CN104007162B - 一种测量植物根毛细胞膜电位的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种测量植物根毛细胞膜电位的方法，包括以下步骤：利用离子吸收实验获取不同电场强度下离子吸收动力学参数最大离子吸收速率I_max和亲和系数K_m；构建不同电场强度下的离子吸收动力学参数变化曲线；确定不同电场强度下离子吸收动力学参数曲线拐点以及对应电场强度；计算膜电位。本发明设备简单、操作方便、能实现快速无损伤地测量完整植物根毛细胞膜电位，可用于测量不同条件下根毛细胞膜电位。

Description

一种测量植物根毛细胞膜电位的方法

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，尤其涉及一种植物根毛细胞膜电位的测量方法。

背景技术

细胞安静状态下存在于细胞膜两侧的电位差，称为静息电位，或称为膜电位。一些关键离子在细胞内外的不均等分布及选择性的透膜移动，是形成膜电位的基础。细胞对离子的吸附和跨膜运输与细胞膜电位紧密相关，细胞膜电位一定程度上决定了细胞与外界物质交换速率，反应了细胞对于某些营养物质的需求。因而测定植物细胞膜电位对于研究植物在特定条件下的生存状态和营养需求有重要意义。

传统根毛细胞膜电位的测定采用玻璃微电极胞内记录法，用微电极拉制仪拉制微电极，内灌注KCl溶液。将植物根固定在倒置显微镜上，用显微操作系统将微电极刺入根毛细胞内，用膜片钳放大器记录细胞膜的电位变化。该技术对于植物细胞的大小、种类有一定的限制，主要用于单个细胞的膜电位测量，无法测量整个根毛细胞的平均膜电位。再者，在该膜片钳技术中，要求玻璃微电极刺入到合适的细胞位置，操作要求极高，且对于细胞有一定的损伤。此外，在该膜片钳技术中，与微玻管电极尖开口处接触的小片膜周边与微电极开口处的玻璃边沿之间形成紧密的封接，在理想的情况下与其周围的细胞膜在电学上完全分隔才能准确测量膜电位。一般测定很难达到理想状态，因此，通常也会造成了较大的测定误差。加之，上述所叙的膜片钳技术所要求的设备，价格极为昂贵，测定会增加极高的成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种测量植物根毛细胞细胞膜电位的方法，以实现对整个根毛细胞膜电位的无损测定，测定的精度高，成本低。

为了解决以上技术问题，本发明采用的具体技术方案如下：

一种测量植物根毛细胞膜电位的方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一，获取不同电场强度作用下的离子吸收动力学参数。选取长势相似的植物幼苗置于不同电场强度的高压静电场环境下进行离子吸收实验，采用耗竭法获取不同电场强度下的离子吸收动力学参数最大离子吸收速率I_max和亲和系数K_m，在耗竭法中，离子消耗曲线符合改进的Michaelis–Menten方程，如下式所示

$C-C_0=t\·I_{\max }+K_m\ln \frac{c_0}{c}$

C为吸收溶液浓度，C₀为吸收溶液起始浓度，t为吸收时间；

步骤二，构建不同电场强度下的离子吸收动力学参数变化曲线，确定不同电场强度下离子吸收动力学参数曲线拐点以及对应电场强度。从不同电场强度下的离子吸收动力学参数变化曲线中，找出离子吸收动力学参数变化的两个拐点，确定两拐点对应的电场强度，即综合考虑I_max和K_m后，第一个拐点对应电场强度值为E₁，第二个拐点对应电场强度值为E₂；

步骤三，测定根毛细胞半径，计算根毛细胞膜电位V₀，计算公式如下：

V₀＝fg·a(E₁-E₂)/2

a为测得的根毛细胞半径；fg为常数由细胞种类与形状决定，通常植物细胞的fg取0.3；E₁为第一个拐点对应电场强度值，E₂为第一个拐点对应电场强度值。

本发明方法的工作原理如下：细胞膜内的细胞液是导电的电解质，而细胞膜阻抗极大，因此细胞处于静息状态时的电学模型，可视为膜内负外正、电荷均匀分布的球壳，此时膜外空间各点的电势为零。当外加一个大小为E的高压静电场时，细胞上半球发生去极化现象，下半球发生超极化现象。高压静电场下，植物细胞上某一点A处的电位V_m为：

V_m＝V₀-fg·aEcosθ

其中V₀为未加电场时细胞膜电位；fg为常数由细胞种类与形状决定，通常植物细胞的fg取0.3；E为外加电场强度；θ为该点A处半径与电场正极方向半径的夹角。

当电场强度达到某一特定的值，使得V_m的值小于-V_G，这时离子吸收通道打开，外界离子进入细胞。当电场强度达到另一特定值，使得V_m的值大于V_G，这时离子流出通道打开，细胞内离子流出。

本发明具有有益效果。本发明由于采用离子吸收动力学方法，可以快速无损伤地测定根毛细胞膜电位；本发明采用离子吸收动力学方法，无需使用膜片钳，使得操作简单方便，降低了操作难度，消除了微玻管电极尖接触的细胞膜小片与细胞膜主体在电学上未完全分割的系统误差；本发明利用测量植物离子吸收动力学动力学参数求膜电位，不需要昂贵的膜片钳设备，成本低。

附图说明

图1a是未加电场作用的细胞模型示意图；

图1b是外加电场E₀作用下细胞模型示意图；

图1c是外加电场E₁作用下细胞模型示意图；

图1d是外加电场E₂作用下细胞模型示意图；

图2是本发明原理示意图；

图3是本发明装置示意图；

图4是本发明不同电场强度影响下的钾离子吸收动力学参数变化曲线；

图5是本发明不同电场强度影响下的磷酸二氢根离子吸收动力学参数变化曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细说明。

步骤一，不同电场强度作用下的离子吸收动力学参数最大离子吸收速率I_max和亲和系数K_m的获取

采用水培法培养植物幼苗。选取长势相似的幼苗置于不同电场强度的高压静电场环境下进行离子吸收实验，采用耗竭法获取其吸收动力学参数最大离子吸收速率I_max和亲和系数K_m。

举例来说，供试黄瓜品种为“津优一号”，用浓度为5％福尔马林浸泡种子半小时，洗净后置于蒸馏水中浸泡24小时，置于28℃恒温光照培养箱内。使用上述种子以珍珠岩为基质穴盘育苗，温度为25℃±1℃，每天光照16小时并浇灌Hoagland营养液，pH6.5，光照强度600μmol/m²/s。从培养30天大的幼苗中挑选长势相似的幼苗备用。

用两种不同离子的吸收实验举例说明。将挑选的幼苗每十株为一组分别放入盛有50ml1mM特定吸收溶液的100ml烧杯中。其中，例一采用KNO₃，例二采用NH₄H₂PO₄为吸收溶液。如图3所示，将上述烧杯，置于不同强度的高压静电场下进行离子吸收实验，采用耗竭法测量其I_max和K_m。整个实验过程在人工气候室中进行，温度为25℃±1℃，相对湿度50％，光照强度600μmol/m²/s。

从实验开始后10分钟用移液枪取吸收溶液5ml，此后每隔一小时取样一次。每次取样后加入蒸馏水5ml，以保持溶液体积不变。实验进行7小时十分钟，共取样8次。分别使用火焰光度计测量与连续流动分析仪测量吸收液中钾离子与磷酸二氢根离子含量，得到取样时刻吸收溶液中相应离子浓度。

在耗竭法中,随吸收时间的延长,营养液中离子浓度不断降低。离子消耗曲线符合Michaelis–Menten方程，如下式所示：

$I=\frac{I_{\max }\·C}{K_m+C}---\left(1\right)$

其中，C为溶液中相应离子浓度，C₀为吸收溶液起始浓度，I为离子吸收速率，I_max为最大离子吸收速率，K_m为达到最大离子吸收速率一半时，溶液中离子浓度，也即亲和系数。将(1)式变形为：

$\frac{dc}{dt}=\frac{I_{\max }\·C}{K_m+C}---\left(2\right)$

将(2)式变形为：

$\frac{dc(K_m+c)}{c}=dt\·I_{\max }---\left(3\right)$

(3)式积分得：

C+K_mlnC＝t·I_max+B(4)

其中，B为积分常数，t为吸收时间。将实验中第一次取样时的时间设为0时，则当时的溶液浓度为C₀。为消去B，将t＝0,C＝C₀带入(4)式：

$C-C_0=t\·I_{\max }+K_m\ln \frac{c_0}{c}---\left(5\right)$

本例中，钾离子和磷酸二氢根离子吸收情况符合改进的Michaelis–Menten方程，因此可以将测得的不同时间点的这两种离子的浓度值，按照(5)式进行拟合，求出离子吸收动力学参数I_max和K_m。

步骤二、构建不同电场强度影响下的离子吸收动力学参数变化曲线，并确定不同电场强度下离子吸收动力学参数曲线拐点以及对应电场强度。

构建不同电场强度下的I_max和K_m的变化曲线图分别如图4、图5所示。从上述已构建的不同电场强度影响下的离子吸收动力学参数变化曲线中寻找不同电场强度下离子吸收动力学参数变化曲线的两个拐点以及对应电场强度。也即综合考虑I_max和K_m后，第一个拐点对应电场强度值E₁，第二个拐点对应电场强度值为E₂。

例一中，如图4，在外加电场强度为1.0kV/m时出现第一个拐点，也即E₁＝1.0。在外加电场强度为2.0kV/m时出现第二个拐点，也即E₂＝2.0。

例二中，如图5，经综合考虑在外加电场强度为1.0kV/m时出现第一个拐点，也即，E₁＝1.0。在外加电场强度为2.0kV/m时出现第二个拐点，也即E₂＝2.0。

步骤三、测定根毛细胞半径a，依据计算根毛细胞膜电位V₀的公式，计算根毛细胞膜电位V₀。计算根毛细胞膜电位V₀的公式如下：

V₀＝fg·a(E₁-E₂)/2

(6)

(6)式中fg取0.3；a为根毛细胞半径，测定根毛细胞半径为0.4×10^-6m。因此：依据上式计算出试验所用的黄瓜的根毛细胞膜电位

$V_0=\frac{0.2*0.4*{10}^{-6}m*(1.0-2.0)*{10}^{3}mV/m}{2}=-60mV$

测得的结果与其他方法测得的植物细胞膜电位相接近。

高压静电场对于细胞膜电位的影响过程如下：

如图1b所示，当电场强度达到E₀时，细胞最下方点处V_m值小于-V_G，这时离子吸收通道打开，外界离子进入细胞。并且随着电场强度增加吸收区域增加，离子吸收速率增加。

如图1c所示，当电场强度达到E₁时，细胞最上方的点处的V_m值大于V_G，这时离子流出通道刚刚打开，细胞内离子流出。此时细胞对于离子吸收速率达到第一个拐点。随后，随着电场强度增加，离子吸收速率减小。

如图1d所示，当电场强度达到E₂时，离子的吸收速率达到第二个拐点。随后，随着电场强度增加，电穿孔面积增加，离子吸收速率增加。

如图2，植物对于离子的吸收很大程度上决定于植物细胞膜电位，在一定范围内V_m1,V_m2两者呈线性相关。超出该范围离子进出速率达到饱和。

$\left\{\begin{array}{c}-V_G-V_w=V_{m_1}=V_0-{\mathrm{fgaE}}_1\\ V_G+V_w=V_{m_2}=V_0+{\mathrm{fgaE}}_2\\ \frac{v_{m_1}}{v_{m_2}}=-1\end{array}\right.$

因而，

V₀＝fg·a(E₁-E₂)/2

a为细胞半径；

fg为为常数由细胞种类与形状决定，通常植物细胞的fg取0.3；

V_m为植物细胞上某一点处的电位；

V_G为流出通道蛋白门电压；

-V_G为流入通道蛋白门电压；

V₀为未加电场时细胞膜电位

E₁为I_max取极值时的电场强度值，E₂为K_m取极值时的电场强度值；

V_m1,V_m2分别为离子吸收动力学参数I_max和K_m取第一拐点时细胞最下方点的电位和取第二拐点时细胞最上方点的电位的值；

Vw为离子通道开启的电压幅宽。

Claims (1)

1.一种测量植物根毛细胞膜电位的方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一，获取不同电场强度作用下的离子吸收动力学参数

选取长势相似的植物幼苗置于不同电场强度的高压静电场环境下进行离子吸收实验，采用耗竭法获取不同电场强度下的离子吸收动力学参数最大离子吸收速率I_max和亲和系数K_m，在耗竭法中，离子消耗曲线符合改进的Michaelis–Menten方程，如下式所示

$C-C_0=t\·I_{\max }+K_m\ln \frac{c_0}{c}$

C为吸收溶液浓度，C₀为吸收溶液起始浓度，t为吸收时间；

步骤二，构建不同电场强度下的离子吸收动力学参数变化曲线，确定不同电场强度下离子吸收动力学参数曲线拐点以及对应电场强度

从不同电场强度下的离子吸收动力学参数变化曲线中，找出离子吸收动力学参数变化的两个拐点，确定所述两个拐点对应的电场强度：即综合考虑I_max和K_m后，第一个拐点对应电场强度值为E₁，第二个拐点对应电场强度值为E₂；

步骤三，测定根毛细胞半径，计算根毛细胞膜电位V₀，计算公式如下：

V₀＝fg·a(E₁-E₂)/2

a为测得的根毛细胞半径；fg取0.3。