CN104004808A - 一种具有抗凝血与溶血栓全蝎多肽及其酶解制备方法与应用 - Google Patents
一种具有抗凝血与溶血栓全蝎多肽及其酶解制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有抗凝血与溶血栓全蝎多肽及其酶解制备方法与应用，制备方法包括：全蝎干体清洗干燥，粉粹成粉末；加入水均匀搅拌，pH调至7~10，以100~300r/min的速度匀速搅拌1h~3h，离心，上清液pH调至3~7，得蛋白沉淀；将蛋白加水溶解，比例为5~20g：100mL，pH调至7.5~10，再加入碱性蛋白酶，该酶体积与蛋白重量之比0.1~5mL：100g，温度40~80℃，搅拌速度100~300r/min，时间1~5h；将酶解液通过阴离子交换柱分离纯化，收集干燥，得抗凝血肽粉。本发明为抗凝血类活性物质增加了新来源，实现原料的充分利用，具有产品活性高、制备过程方便可行、环保等优点，所制得的抗凝血肽粉可作为预防血栓、溶血栓、降血稠类食品的原料。
Description
技术领域
本发明涉及生物肽及其制备方法与应用，具体涉及一种具有抗凝血与溶血栓全蝎多肽及其酶解制备方法与应用。
背景技术
全蝎(Buthus martensii Karsch)食用、药用历史悠久。全蝎的主要药用成分为蝎毒素(Buthotoxin)，据《本草纲目》和《中国药典》载，全蝎具有“熄风镇痉、消炎攻毒、通络止痛”功能；主治“小儿惊风、抽搐痉挛、皮肤病、心脑血管病、炎症、乙肝、肿瘤”等。全蝎也是一种高档美味佳肴，营养丰富，食之有防病治病、增强免疫力和抗衰老等功能。全蝎体内含有丰富的蛋白质，少量脂肪酸和微量矿物质。
目前，市面上的全蝎产品主要用于消炎攻毒、通络止痛，几乎没有全蝎抗凝血功能的产品，因此开发出一种低成本、高活性的全蝎产品具有广阔的市场经济效益。本发明采用可控酶解的方法，通过生物蛋白酶对全蝎躯体蛋白进行水解催化作用，把其中所隐藏的抗凝血活性肽片段释放出来，从而制备具有抗凝血活性的多肽。目前，对于生物活性肽的开发在国内外已成为热点研究领域，多肽高活性、快吸收、安全健康的特点广受产品开发者的青睐，目前已从可食蛋白中水解分离得到的有高F值寡肽、抗氧化肽、ACE抑制肽等，且多肽的开发所需仪器设备、生产条件简单可行，所以，酶解全蝎制备抗凝血活性肽具有很高的可行性和广阔的市场经济效应。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗凝血与溶血栓全蝎多肽及其酶解制备方法与应用。本发明方法能够实现原料的高效利用，具有高活性、高安全、简单可控、环境温和的制备特点。
本发明的目的由以下方案实现：
(1)取全蝎洗净干燥，粉碎成细粉；加水溶解，细粉与水的溶解比例为5～25g：100mL，pH调至7.0～10.0，以100～300r/min的速度均匀搅拌1h～3h，取上清 液调pH至3～7，干燥，制得全蝎蛋白；
(2)将步骤(1)得到的全蝎蛋白加水溶解，溶解比例为5～20g：100mL，控制pH值在7.5～10，再加入碱性蛋白酶作为生物催化剂，进行反应，反应温度为40～80℃，以100～300r/min匀速搅拌1～5h；煮沸5～30min，灭酶活，结束反应；5000～10000r/min离心，收集上清液，干燥，得到粗多肽粉末。
(3)装柱：根据层析柱体积称取适量填料DEAE sepharose FF进行预处理，反复倾倒上清液除去悬浮破碎颗粒，将填料加入层析柱，层析柱规格2.6×50cm，待稳定后，用3倍柱体积Tris-HCl洗脱液(条件与洗脱时的相同)冲柱。
(4)粗多肽粉末加水溶解，倒入DEAE sepharose FF阴离子交换柱，以0～1.0mol/L不同浓度氯化钠(NaCl)溶液梯度洗脱，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集洗脱液，目的在于将粗多肽进一步纯化，去除偏碱性的多肽组分、色素及其它杂质，富集洗脱下来的高活性多肽组分，浓缩，干燥，得具有抗凝血与溶血栓全蝎多肽。
对全蝎多肽的抗凝血活性指标评价及溶血栓评价。采用凝血四项基本指标(APTT、PT、TT、FIB)对多肽的抗凝血性能进行评价，采用溶血浆平板法来对其溶血栓活性成分进行评价。
优选地，步骤(1)中所述的全蝎品种为全蝎Buthus martensii Karsch；所述干燥为干燥至含水量小于3％。
优选地，步骤(2)所述碱性蛋白酶为Alcalase2.4L，酶的活力为2.4AU/mL。
优选地，步骤(1)中所述pH调至7.0～10.0具体为：用0.1～2.0mol/L的氢氧化钠(NaOH)溶液将pH调至7.0～10.0；所述取上清液调pH至3～7具体为：用0.1～2.0mol/L的盐酸(HCl)溶液将上清液的pH调至3～7。
优选地，步骤(2)中所述碱性蛋白酶与全蝎蛋白比为0.1～5mL：100g，优选0.5～4mL：100g。
优选地，步骤(4)中所述阴离子交换柱填料为DEAE sepharose FF，所述富集为富集阴离子交换柱中的第3、4吸收峰的洗脱组分。
一种具有抗凝血与溶血栓全蝎多肽，所述全蝎多肽的分子量范围为350—3200Da；所述全蝎多肽为偏酸性多肽。
一种全蝎多肽应用于具有抗凝血与溶血栓功效的功能性食品中，所述功能性 食品为粉剂、片剂、口服液或胶囊。
本发明的原理：在碱性条件下，以水解酶为催化剂，使全蝎蛋白进行水解，将酶解液进行分离纯化，以抗凝血四指标和溶血栓活性为依据，得到全蝎活性多肽。
经过试验筛选，将全蝎蛋白加水溶解后，加热至95℃，保温20min，再冷却至酶解所需温度，进行酶解，效果会更好。全蝎多肽产品以口服的形式进入体内，经人体消化酶：胃蛋白酶、胰蛋白酶的酶解消化，在小肠被吸收利用，发挥功效。对产品多肽进行体外消化模拟实验，模拟人体内酶的消化环境，先后将分离纯化后的活性多肽经过胃蛋白酶、胰蛋白酶的消化，消化后的多肽活性无明显降低。
本发明所制备的全蝎酶解多肽液，可直接喷雾干燥，制成抗凝血多肽粉，也可加入乳糖、甘露醇等，混合均匀，分装，冷冻干燥，制成冻干粉剂、片剂，也可制成口服液方便人体快速吸收，还可制成胶囊，直接透过胃消化液进入小肠，更好的保护多肽的活性，发挥高抗凝血功效。
与现有的技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
1.本发明提高了全蝎的生物利用率。在体外对比六种工业常用蛋白酶的酶解情况，选定简便可控的Alcalase2.4L碱性蛋白酶，将整体全蝎蛋白一起酶解利用。蛋白质中肽链打开，获得小分子活性多肽。此蛋白酶相比于传统的催化用酶，具有高效的酶解能力，在较短时间内即可完成对底物蛋白的高度水解，方便针对任一水解段地目标多肽进行分离筛选，可控性高。此法制备活性多肽突破了传统的提取方法，如：直接口服，水煮提药、醇提给药等，传统的动物原粉及常规提取方法引入的异蛋白易引起免疫原反应，与传统的方法相比，多肽的结构简单易知，产物易分离，且能高效被人体吸收，安全可靠。
2.产品的活性高。本发明采用酶解法得到多肽，再通过分离纯化得到偏酸性的活性肽类，采用抗凝血四项指标和溶血栓试验进行活性测定，见表1和表2。表1可以看出，阳性对照比伐卢定为公认的高抗凝血药物，当样品和对照浓度在0.01mg/mL，样品PT与阳性对照相当；0.2mg/mL的样品活力已高于0.01mg/mL的比伐卢定。由表2可知，当样品浓度达到1mg/mL时，已有明显地溶解圈。表明所得多肽活性大大增强，可直接口服，口服后人体消化液对其活性无太大影响，为功能食品领域提供了一种新型的活性原料。
3.此全蝎多肽表现为偏酸性的特征，带负电荷，与经典的抗凝血多肽类药物水蛭素、多糖类药物肝素相似，能与带正电荷的凝血酶结合，从而阻止其发挥凝血作用，体现其抗凝血活性。
4.多肽为小分子肽类，进入人体被吸收后，可以直接穿过小肠壁进入血液发挥作用，活性几乎不变，稳定性高。
5.用途广泛，可作为预防血栓、溶血栓、降血稠类食品的原料，辅以乳糖、甘露醇等，制成粉剂、片剂、胶囊或口服液。目前没有全蝎多肽应用于功能性食品的报道。
附图说明
图1为采用不同酶对全蝎蛋白的酶解情况图；
图2为酶解产物过阴离子交换柱的分离峰情况图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步地具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
以下实施例所用到的全蝎干粉均由全蝎(Buthus martensii Karsch)洗净干燥至含水量小于3％，粉碎成细粉得到的。
实施例1
取500g干净全蝎(Buthus martensii Karsch)干粉，该干粉与水的比例为5g：100mL，pH调至10.0，以300r/min的速度均匀搅拌3h，取上清液，再将pH调至3，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得全蝎蛋白。将全蝎蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为5g：100mL，控制pH值在10，再加入Alcalase2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，酶体积与全蝎蛋白之比为1mL：100g，反应温度为40℃，搅拌速度为300r/min，反应时间5h。煮沸10min，将酶解液过DEAE sepharose FF阴离子交换柱，从纯净水开始逐渐增大NaCl浓度，以0～1.0mol/L不同浓度NaCl进行线性梯度洗脱，流速控制在0.8mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集第3、4洗脱组分洗脱液，冷冻干燥得抗凝血活性的抗凝血全蝎肽粉；本实施例所得的抗凝血全蝎肽粉(样品：0.1mg/mL)四项指标分别为APTT：87.24s，PT：34.13s，TT：38.72s，FIB：1.65g/L，溶血栓活性(样品：1mg/mL)为101.24mm2。
实施例2
取500g干净全蝎(Buthus martensii Karsch)干粉，该干粉与水的比例为20g：100mL，pH调至9.5，以100r/min的速度均匀搅拌1h，取上清液，再将pH调至4，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得全蝎蛋白。将全蝎蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为10g：100mL，控制pH值在9，再加入Alcalase2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，酶体积与全蝎蛋白重量之比为0.5mL：100g，反应温度为50℃，搅拌速度为150r/min，反应时间4h。煮沸10min，将酶解液过DEAE sepharose FF阴离子交换柱，从纯净水开始逐渐增大NaCl浓度，以0～1.0mol/L不同浓度NaCl进行线性梯度洗脱，流速控制在0.8mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集第3、4洗脱组分洗脱液，冷冻干燥得抗凝血活性的抗凝血全蝎肽粉。本实施例所得的抗凝血全蝎肽粉(样品：0.1mg/mL)四项指标分别为APTT：72.34s，PT：31.58s，TT：41.57s，FIB：1.32g/L，溶血栓活性(样品：1mg/mL)为112.35mm2。
实施例3
取500g干净全蝎(Buthus martensii Karsch)干粉，该干粉与水的比例为10g：100mL，pH调至9，以150r/min的速度均匀搅拌2h，取上清液，再将pH调至4.5，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得全蝎蛋白。将全蝎蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为15g：100mL，控制pH值在8.5，再加入Alcalase2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，酶体积与全蝎蛋白重量之比为2mL：100g，反应温度为60℃，搅拌速度为200r/min，反应时间3h。煮沸10min，将酶解液过DEAE sepharose FF阴离子交换柱，从纯净水开始逐渐增大NaCl浓度，以0～1.0mol/L不同浓度NaCl进行线性梯度洗脱，流速控制在0.8mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集第3、4洗脱组分洗脱液，冷冻干燥得抗凝血活性的抗凝血全蝎肽粉；本实施例中所得的抗凝血全蝎肽粉(样品：0.1mg/mL)四项指标分别为APTT：85.86s，PT：39.35s，TT：32.45s，FIB：1.24g/L，溶血栓活性(样品：1mg/mL)为120.35mm2。
实施例4
取500g干净全蝎(Buthus martensii Karsch)干粉，该干粉与水的比例为15g：100mL，pH调至8.5，以300r/min的速度均匀搅拌1h，取上清液，再将pH调 至3.5，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得全蝎蛋白。将全蝎蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为15g：100mL，控制pH值在8.0，再加入Alcalase2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，酶体积与全蝎蛋白重量之比为1.5mL：100g，反应温度为65℃，搅拌速度为200r/min，反应时间2h。煮沸10min，将酶解液过DEAE sepharose FF阴离子交换柱，从纯净水开始逐渐增大NaCl浓度，以0～1.0mol/L不同浓度NaCl进行线性梯度洗脱，流速控制在0.8mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集第3、4洗脱组分洗脱液，冷冻干燥得抗凝血活性的抗凝血全蝎肽粉；本实施例中所得的抗凝血全蝎肽粉(样品：0.1mg/mL)四项指标分别为APTT：90.12s，PT：38.36s，TT：35.46s，FIB：1.11g/L，溶血栓活性(样品：1mg/mL)为125.64mm2。
实施例5
取500g干净全蝎(Buthus martensii Karsch)干粉，该干粉与水的比例为20g：100mL，pH调至9.0，以150r/min的速度均匀搅拌1h，取上清液，再将pH调至4.6，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得全蝎蛋白。将全蝎蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为10g：100mL，控制pH值在8.5，再加入Alcalase2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，酶体积与全蝎蛋白重量之比为0.5mL：100g，反应温度为60℃，搅拌速度为150r/min，反应时间3h。煮沸10min，将酶解液过DEAE sepharose FF阴离子交换柱，从纯净水开始逐渐增大NaCl浓度，以0～1.0mol/L不同浓度NaCl进行线性梯度洗脱，流速控制在0.8mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集第3、4洗脱组分洗脱液，冷冻干燥得抗凝血活性的抗凝血全蝎肽粉；本实施例中所得的抗凝血全蝎肽粉(样品：0.1mg/mL)四项指标分别为APTT：106.40s，PT：45.70s，TT：46.20s，FIB：1.01g/L，溶血栓活性(样品：1mg/mL)为130.55mm2。
实施例6
取500g干净全蝎(Buthus martensii Karsch)干粉，该干粉与水的比例为5g：100mL，pH调至10，以200r/min的速度均匀搅拌2h，取上清液，再将pH调至4.5，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得全蝎蛋白。将全蝎蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为10g：100mL，控制pH值在8.0，再加入Alcalase2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，酶体积与全蝎蛋白重量之比为 2.5mL：100g，反应温度为70℃，搅拌速度为300r/min，反应时间2h。煮沸10min，将酶解液过DEAE sepharose FF阴离子交换柱，从纯净水开始逐渐增大NaCl浓度，以0～1.0mol/L不同浓度NaCl进行线性梯度洗脱，流速控制在0.8mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集第3、4洗脱组分洗脱液，冷冻干燥得抗凝血活性的抗凝血全蝎肽粉；本实施例中所得的抗凝血全蝎肽粉(样品：0.1mg/mL)四项指标分别为APTT：88.76s，PT：34.56s，TT：42.18s，FIB：1.32g/L，溶血栓活性(样品：1mg/mL)为119.26mm2。
实施例7
取500g干净全蝎(Buthus martensii Karsch)干粉，该干粉与水的比例为10g：100mL，pH调至9，以200r/min的速度均匀搅拌3h，取上清液，再将pH调至4.5，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得全蝎蛋白。将全蝎蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为20g：100mL，控制pH值在8.5，再加入Alcalase2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，酶体积与全蝎蛋白重量之比为2mL：100g，反应温度为65℃，搅拌速度为100r/min，反应时间3h。煮沸10min，将酶解液过DEAE sepharose FF阴离子交换柱，从纯净水开始逐渐增大NaCl浓度，以0～1.0mol/L不同浓度NaCl进行线性梯度洗脱，流速控制在0.8mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集第3、4洗脱组分洗脱液，冷冻干燥得抗凝血活性的抗凝血全蝎肽粉；本实施例中所得的抗凝血全蝎肽粉(样品：0.1mg/mL)四项指标分别为APTT：93.65s，PT：41.56s，TT：38.56s，FIB：1.32g/L，溶血栓活性(样品：1mg/mL)为124.67mm2。
实施例8
取500g干净全蝎(Buthus martensii Karsch)干粉，该干粉与水的比例为15g：100mL，pH调至9.5，以300r/min的速度均匀搅拌2h，取上清液，再将pH调至5，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得全蝎蛋白。将全蝎蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为10g：100mL，控制pH值在9，再加入Alcalase2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，酶体积与全蝎蛋白重量之比为2.5mL：100g，反应温度为60℃，搅拌速度为150r/min，反应时间2.5h。煮沸10min，将酶解液过DEAE sepharose FF阴离子交换柱，从纯净水开始逐渐增大NaCl浓度，以0～1.0mol/L不同浓度NaCl进行线性梯度洗脱，流速控制在0.8mL/min， 在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集第3、4洗脱组分洗脱液，冷冻干燥得抗凝血活性的抗凝血全蝎肽粉；本实施例中所得的抗凝血全蝎肽粉(样品：0.1mg/mL)四项指标分别为APTT：100.42s，PT：36.58s，TT：38.36s，FIB：1.21g/L，溶血栓活性(样品：1mg/mL)为118.45mm2。
实施例9
取500g干净全蝎(Buthus martensii Karsch)干粉，该干粉与水的比例为5g：100mL，pH调至10，以200r/min的速度均匀搅拌2.5h，取上清液，再将pH调至5.0，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得全蝎蛋白。将全蝎蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为20g：100mL，控制pH值在8.0，再加入Alcalase2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，酶体积与全蝎蛋白重量之比为0.5mL：100g，反应温度为55℃，搅拌速度为300r/min，反应时间4h。煮沸10min，将酶解液过DEAE sepharose FF阴离子交换柱，从纯净水开始逐渐增大NaCl浓度，以0～1.0mol/L不同浓度NaCl进行线性梯度洗脱，流速控制在0.8mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集第3、4洗脱组分洗脱液，冷冻干燥得抗凝血活性的抗凝血全蝎肽粉；本实施例中所得的抗凝血全蝎肽粉(样品：0.1mg/mL)四项指标分别为APTT：91.65s，PT：35.63s，TT：37.79s，FIB：1.41g/L，溶血栓活性(样品：1mg/mL)为109.66mm2。
实施例10
取500g干净全蝎(Buthus martensii Karsch)干粉，该干粉与水的比例为8g：100mL，pH调至9.8，以180r/min的速度均匀搅拌2h，取上清液，再将pH调至4.5，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得全蝎蛋白。将全蝎蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为8g：100mL，控制pH值在8.3，再加入Alcalase2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，酶体积与全蝎蛋白重量之比为3mL：100g，反应温度为45℃，搅拌速度为150r/min，反应时间3h。煮沸10min，将酶解液过DEAE sepharose FF阴离子交换柱，从纯净水开始逐渐增大NaCl浓度，以0～1.0mol/L不同浓度NaCl进行线性梯度洗脱，流速控制在0.8mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集第3、4洗脱组分洗脱液，冷冻干燥得抗凝血活性的抗凝血全蝎肽粉；本实施例中所得的抗凝血全蝎肽粉(样品：0.1mg/mL)四项指标分别为APTT：89.68s，PT：34.26s，TT：35.46s，FIB： 1.48g/L，溶血栓活性(样品：1mg/mL)为102.56mm2。
实施例11
取500g干净全蝎(Buthus martensii Karsch)干粉，该干粉与水的比例为18g：100mL，pH调至9.5，以150r/min的速度均匀搅拌1h，取上清液，再将pH调至4，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得全蝎蛋白。将全蝎蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为6g：100mL，控制pH值在8.5，再加入Alcalase2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，酶体积与全蝎蛋白重量之比为1.5mL：100g，反应温度为50℃，搅拌速度为200r/min，反应时间2h。煮沸10min，将酶解液过DEAE sepharose FF阴离子交换柱，从纯净水开始逐渐增大NaCl浓度，以0～1.0mol/L不同浓度NaCl进行线性梯度洗脱，流速控制在0.8mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集第3、4洗脱组分洗脱液，冷冻干燥得抗凝血活性的抗凝血全蝎肽粉；本实施例中所得的抗凝血全蝎肽粉(样品：0.1mg/mL)四项指标分别为APTT：95.63s，PT：40.15s，TT：42.35s，FIB：1.18g/L，溶血栓活性(样品：1mg/mL)为125.6mm2。
实施例12
取500g干净全蝎(Buthus martensii Karsch)干粉，该干粉与水的比例为15g：100mL，pH调至9.5，以200r/min的速度均匀搅拌2h，取上清液，再将pH调至4，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得全蝎蛋白。将全蝎蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为10g：100mL，控制pH值在9.0，再加入Alcalase2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，酶体积与全蝎蛋白重量之比为0.8mL：100g，反应温度为65℃，搅拌速度为150r/min，反应时间3.5h。煮沸10min，将酶解液过DEAE sepharose FF阴离子交换柱，从纯净水开始逐渐增大NaCl浓度，以0～1.0mol/L不同浓度NaCl进行线性梯度洗脱，流速控制在0.8mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集第3、4洗脱组分洗脱液，冷冻干燥得抗凝血活性的抗凝血全蝎肽粉；本实施例中所得的抗凝血全蝎肽粉(样品：0.1mg/mL)四项指标分别为APTT：92.35s，PT：38.67s，TT：40.28s，FIB：1.28g/L，溶血栓活性(样品：1mg/mL)为128.62mm2。
实施例13
取500g干净全蝎(Buthus martensii Karsch)干粉，该干粉与水的比例为20g： 100mL，pH调至9.5，以250r/min的速度均匀搅拌2.5h，取上清液，再将pH调至4.2，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得全蝎蛋白。将全蝎蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为15g：100mL，控制pH值在8.5，再加入Alcalase2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，酶体积与全蝎蛋白重量之比为0.5mL：100g，反应温度为55℃，搅拌速度为200r/min，反应时间3h。煮沸10min，将酶解液过DEAE sepharose FF阴离子交换柱从纯净水开始逐渐增大NaCl浓度，以0～1.0mol/L不同浓度NaCl进行线性梯度洗脱，流速控制在0.8mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集第3、4洗脱组分洗脱液，冷冻干燥得抗凝血活性的抗凝血全蝎肽粉；本实施例中所得的抗凝血全蝎肽粉(样品：0.1mg/mL)四项指标分别为APTT：96.86s，PT：35.42s，TT：40.68s，FIB：1.56g/L，溶血栓活性(样品：1mg/mL)为116.28mm2。
实施例14
取500g干净全蝎(Buthus martensii Karsch)干粉，该干粉与水的比例为15g：100mL，pH调至10，以200r/min的速度均匀搅拌2h，取上清液，再将pH调至4.5，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得全蝎蛋白。将全蝎蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为10g：100mL，控制pH值在8.8，再加入Alcalase2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，酶体积与全蝎蛋白重量之比为1.2mL：100g，反应温度为50℃，搅拌速度为250r/min，反应时间3.5h。煮沸10min，将酶解液过DEAE sepharose FF阴离子交换柱，从纯净水开始逐渐增大NaCl浓度，以0～1.0mol/L不同浓度NaCl进行线性梯度洗脱，流速控制在0.8mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集第3、4洗脱组分洗脱液，冷冻干燥得抗凝血活性的抗凝血全蝎肽粉；本实施例中所得的抗凝血全蝎肽粉(样品：0.1mg/mL)四项指标分别为APTT：93.45s，PT：37.17s，TT：38.89s，FIB：1.45g/L，溶血栓活性(样品：1mg/mL)为114.28mm2。
实施例15
取500g干净全蝎(Buthus martensii Karsch)干粉，该干粉与水的比例为10g：100mL，pH调至9.5，以100r/min的速度均匀搅拌2.5h，取上清液，再将pH调至4，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得全蝎蛋白。将全蝎蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为20g：100mL，控制pH值在8.5，再加入 Alcalase2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，酶体积与全蝎蛋白重量之比为2mL：100g，反应温度为60℃，搅拌速度为150r/min，反应时间3h。煮沸10min，将酶解液过DEAE sepharose FF阴离子交换柱，从纯净水开始逐渐增大NaCl浓度，以0～1.0mol/L不同浓度NaCl进行线性梯度洗脱，流速控制在0.8mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集第3、4洗脱组分洗脱液，冷冻干燥得抗凝血活性的抗凝血全蝎肽粉；本实施例中所得的抗凝血全蝎肽粉(样品：0.1mg/mL)四项指标分别为APTT：103.56s，PT：42.36s，TT：42.88s，FIB：1.08g/L，溶血栓活性(样品：1mg/mL)为129.67mm2。
实施例16
取500g干净全蝎(Buthus martensii Karsch)干粉，该干粉与水的比例为10g：100mL，pH调至9.5，以100r/min的速度均匀搅拌2.5h，取上清液，再将pH调至4.6，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得全蝎蛋白。将全蝎蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为20g：100mL，分别控制pH值在,8.5,8.0,2.0，7.0,6.5,7.0，再分别加入Alcalase2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)、胰蛋白酶(Sigma公司，美国)、胃蛋白酶(Sigma公司，美国)、木瓜蛋白酶(Sigma公司，美国)、复合蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)、风味蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)进行酶解，对应的酶体积与全蝎蛋白重量之比为0.5/1.0/2.0/2.5/2.0/3.0mL(g)：100g，反应温度为60℃,40℃,37℃,65℃,50℃,50℃，搅拌速度均为150r/min，反应时间分别为3.0h,2.1h,2.8h,2.4h,3.0h,2.8h。煮沸10min，冷冻干燥得粗全蝎肽粉；本实施例中所得的粗全蝎肽粉的抗凝血酶活性分别为928ATU/mg,381ATU/mg,233ATU/mg,408ATU/mg,439ATU/mg,216ATU/mg(如图1所示)。
本实施例以同一批次的全蝎为原料，以体外抗凝血及溶血栓活性为指标，采用胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶Alcalase2.4L六种常用酶对实施例5的全蝎蛋白进行酶解，发现前五种酶做催化剂时，其水解度(DH)均低于15％，抗凝血活性均低于500ATU/mg，Alcalase2.4L对底物蛋白的DH可达到27％，且在DH＝18％时，抗凝血活性可达925ATU/mg。所以，确定采用Alcalase2.4L碱性蛋白酶酶解全蝎蛋白，阴离子层析柱DEAE sepharose FF分离纯化，以获得高活性多肽的最佳工艺条件。酶解产物过阴离子 交换柱的分离峰情况，见图2。从图中可以看出，经碱性蛋白酶酶解后的全蝎粗多肽经阴离子交换柱分成了4个组分(A,B,C,D)，经测定，当样品浓度为0.1mg/mL，A组分的抗凝血四项指标为APTT：67.56s，PT：28.22s，TT：26.88s，FIB：2.48g/L；B组分：APTT：78.36s，PT：34.12s，TT：31.88s，FIB：2.08g/L；C组分：APTT：110.25s，PT：49.42s，TT：48.88s，FIB：0.95g/L；D组分：APTT：110.25s，PT：42.51s，TT：41.78s，FIB：1.10g/L。可以看出，C，D组分的活性均最高，一并收集。
实施例17
采用体外凝血活性四指标和血浆平板法对活性成分的抗凝血和溶血栓效果进行评价，评价方法如下：(以下的体外抗凝血活性与溶血栓活性试验所用到的全蝎多肽均为实施例5所得)
一.体外抗凝血活性四项指标试验
1.材料：APTT(活化部分凝血酶时间)试剂、PT(凝血酶原时间)试剂、TT(凝血酶时间)试剂、FIB(纤维蛋白原浓度)试剂、CaCl2溶液，均购于上海太阳生物试剂公司；血浆，购于广州健阳生物试剂公司；比伐卢定，购于美国Sigma公司。
2.步骤：APTT检测：将100μL APTT试剂、100μL血浆、20μL全蝎多肽置入比色杯，混匀5s，37℃预热5min，再加入100μL浓度为0.025mol/L的CaCl2溶液，记录凝结时间。将样品分别换成同体积浓度的生理盐水和比伐卢定做阴性和阳性对照。
PT检测：将200μL PT试剂和20μL全蝎多肽放入比色杯中，37℃预热5min，再加入100μL已经预热好的37℃血浆，记录凝结时间。将样品分别换成同体积浓度的生理盐水和比伐卢定做阴性和阳性对照。
TT检测：将100μL TT试剂和20μL全蝎多肽放入比色杯中，加入37℃预热好的100μL血浆，记录凝结时间。将样品分别换成同体积浓度的生理盐水和比伐卢定做阴性和阳性对照。
FIB检测：将血浆和生理盐水按1:9的体积比例稀释，取稀释过的血浆200μL和20μL全蝎多肽放入比色杯中，再加入100μL FIB试剂,记录下屏幕上的FIB浓度。将样品分别换成同体积浓度的生理盐水和比伐卢定做阴性和阳性对照。
以上四项指标的测定，每个样品平行做6份，具体结果见表1,。
表1多肽样品在5种不同浓度下的抗凝血活性考察
通过不同浓度全蝎多肽液的抗凝血活性比较，结果表明，阳性对照比伐卢定为公认的高抗凝血药物，当样品和对照浓度在0.01mg/mL，样品PT与阳性对照相当；0.2mg/mL的样品活力已高于0.01mg/mL的比伐卢定。全蝎多肽具有较好的抗凝血活性，随样品浓度增加，活性增强，证明用此法获得抗凝血多肽的方法可行。
二.体外溶血栓活性试验
1.材料：琼脂糖，购于上海伯奥生物有限公司；CaCl2溶液，购于上海太阳生物试剂公司；血浆，购于广州健阳生物试剂公司；纳豆激酶，购于翔博生物试剂公司。
2.步骤：
将0.1g琼脂糖倒入30mL蒸馏水中，加热煮沸，冷却至50℃，加入0.05mol/L(pH7.4)的磷酸盐缓冲溶液5mL，再加1.5mL血浆，最后加入0.025mol/LCaCl2溶液1.5mL，快速搅拌均匀，启动反应，同时趁温倒入(d＝9cm)培养皿，均匀铺板，厚度约1cm。铺板均匀后，水平放置30min，待板内凝胶冷却凝固后用内径0.45cm的打孔器打孔，取不同浓度各样品液和空白对照液50μL注入，最后放于37℃的恒温培养箱中。40h后观察溶解圈大小，记录下圈直径，并计 算其面积，用溶解圈面积来表示溶栓活性。溶解圈面积计算公式如下：
溶解圈面积(mm2)＝[(d长径+d短径)/4]2×π-0.159。(注:0.159为打孔面积)血浆溶栓试验的具体结果，见表2。
表2全蝎多肽在4种不同浓度下的溶栓活力考察
上表可以看出，经碱性蛋白酶酶解、阴性离子交换柱分离得到的全蝎多肽液具有显著地溶血栓功效，并随浓度的增加，溶解圈面积进一步加大，当浓度达到1mg/mL时，溶栓活性显著增加，表明所得多肽活性大大增强，可直接口服，口服后人体消化液对其活性无太大影响。
上述体外抗凝血活性试验表明，通过本发明制得的全蝎多肽同时具备抗凝血和溶血栓的显著功效。全蝎多肽在抗凝血APTT、TT、PT、FIB四指标上均有良好的表现，与阳性对照相比，尤其对PT、FIB有显著贡献。当全蝎浓度达到1mg/mL及以上时，有明显地溶血栓效果。
上述实施例为本发明较佳的方式，但本发明的实施方式不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种具有抗凝血与溶血栓全蝎多肽的酶解制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）取全蝎洗净干燥，粉碎成细粉；加水溶解，细粉与水的溶解比例为5~25 g：100 mL，pH调至7.0~10.0，以100~300r/min的速度均匀搅拌1h~3h，取上清液调pH至3~7，干燥，制得全蝎蛋白；
（2）将步骤（1）得到的全蝎蛋白加水溶解，溶解比例为5~20g：100 mL，控制pH值在7.5~10，再加入碱性蛋白酶作为生物催化剂，进行反应，反应温度为40~80℃，以100~300 r/min匀速搅拌1~5h；煮沸5~30min，灭酶活，结束反应；5000~10000r/min离心，收集上清液，过阴离子交换柱，以0~1.0 mol/L不同浓度氯化钠（NaCl）溶液梯度洗脱，在波长214 nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集洗脱液，富集洗脱下来的高活性多肽组分，浓缩，干燥，得具有抗凝血与溶血栓全蝎多肽。
2.根据权利要求1所述的具有抗凝血与溶血栓全蝎多肽的酶解制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的全蝎品种为全蝎Buthus martensii Karsch；所述干燥为干燥至含水质量小于3%。
3.根据权利要求1所述的具有抗凝血与溶血栓全蝎多肽的酶解制备方法，其特征在于：步骤（2）所述碱性蛋白酶为Alcalase2.4L，酶的活力为2.4 AU/mL。
4.根据权利要求1所述的具有抗凝血与溶血栓全蝎多肽的酶解制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述pH调至7.0~10.0具体为：用0.1~2.0mol/L的氢氧化钠（NaOH）溶液将pH调至7.0~10.0；所述取上清液调pH至3~7具体为：用0.1~2.0mol/L的盐酸（HCl）溶液将上清液的pH调至3~7。
5.根据权利要求1所述的具有抗凝血与溶血栓全蝎多肽的酶解制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述碱性蛋白酶与全蝎蛋白比为0.1~5mL：100g。
6.根据权利要求1所述的具有抗凝血与溶血栓全蝎多肽的酶解制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述碱性蛋白酶与全蝎蛋白比为0.5~4mL：100g。
7.根据权利要求1所述的具有抗凝血与溶血栓全蝎多肽的酶解制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述阴离子交换柱填料为DEAE sepharose FF，所述富集洗脱下来的高活性多肽组分为富集阴离子交换柱中的第3、4吸收峰的洗脱组分。
8.权利要求1-7任一项所述的制备方法得到的具有抗凝血与溶血栓全蝎多肽，其特征在于，所述全蝎多肽的分子量范围为350—3200 Da；所述全蝎多肽为偏酸性多肽。
9.权利要求8所述的具有抗凝血与溶血栓全蝎多肽应用于具有抗凝血与溶血栓功效的功能性食品中，所述功能性食品为粉剂、片剂、口服液或胶囊。
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