CN103163238B - 利用根系有机酸分泌特征检测植物抗缺磷胁迫能力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种利用根系有机酸的分泌特征检测植物抗缺磷胁迫能力的方法，将测定的有机酸标准溶液加入风干的根际土样中，建立有机酸标准溶液的浓度与有效磷含量之间的关系模型；根据关系模型计算出根系分泌的有机酸对根际土壤的磷提取能力，并计算缺磷配方的营养液中培养的植物根系分泌的有机酸对根际土壤的磷提取能力比正常配方的营养液中培养的植物根系分泌的有机酸对根际土壤的磷提取能力的增加比，再经计算根系分泌的有机酸对磷提取的成本，判断出不同植物抗缺磷胁迫能力的大小。本发明能定量检测植物的抗缺磷胁迫的能力，不同植物的检测结果具有可比性，不受任何时间和空间地理因素的影响，能长期动态监测植物体内生理的变化特征。

Description

利用根系有机酸分泌特征检测植物抗缺磷胁迫能力的方法

技术领域

本发明涉及到一种利用根系有机酸的分泌特征检测植物抗缺磷胁迫能力的方法，属于农业工程技术和农作物抗干旱能力的监测领域。

背景技术

磷是限制植物生长发育的重要因子之一，磷缺乏严重影响植物的生长发育，许多研究表明缺磷胁迫会增加植物根系有机酸分泌量，根系分泌的有机酸通过酸化、络合或螯合作用以活化土壤中难溶性磷化合物如钙磷、铁磷和铝磷，从而缓解磷胁迫。因此缺磷胁迫下植物根系分泌的有机酸含量的增加是对该环境胁迫的一种响应机制，根系分泌的低分子量有机酸对许多根际过程如营养的获取，根际pH值的变化和根际微生物活性起着重要的作用，植物种类对根系分泌有机酸的组成和含量具有显著影响。

苹果酸、柠檬酸和草酸是植物根系分泌最常见的低分子量有机酸，这三种有机酸活化难溶性磷化合物的能力不同。许多研究表明有机酸对土壤磷提取能力有增强作用，然而有机酸的浓度与其提取磷含量之间的关系尚不明确。因此建立外源有机酸与土壤提取磷含量之间的关系模型，并将该模型应用于根系分泌的有机酸对磷提取量的研究还未见报道。

根系分泌物中的有机酸是土壤-植物-根际最活跃的碳循环方式，它们大部分（40%-80%）最初来源于光合作用固定的碳。缺磷胁迫下，根系分泌物中有机酸的组成和含量影响根系分泌有机酸的碳损失量，而有机酸本身所含有的碳原子数目也会影响根系分泌有机酸的碳损失量。因此，根系分泌有机酸的碳损失量需要综合考虑其含量和碳原子数目进行确定。

缺磷胁迫下不同的植物根系分泌的有机酸对磷提取的能力增强的效果不同，而其碳损失量则与根系分泌的有机酸组成和含量相关，因此根系分泌的有机酸以碳损失为代价提取磷的效果存在着差异，即不同植物的磷提取存在着经济性。

根系分泌物中有机酸的收集采用CaCl₂溶液收集，该方法能提高其中有机酸的测定精度。有机酸的分离纯化利用阴阳离子树脂法。浓缩采用旋转蒸发仪进行蒸发浓缩，这是一种最经济可行且常用的有效途径，具有较高的回收率，能较好反映根系分泌物中的有机酸的实际含量。其他的收集方法还有基质培收集，土壤溶液原位收集法等等，不同的收集方法满足不同的实验需要，一般用于溶液培（水培）的多是利用CaCl₂溶液收集；分离纯化方法还有分子膜纯化，冷冻干燥浓缩等等，但是这些方法相对成本较高，且操作本身复杂化，不利于推广使用。目前有机酸的测定方法主要有高效液相色谱法，毛细管电泳法，气相色谱法和生物酶选择电极法等。从实用角度优先选择高效液相色谱法，该方法灵敏度高、检测限低、操作简便快速、成本低。

目前检测植物缺磷生理及抗逆性的常用方法有以下三种：

1.叶片观察法。这是一种最直观、最简便的方法，作物受缺磷胁迫后也会引起特有的生理病征，许多植物直接表现在叶片上，如某些植物缺磷后叶片呈红色或紫色，植株深绿，但是每种植物某种元素的病征不完全一致，而缺磷程度的不同，表现程度也不同。因此，该方法过于局限性，准确性较差。

2.植物理化实验指标分析法。该方法主要包括植物体内各种常见抗性指标的测定如蛋白质、脯氨酸含量的测定，各种酶如PEP羧化酶，苹果酸脱氢酶，异柠檬酸脱氢酶等活性的测定。该方法能充分的反映植物对缺磷逆境生理胁迫的影响，但存在实验周期长、实验步骤较繁琐、工作量大、灵敏度较低等缺点。

3.叶绿素荧光动力学技术分析法。叶绿素荧光动力学技术被称为研究植物光合功能的快速、无损伤探针，目前广泛应用于植物逆境生理、产量预测、环境污染的检测、遥感遥测等方面的研究，是一种较为理想的研究植物对缺磷胁迫的即时性方法，与红外线气体分析法一起用于表征植物的抗缺磷胁迫能力的强弱。该方法是现今用得最多的逆境生理与抗逆性的检测方法，但仪器成本较高、参数较多且易于混淆、受外界环境影响大、不能反映植物体内长期的变化特征等问题。

上述方法都存在着各种不同的缺点，在实际应用中不利于推广与普及。因此，在生产实践中，开发出一种相对简单、成本较低、灵敏度高的检测植物抗缺磷胁迫能力的方法具有重要的应用价值。利用植物根系分泌的有机酸变化特征来表征植物的抗缺磷胁迫能力可以定量植物抗缺磷胁迫能力。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供了一种利用根系有机酸的分泌特征检测植物抗缺磷胁迫能力的方法，为不同植物的抗缺磷胁迫能力提供了可比性，方法简单、成本较低、灵敏度高。

本发明采用的技术方案是具有以下步骤：

（1）选择生长状况相似的植物幼苗，用正常配方的营养液培养30天后随机分两组，一组继续在正常配方的营养液中培养；另一组则在缺磷配方的营养液中培养，培养时间为30天；

（2）收集培养30天的两组植物幼苗的根系分泌物，并分离纯化和浓缩根系分泌物中的苹果酸、柠檬酸、草酸这三种有机酸，测定这三种有机酸的含量；

（3）取出所述植物幼苗的根际土壤，风干过筛后室温保存得到风干的根际土样；配置单一的有机酸标准溶液，分别加入于三份所述风干的根际土样中，振荡后分别取各自的上清液，分析各自的上清液中的有效磷含量，建立各有机酸标准溶液的浓度与相应的上清液中的有效磷含量之间的关系模型；

（4）根据所述有机酸标准溶液的浓度与有效磷含量之间的关系模型计算出根系分泌的有机酸对根际土壤的磷提取能力，得到正常配方的营养液中培养的植物根系分泌的有机酸对根际土壤的磷提取能力PEXn以及得到缺磷配方的营养液中培养的植物根系分泌的有机酸对根际土壤的磷提取能力PEXs，计算缺磷配方的营养液中培养的植物根系分泌的有机酸对根际土壤的磷提取能力比正常配方的营养液中培养的植物根系分泌的有机酸对根际土壤的磷提取能力的增加比为：；

（5）计算缺磷胁迫处理的营养液中培养的植物根系分泌的有机酸中的碳含量比正常配方的营养液中培养的植物根系分泌的有机酸中的碳含量的碳损失的增加比记为，OCn是正常配方的营养液中培养的植物根系分泌的有机酸中的碳含量，OCs是缺磷胁迫处理的的营养液中培养的植物根系分泌的有机酸中的碳含量；

（6）根据IP_PEX和LOC计算出根系分泌的有机酸对磷提取的成本是LOC/IP_PEX，依据根系分泌有机酸磷提取的成本LOC/IP_PEX判断出不同植物抗缺磷胁迫能力的大小，选择根系分泌有机酸磷提取的成本LOC/IP_PEX小于2.0的植物作为抗缺磷胁迫材料。

本发明的优点如下：

1）本方法能定量检测植物的抗缺磷能力，不同植物的检测结果具有可比性。

2）实验周期短，成本低，利于推广。

3）筛选出的植物适应性很强，能生长在土层瘠薄的缺磷土壤上。

4）本方法不受任何时间和空间地理因素的影响，在实验室就可以进行检测，具有较好的可控性。

5）本方法能长期动态监测植物体内生理的变化特征，具有长期性，时效性等优点。

本发明利用根系有机酸的分泌特征检测植物抗缺磷胁迫能力的原理是：

缺磷胁迫下根系有机酸的分泌量增加以应对环境胁迫，调节植物对环境的适应及对不良环境的抗性，这是植物对缺磷胁迫环境的一种适应性机制。然而，由于根系分泌的有机酸种类繁多，不同的植物根系分泌的有机酸种类可能有所差异。苹果酸，柠檬酸和草酸作为三羧酸循环的中间产物，在大部分高等绿色植物根系分泌物中能鉴定出，因此利用根系分泌的这三种有机酸含量表征抗缺磷胁迫的方法具备可行性。

苹果酸，柠檬酸和草酸是植物根系分泌最常见的低分子量有机酸，约占植物根系分泌的有机酸75%，这三种有机酸活化土壤难溶性磷化合物的能力依次为柠檬酸>草酸≈苹果酸。特别是在含量高的钙磷、铝磷和铁磷的土壤中，根系分泌的有机酸能够促进这些化合物的溶解并释放出供植物生长所需要的无机磷。柠檬酸，苹果酸，草酸与钙的一级络合常数分别为4.85、2.72和3.19，与铝的一级络合常数分别为7.87、6.00和6.1，与铁的一级络合常数分别为11.50、7.74和7.1。其他有机酸的络合能力则明显小于这三种有机酸，如丁二酸和酒石酸与钙的一级络合常数为1.20和1.50，对铝和铁则无络合作用，一元酸如甲酸、乙酸等与这些离子的络合能力更低，因此可以忽略丁二酸、酒石酸以及一元酸对金属离子的络合作用。以柠檬酸、苹果酸和草酸对金属离子的络合释放磷的能力可以表征植物对磷的提取作用。

许多研究表明有机酸的浓度和提取时间对磷提取能力有显著影响，然而具体的有机酸的浓度与其提取磷含量之间的相关关系尚不明确。因此建立外源有机酸与其提取磷含量之间的关系模型，并将该模型应用于根系分泌的有机酸对磷提取量的计算，从而定量得到根系分泌的有机酸对磷提取的能力。

苹果酸，柠檬酸和草酸是植物-土壤-根际界面最活跃的碳循环方式，它们是三羧酸循环中重要的三种物质，其中苹果酸和柠檬酸直接参与三羧酸循环，而草酸则是由草酰乙酸脱水之后的产物，它们最初都来源于植物光合作用所固定的碳，在植物根际作用中大部分参与了呼吸作用。因此根系分泌的有机酸碳损失量不能忽视。缺磷胁迫下，不同植物根系分泌的有机酸种类和含量有差异，造成不同植物根系分泌有机酸的碳损失量不同。并且根系分泌的有机酸中所含的碳原子数目也影响有机酸的碳损失量，如柠檬酸的碳原子数目为6个，苹果酸为4个，草酸为2个，若根系分泌出相同摩尔质量的三种有机酸，则柠檬酸的碳损失量较大，苹果酸次之，草酸最小。

根系分泌有机酸对磷的提取成本是根系分泌有机酸提取同样的磷所损失的碳量。即根系分泌有机酸对磷提取的成本=根系分泌有机酸的碳损失量/根系分泌有机酸磷提取的增加量。缺磷胁迫下，不同植物根系分泌的有机酸提取同样的磷损失的碳有差异，也就是说根系分泌有机酸对磷提取的成本不同植物差异显著。

由于植物体内的磷可以进行再利用，并且植物体内磷的移动活化速度较快，可以从老化的组织器官中迅速转移到新的组织器官中，因此处理时间时间太短不容易看出缺磷的效果且根系分泌有机酸的含量不易检测，太长了会导致植物缺乏磷过度而凋亡，因此我们选择30天的处理时间，耐缺磷品种和缺磷敏感品种的根系分泌的有机酸增加量有显著的差异，从而使得耐缺磷品种和缺磷敏感品种根系分泌的有机酸对磷提取的成本有显著差异。

以光呼吸回收磷的成本（2.0）为临界值，耐缺磷植物根系分泌的有机酸对磷提取的成本小于2.0，缺磷敏感植物根系分泌的有机酸对磷提取的成本大于2.0。

具体实施方式

本发明的具体实施过程如下：

第一步，植物缺磷胁迫的处理。选择生长状况相似的植物幼苗，用正常配方的营养液培养30天后随机进行分组。一组继续在正常配方的营养液中培养（营养液中是正常的磷浓度）；另一组则在缺磷胁迫处理的环境下培养，即缺磷配方的营养液中培养，缺磷胁迫处理的营养液为每升正常配方的营养液中不含任何形态的磷。处理时间为30天。

第二步，根系分泌物的收集、分离与纯化。利用CaCl₂溶液收集培养30天的两组植物的根系分泌物，并优先选择阴阳离子树脂法分离纯化、旋转蒸发仪浓缩根系分泌物中的有机酸；利用高效液相色谱法测定根系分泌物中的苹果酸、柠檬酸和草酸含量。

第三步，建立外源有机酸与磷提取的关系。选择被考察植物的根际土壤，取出其根际土壤，风干过筛后室温保存，即为风干的根际土样。配置浓度为0-10mmol/L的单一有机酸（苹果酸、柠檬酸、草酸）标准溶液，分别加入30mL有机酸（苹果酸，柠檬酸，草酸）的标准溶液于三份均是3.0g风干的根际土样中，振荡后分别取各自的上清液，用紫外-可见光分光光度法分析各自的上清液中的有效磷含量。并建立各有机酸标准溶液的浓度与相应的上清液中的有效磷含量之间的关系模型。

第四步，计算根系分泌有机酸的磷提取增加比。以有机酸标准溶液的浓度与有效磷之间的相关模型计算出根系分泌的有机酸对被考察植物根际土壤的磷提取能力。将正常配方的营养液中培养的植物根系分泌的有机酸对根际土壤的磷提取能力记为PEXn，缺磷胁迫处理的营养液中培养的植物根系分泌的有机酸对根际土壤的磷提取能力记为PEXs。由此得到缺磷胁迫处理的营养液中培养的植物根系分泌的有机酸对根际土壤的磷提取能力比正常配方的营养液中培养的植物根系分泌的有机酸对根际土壤的磷提取能力的增加比记为。

第五步,计算根系分泌有机酸碳损失量的增加比。将正常配方的营养液中培养的植物根系分泌的有机酸中的碳含量记为OCn，缺磷胁迫处理的的营养液中培养的植物根系分泌的有机酸中的碳含量记为OCs。由此得到缺磷胁迫处理的营养液中培养的植物根系分泌的有机酸中的碳含量比正常配方的营养液中培养的植物根系分泌的有机酸中的碳含量的碳损失的增加比记为。

第六步，计算根系分泌有机酸对磷提取的成本。根据计算出的IP_PEX和LOC，计算根系分泌的有机酸对磷提取的成本=根系分泌有机酸的碳损失量/根系分泌有机酸的磷提取能力，即LOC/IP_PEX。依据根系分泌有机酸磷提取的成本LOC/IP_PEX判断出不同植物抗缺磷胁迫能力的大小。选择根系分泌有机酸磷提取的成本LOC/IP_PEX小于2.0的植物作为抗缺磷胁迫材料。

以下提供本发明的4个实施例以进一步说明本发明：

实施例1

将构树幼苗置于有托底的穴盘中，用正常配方的霍格兰（Hoagland）营养液培养30天后随机进行分组。每组各12株植株。分别设置不同的磷处理，一组为正常配方的培养（对照组，霍格兰营养液中的正常的磷浓度），另一组为缺磷逆境胁迫处理的培养（缺磷组，霍格兰营养液中无磷）。

培养30天，分别同时收集两组构树的收集根系分泌物。加入200mL、1mmol/LCaCl₂溶液于穴盘的托底中，于上午10时至下午14时收集4小时，将穴盘里的溶液收集并用去离子水冲洗植物的根部所得的滤液，即为构树的根系分泌物，低温保存，待分离纯化。将根系分泌物依次过AmberliteIR-120B（H⁺，氢离子型）阳离子交换树脂和Dowex1*8（OH^-，氢氧根离子型，100-200目）阴离子交换树脂柱；滞留在阴离子交换树脂柱内的有机酸用1mol/LHCl洗脱，洗脱液用旋转蒸发器浓缩至近干，之后保存于4°C冰箱中。构树根系分泌物中的三种有机酸含量采用高效液相色谱法测定。

选择构树的根际土壤，取出其根际土壤，风干过筛后室温保存，即为风干的根际土样。配置浓度为0-10mmol/L的单一有机酸（苹果酸，柠檬酸，草酸）的标准溶液，分别加入30mL各有机酸（苹果酸，柠檬酸，草酸）标准溶液于三份均是3.0g风干的根际土样中，振荡1h后分别取各自的上清液，分析各自的上清液中的有效磷含量。并建立各有机酸标准溶液的浓度与相应的上清液中的有效磷含量之间的关系模型；见表1。

以标准有机酸的浓度与有效磷含量之间的相关模型计算出根系分泌的有机酸对根际土壤的磷提取能力。将正常配方的营养液中培养的构树根系分泌的有机酸对根际土壤的磷提取能力记为PEXn，缺磷胁迫处理的营养液中培养的构树根系分泌的有机酸对根际土壤的磷提取能力记为PEXs。由此得到缺磷胁迫处理的营养液中培养的构树根系分泌的有机酸对根际土壤的磷提取能力比正常配方的营养液中培养的构树根系分泌的有机酸对根际土壤的磷提取能力的增加比记为，其值见表1。

将正常配方的营养液中培养的构树根系分泌的有机酸中的碳含量记为OCn，缺磷胁迫处理的营养液中培养的构树根系分泌的有机酸中的碳含量记为OCs。由此得到缺磷胁迫处理的营养液中培养的构树根系分泌的有机酸中的碳含量比正常配方的营养液中培养的构树根系分泌的有机酸中的碳含量的碳损失的增加比记为，其值见表1，并由此计算出构树的LOC/IP_PEX，其值见表1。

表1构树的有机酸标准溶液与磷提取的模型，根系分泌的有机酸的IP_PEX，LOC和LOC/IP_PEX

注：X：有机酸标准溶液的浓度(mM)，Y：磷提取量(mg/Kg土壤)。

实施例2

将桑树幼苗置于有托底的穴盘中，用正常配方的霍格兰（Hoagland）营养液培养30天后随机进行分组。每组各12株植株。分别设置不同的磷处理，一组为正常配方的培养（对照组，霍格兰营养液中的正常的磷浓度），另一组为缺磷逆境胁迫处理的培养（缺磷组，霍格兰营养液中无磷）。

培养30天，分别同时收集两组桑树的根系分泌物。加入200mL、1mmol/LCaCl₂溶液于穴盘的托底中，于上午10时至下午14时收集4小时，将穴盘里的溶液收集并用去离子水冲洗植物的根部所得的滤液，即为桑树的根系分泌物，低温保存，待分离纯化。将根系分泌物依次过AmberliteIR-120B（H⁺，氢离子型）阳离子交换树脂和Dowex1*8（OH^-，氢氧根离子型，100-200目）阴离子交换树脂柱；滞留在阴离子交换树脂柱内的有机酸用1mol/LHCl洗脱，洗脱液用旋转蒸发器浓缩至近干，之后保存于4°C冰箱中。桑树根系分泌物中的三种有机酸含量采用高效液相色谱法测定。

选择桑树的根际土壤，取出其根际土壤，风干过筛后室温保存，即为风干的根际土样。配置浓度为0-10mmol/L的单一有机酸（苹果酸，柠檬酸，草酸）的标准溶液，分别加入30mL各有机酸（苹果酸，柠檬酸，草酸）的标准溶液于三份均是3.0g风干的根际土样中，振荡1h后分别取各自的上清液，分析各自的上清液中的有效磷含量。并建立各有机酸标准溶液的浓度与相应的上清液中的有效磷含量之间的关系模型；见表2。

以标准有机酸的浓度与有效磷含量之间的相关模型计算出根系分泌的有机酸对根际土壤的磷提取能力。将正常配方的营养液中培养的桑树根系分泌的有机酸对根际土壤的磷提取能力记为PEXn，缺磷胁迫处理的营养液中培养的桑树根系分泌的有机酸对根际土壤的磷提取能力记为PEXs。由此得到缺磷胁迫处理的营养液中培养的桑树根系分泌的有机酸对根际土壤的磷提取能力比正常配方的营养液中培养的桑树根系分泌的有机酸对根际土壤的磷提取能力的增加比记为，其值见表2。

将正常配方的营养液中培养的桑树根系分泌的有机酸中的碳含量记为OCn，缺磷胁迫处理的营养液中培养的桑树根系分泌的有机酸中的碳含量记为OCs。由此得到缺磷胁迫处理的营养液中培养的桑树根系分泌的有机酸中的碳含量比正常配方的营养液中培养的桑树根系分泌的有机酸中的碳含量的碳损失的增加比记为，其值见表2，并由此计算出桑树的LOC/IP_PEX，其值见表2。

表2桑树的有机酸标准溶液与磷提取的模型，根系分泌的有机酸的IP_PEX，LOC和LOC/IP_PEX

注：X：有机酸标准溶液的浓度(mM)，Y：磷提取量(mg/Kg土壤)。

实施例3

将诸葛菜幼苗置于有托底的穴盘中，用正常配方的霍格兰（Hoagland）营养液培养30天后随机进行分组。每组各12株植株。分别设置不同的磷处理，一组为正常配方的培养（对照组，霍格兰营养液中的正常的磷浓度），另一组为缺磷逆境胁迫处理的培养（缺磷组，霍格兰营养液中无磷）。

培养30天，分别同时收集两组诸葛菜的根系分泌物。加入200mL、1mmol/LCaCl₂溶液于穴盘的托底中，于上午10时至下午14时收集4小时，将穴盘里的溶液收集并用去离子水冲洗植物的根部所得的滤液，即为诸葛菜的根系分泌物，低温保存，待分离纯化。将根系分泌物依次过AmberliteIR-120B（H⁺，氢离子型）阳离子交换树脂和Dowex1*8（OH^-，氢氧根离子型，100-200目）阴离子交换树脂柱；滞留在阴离子交换树脂柱内的有机酸用1mol/LHCl洗脱，洗脱液用旋转蒸发器浓缩至近干，之后保存于4°C冰箱中。诸葛菜根系分泌物中的三种有机酸含量采用高效液相色谱法测定。

选择诸葛菜的根际土壤，取出其根际土壤，风干过筛后室温保存，即为风干的根际土样。配置浓度为0-10mmol/L的单一有机酸（苹果酸，柠檬酸，草酸）的标准溶液，分别加入30mL各有机酸（苹果酸，柠檬酸，草酸）的标准溶液于三份均是3.0g风干的根际土样中，振荡1h后分别取各自的上清液，分析各自的上清液中的有效磷含量。并建立各有机酸标准溶液的浓度与相应的上清液中的有效磷含量之间的关系模型，见表3。

以标准有机酸的浓度与有效磷含量之间的相关模型计算出根系分泌的有机酸对根际土壤的磷提取能力。将正常配方的营养液中培养的诸葛菜根系分泌的有机酸对根际土壤磷的提取能力记为PEXn，缺磷胁迫处理的营养液中培养的诸葛菜根系分泌的有机酸对根际土壤磷的提取能力记为PEXs。由此得到缺磷胁迫处理的营养液中培养的诸葛菜根系分泌的有机酸对根际土壤磷的提取能力比正常配方的营养液中培养的诸葛菜根系分泌的有机酸对根际土壤磷的提取能力的增加比记为，其值见表3。

将正常配方的营养液中培养的诸葛菜根系分泌的有机酸中的碳含量记为OCn，缺磷胁迫处理的营养液中培养的诸葛菜根系分泌的有机酸中的碳含量记为OCs。由此得到缺磷胁迫处理的营养液中培养的诸葛菜根系分泌的有机酸中的碳含量比正常配方的营养液中培养的诸葛菜根系分泌的有机酸中的碳含量的碳损失的增加比记为，其值见表3，并由此计算出诸葛菜的LOC/IP_PEX，其值见表3。

表3诸葛菜的有机酸标准溶液与磷提取的模型，根系分泌的有机酸的IP_PEX，LOC和LOC/IP_PEX

注：X：有机酸标准溶液的浓度(mM)，Y：磷提取量(mg/Kg土壤)。

实施例4

将油菜幼苗置于有托底的穴盘中，用正常配方的霍格兰（Hoagland）营养液培养30天后随机进行分组。每组各12株植株。分别设置不同的磷处理，一组为正常配方的培养（对照组，霍格兰营养液中的正常的磷浓度），另一组为缺磷胁迫处理的培养（缺磷组，霍格兰营养液中无磷）。

培养30天，分别同时收集两组油菜的根系分泌物。加入200mL1mmol/LCaCl₂溶液于穴盘的托底中，于上午10时至下午14时收集4小时，将穴盘里的溶液收集并用去离子水冲洗植物的根部所得的滤液，即为油菜的根系分泌物，低温保存，待分离纯化。将根系分泌物依次过AmberliteIR-120B（H⁺，氢离子型）阳离子交换树脂和Dowex1*8（OH^-，氢氧根离子型，100-200目）阴离子交换树脂柱；滞留在阴离子交换树脂柱内的有机酸用1mol/LHCl洗脱，洗脱液用旋转蒸发器浓缩至近干，之后保存于4°C冰箱中。油菜根系分泌物中的三种有机酸含量采用高效液相色谱法测定。

选择油菜的根际土壤，取出其根际土壤，风干过筛后室温保存，即为风干的根际土样。配置浓度为0-10mmol/L的单一有机酸（苹果酸，柠檬酸，草酸）的标准溶液，分别加入30mL各有机酸（苹果酸，柠檬酸，草酸）的标准溶液于三份均是3.0g风干的根际土样中，振荡1h后分别取各自的上清液，分析各自的上清液中的有效磷含量。并建立各有机酸标准溶液的浓度与相应的上清液中的有效磷含量之间的关系模型，见表4。

以标准有机酸的浓度与有效磷含量之间的相关模型计算出根系分泌的有机酸对根际土壤磷的提取能力。将正常配方的营养液中培养的油菜根系分泌的有机酸对根际土壤磷的提取能力记为PEXn，缺磷胁迫处理的营养液中培养的油菜根系分泌的有机酸对根际土壤磷的提取能力记为PEXs。由此得到缺磷胁迫处理的营养液中培养的的油菜根系分泌的有机酸对根际土壤磷的提取能力比正常配方的营养液中培养的油菜根系分泌的有机酸对根际土壤磷的提取能力的增加比记为，其值见表4。

将正常配方的营养液中培养的油菜根系分泌的有机酸中的碳含量记为OCn，缺磷胁迫处理的营养液中培养的油菜根系分泌的有机酸中的碳含量记为OCs。由此得到缺磷胁迫处理的营养液中培养的油菜根系分泌的有机酸中的碳含量比正常配方的营养液中培养的油菜根系分泌的有机酸中的碳含量的碳损失的增加比记为，其值见表4，并由此计算出油菜的LOC/IP_PEX，其值见表4。

表4油菜的有机酸标准溶液与磷提取的模型，根系分泌的有机酸的IP_PEX，LOC和LOC/IP_PEX

注：X：有机酸标准溶液的浓度(mM)，Y：磷提取量(mg/Kg土壤)。

4个实施例的技术效果如下：

上述4个实施例的结果的基本情况为：在缺磷胁迫处理下，根系分泌的有机酸对磷的提取成本有显著差异。缺磷胁迫处理培养下的四种植物根系分泌的有机酸对磷的提取成本LOC/IP_PEX为诸葛菜≈构树<桑树<油菜，且油菜和桑树的磷提取成本LOC/IP_PEX大于2.0。因此，油菜和桑树的抗缺磷胁迫能力较差，为缺磷敏感植物。构树和诸葛菜在缺磷逆境下根系分泌的有机酸对磷的提取成本较小，以较小的有机酸碳损失代价提取更多的无机磷。因此，它们是抗缺磷植物，更能适应在缺磷的土壤环境中生长。这与我们在关于这几种植物的矿质元素吸收以及其他研究相符合，与实际情况相一致，为选择抗缺磷植物以及喀斯特地区树种的配置和生态修复提供了重要的理论支撑。同时利用根系分泌的有机酸磷提取的成本作为一种检验植物抗缺磷胁迫能力的方法，也为植物逆境生理学研究提出了一种新的手段。

Claims (2)

1.一种利用根系有机酸分泌特征检测植物抗缺磷胁迫能力的方法，其特征是具有以下步骤：

（1）选择生长状况相似的植物幼苗，用正常配方的营养液培养30天后随机分两组，一组继续在正常配方的营养液中培养；另一组则在缺磷配方的营养液中培养，培养时间为30天；

（2）收集培养30天的两组植物幼苗的根系分泌物，并分离纯化和浓缩根系分泌物中的苹果酸、柠檬酸、草酸这三种有机酸，测定这三种有机酸的含量；

（3）取出所述植物幼苗的根际土壤，风干过筛后室温保存得到风干的根际土样；配置单一的三种有机酸标准溶液，分别加入于三份所述风干的根际土样中，振荡后分别取各自的上清液，分析各自的上清液中的有效磷含量，建立各有机酸标准溶液的浓度与相应的上清液中的有效磷含量之间的关系模型；

（4）根据所述有机酸标准溶液的浓度与有效磷含量之间的关系模型计算出根系分泌的有机酸对根际土壤的磷提取能力，得到正常配方的营养液中培养的植物根系分泌的有机酸对根际土壤的磷提取能力PEXn以及得到缺磷配方的营养液中培养的植物根系分泌的有机酸对根际土壤的磷提取能力PEXs，计算缺磷配方的营养液中培养的植物根系分泌的有机酸对根际土壤的磷提取能力比正常配方的营养液中培养的植物根系分泌的有机酸对根际土壤的磷提取能力的增加比为：；

（5）计算缺磷胁迫处理的营养液中培养的植物根系分泌的有机酸中的碳含量比正常配方的营养液中培养的植物根系分泌的有机酸中的碳含量的碳损失的增加比为，OCn是正常配方的营养液中培养的植物根系分泌的有机酸中的碳含量，OCs是缺磷胁迫处理的的营养液中培养的植物根系分泌的有机酸中的碳含量；

（6）根据IP_PEX和LOC计算出根系分泌的有机酸对磷提取的成本是LOC/IP_PEX，依据根系分泌有机酸磷提取的成本LOC/IP_PEX判断出不同植物抗缺磷胁迫能力的大小，可检测出植物抗缺磷胁迫能力，将所述根系分泌有机酸磷提取的成本LOC/IP_PEX小于2.0的植物作为抗缺磷胁迫材料。

2.根据权利要求1所述的利用根系有机酸分泌特征检测植物抗缺磷胁迫能力的方法，其特征是：步骤（3）中的单一有机酸标准溶液的配置浓度为0-10mmol/L，将三种单一有机酸标准溶液30mL分别加入于三份均是3.0g风干的根际土样中。