进行了TLC(MERCK Silica Gel60F254)。TLC是在用水:甲醇=2:8的溶媒展开后,用50%硫酸喷雾,在110℃下加热后检测。基于检测结果,分级为斑点近似的d-(4,5)-1到d-(4,5)-7的7个级分。在d-(4,5)-3中看到单一斑点,将该级分的溶媒蒸馏除去时,即得到白色粉末(29.1mg)。将该化合物设为Compound VII。
(5)结构确定
对所述白色粉末,测定了1H-NMR及13C-NMR。将结果表示于表1中。根据1H-NMR及13C-NMR的信号图形,碳数为16,推定已经根据甜叶菊有过分离报告的甜叶菊素(sterebin)A与A环、B环具有相同结构,然而推定C环以后的结构不同。所以,详细地研究了HMQC与HMBC的相关性,其结果是,可以看到表1中所示的HMBC相关性,最终确定为下述式(VII)中所示的二萜化合物。而且,在表1的下部表示出该化合物的基本骨架和位置编号。
[表1]
NMR data of Compound VII in CDCl3
[化3]
[化4]
(实施例2)
对实施例1中得到的化合物,依照下述测定方法,依照每单位细胞数的黑色素产生量及相对于对照组来说的黑色素产生率的算出方法,计测B16黑色素瘤细胞生存数,测定每单位溶液中的黑色素产生量,由此算出每单位生细胞中的黑色素产生量(ng/104cells)。另外,算出相对于每单位的对照组的生细胞的黑色素产生量(ng/104cells)来说的由式(VII)的化合物所致的黑色素浓度。将结果表示于表2中。而且,化合物的浓度设为100μM,为了比较,对1000μM的曲酸也同样地处理。
(测定方法)
每单位细胞数的黑色素产生量及相对于对照组来说的黑色素产生率的算出方法依照以下方法。
将用6孔板进行了一夜培养的B16小鼠黑色素瘤细胞的培养基除去,向各孔中各加入2mL的茶碱(作为最终浓度来说是10mM)、加入了目标浓度的样品的10%-FBS-DMEM培养基(用于溶解样品的DMSO的最终浓度为0.1%)。
在37℃、5%CO2存在下培养72小时后,除去培养基,用pH7.4等张磷酸缓冲液(PBS)将细胞漂洗2次。向各孔中各加入200μl的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液而进行胰蛋白酶处理,各添加1ml培养基而将全部量回收到15ml离心管中。将细胞液进行1000rpm、5分钟离心分离,向除去了上清液的细胞中加入2ml的PBS而再次使之悬浊,将其中的200μl转移到微管中,使用细胞计数器(Milipore Corporation制、Sceptor(注册商标))计测出细胞数。将剩下的细胞液再在相同条件下离心分离,去掉上清液,添加1mL的1M的NaOH后在80℃的水浴中处理1小时。使用Immuno Mini NJ-2300(Cosmo Bio Corporation制)在波长475nm下测定细胞溶解液的浓度的吸光度,算出每单位细胞数的黑色素产生量。在标准线中使用了溶解于1M NaOH中的合成黑色素(Sigma Aldrich Corporation制)。数据以将对照(使用添加1mM胰蛋白酶的培养基)组的值设为100%的每单位细胞数的黑色素产生率及生细胞数率表示,分别以n=3的平均值±标准偏差表示。另外,在统计学的分析中使用了方差分析(ANOVA)及多重比较检定(Dunnet法)。
[表2]
***:与对照的有意差(p<0.001)
本发明并不限定于上述的实施方式,可以进行各种变形及应用。另外,也可以将上述的实施方式的各构成要素自由地组合。
本发明基于2012年11月26日申请的日本专利申请2012-257994号。本说明书中将日本专利申请2012-257994号的说明书、技术方案的范围、附图整体作为参照纳入。
工业上的可利用性
本发明的新型二萜化合物与作为黑色素产生抑制剂已知的曲酸相比黑色素产生率低,可以发挥出优异的美白作用,并且由于是来源于天然物,因此安全性优异,十分有用。
Claims (3)
1.一种以下述式(VII)表示的二萜化合物、或它们的在医学上可以容许的盐:
2.一种美白剂,其由以下述式(VII)表示的二萜化合物、或它们的在医学上可以容许的盐构成:
3.一种二萜化合物的制造方法,其特征在于,
将甜叶菊植物或甜叶菊植物提取物进行酵母菌发酵而调制甜叶菊酵母菌发酵物,
从所述甜叶菊酵母菌发酵物中回收以下述式(VII)表示的二萜化合物:
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