CN104004780A - 一种人胞质凝溶胶蛋白的表达纯化方法 - Google Patents
一种人胞质凝溶胶蛋白的表达纯化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104004780A CN104004780A CN201410268959.3A CN201410268959A CN104004780A CN 104004780 A CN104004780 A CN 104004780A CN 201410268959 A CN201410268959 A CN 201410268959A CN 104004780 A CN104004780 A CN 104004780A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hcgsn
- gelsolin
- recombinant
- kytoplasm
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000004878 Gelsolin Human genes 0.000 title claims abstract description 37
- 108090001064 Gelsolin Proteins 0.000 title claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 title abstract description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 21
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 20
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims abstract description 14
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 9
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 claims abstract description 9
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims abstract description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 18
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 8
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 4
- 101150028239 gelsolin gene Proteins 0.000 claims description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 9
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 abstract description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 2
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 abstract 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 abstract 2
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 abstract 2
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 22
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 3
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 3
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 208000037259 Amyloid Plaque Diseases 0.000 description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010010254 Concussion Diseases 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 208000005016 Intestinal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 102000002151 Microfilament Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010040897 Microfilament Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 230000009692 acute damage Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000019771 cognition Effects 0.000 description 1
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002682 neurofibrillary tangle Anatomy 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及一种人胞质凝溶胶蛋白的表达纯化方法，通过设计引物，构建重组表达载体pET-15b-hcGSN，利用IPTG诱导表达得到N端带有His标签的重组目的蛋白hcGSN，并经过镍离子亲和层析一步纯化可以得到纯度较高的重组蛋白hcGSN。本发明还在His标签与hcGSN的氨基酸序列之间设计有凝血酶的切割位点，需要时可以使用凝血酶去除His标签。本发明提供了一种生产重组人胞质凝溶胶蛋白的方法，实现了人胞质凝溶胶蛋白在大肠杆菌中的大量可溶性表达，经镍离子亲和层析纯化能够高效、简便、稳定地获得高纯度的重组人胞质凝溶胶蛋白hcGSN。该重组蛋白为相关科学研究提供物质基础，未来可能被应用于预防和治疗肿瘤与阿尔茨海默症等疾病。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种人胞质凝溶胶蛋白（human cytoplasmic gelsolin，简称hcGSN）的表达纯化方法，包括其工程菌的构建、重组人胞质凝溶胶蛋白的表达和纯化。
背景技术
凝溶胶蛋白普遍存在于细胞、血液和脑脊液中，是一种多功能的肌动蛋白结合蛋白。凝溶胶蛋白的经典功能是调节肌动蛋白丝聚合、解聚和剪切，从而在细胞骨架结构重排和细胞运动等过程中发挥重要作用。同一个凝溶胶蛋白基因由于外显子的不同剪接方式，产生了两种形式的凝溶胶蛋白，包括胞质凝溶胶蛋白和血浆凝溶胶蛋白。血浆凝溶胶蛋白比胞质凝溶胶蛋白在N端多出25个氨基酸残基，其余氨基酸序列完全相同。大量研究证据表明凝溶胶蛋白与多种疾病的发生和发展密切相关。目前血浆凝溶胶蛋白被应用于治疗感染、急性损伤和脓毒症等。
最新的研究发现，胞质凝溶胶蛋白与肿瘤和阿尔茨海默症等疾病相关。与正常组织相比，胞质凝溶胶蛋白在多种癌变组织中的表达呈下降趋势，如乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肠癌及肺癌等。当癌细胞中过量表达胞质凝溶胶蛋白时，细胞集落的形成显著受到抑制。此外，胞质凝溶胶蛋白可能通过抑制癌细胞的生长来抑制机体内肿瘤的生长和转移等。阿尔茨海默症是一种以学习、记忆和认知障碍为主要特征的神经退行性疾病，其特征包括细胞外老年斑、细胞内神经纤维缠结和神经元丢失等。阿尔茨海默症患者脑中老年斑的主要成分是β-淀粉样肽。目前已有多个研究小组尝试使用凝溶胶蛋白来治疗阿尔茨海默症，并且一致发现胞质凝溶胶蛋白和血浆凝溶胶蛋白都能够清除阿尔茨海默症中的老年斑，降低β-淀粉样肽的水平。
未来胞质凝溶胶蛋白有望被应用于预防和治疗肿瘤与阿尔茨海默症等疾病。因此，在体外过量表达并大量纯化胞质凝溶胶蛋白将为相关研究奠定基础。但是目前存在胞质凝溶胶蛋白表达量低和纯化困难等问题。因此，需要对该蛋白的表达纯化方法做进一步的改进。
发明内容
本发明的目的是提供一种人胞质凝溶胶蛋白的表达纯化方法，解决目前存在胞质凝溶胶蛋白表达量低和纯化困难等问题。
本发明通过以下技术方案来实现：一种人胞质凝溶胶蛋白的表达纯化方法，该方法包括以下步骤：
（1）构建含有人胞质凝溶胶蛋白基因（hcGSN）的重组表达载体pET-15b-hcGSN，主要是以人血浆凝溶胶蛋白cDNA（GenBank: X04412.1）为模板，通过设计上游引物FW(hcGSN)：5′- CAGGCCTCGAGGTGGTGGAACACCCCGAGTTCCTC -3′和下游引物RV(hcGSN)：5′-CACGCCTCGAGCTAGGCAGCCAGCTCAGCCATGG-3′，PCR获取人血浆凝溶胶蛋白基因，构建入表达载体得pET-15b-hcGSN；
（2）将重组表达载体pET-15b-hcGSN转化于大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有重组质粒的工程菌株；
（3）将工程菌接种于LB液体培养基中培养，加入终浓度为0.4mM的IPTG，于37℃诱导表达4小时；
（4）5000rpm离心收集菌体并于冰浴中超声波裂解，然后15000rpm离心获取上清；
（5）将上清上样于镍离子亲和层析柱Ni Sepharose 6 Fast Flow，纯化得到N端带有His标签的重组蛋白hcGSN。
进一步的，在所述的His标签与hcGSN的氨基酸序列之间还设计有凝血酶的切割位点，即Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser。
采用上述技术方案的积极效果：本发明利用了基因工程的方法，诱导表达人胞质凝溶胶蛋白，并利用镍离子亲和层析一步纯化等简便技术，可以得到较高纯度的重组人胞质凝溶胶蛋白；本发明实现了人胞质凝溶胶蛋白在大肠杆菌中的大量可溶性表达，经镍离子亲和层析纯化后每升发酵液可以获得30mg带有His标签的重组蛋白hcGSN。在His标签与hcGSN的氨基酸序列之间设计有凝血酶的切割位点（Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser），需要时可以使用凝血酶去除His标签；该方法提供了一种高效生产重组人胞质凝溶胶蛋白的方法，采用大肠杆菌表达系统，能够快速、简便、稳定地获得高纯度的人胞质凝溶胶蛋白。
附图说明
图1通过菌落PCR方法鉴定转化有重组质粒pET-15b-hcGSN的阳性克隆，其中，DNA琼脂糖电泳中泳道M为DNA分子量标准；泳道1为阳性克隆的菌落PCR产物；
图2通过限制性内切酶酶切的方法鉴定重组质粒pET-15b-hcGSN，其中，DNA琼脂糖电泳中泳道M为DNA分子量标准；泳道1为重组质粒pET-15b-hcGSN的XhoI酶切产物；
图3通过SDS-PAGE凝胶电泳分析IPTG诱导下大肠杆菌BL21中重组蛋白hcGSN的表达情况，其中M代表蛋白分子量标准；泳道1为未经IPTG诱导的对照组；泳道2为0.4mM IPTG诱导组；
图4通过SDS-PAGE凝胶电泳分析大肠杆菌表达的重组蛋白hcGSN的可溶性，其中，M代表蛋白分子量标准；泳道1为诱导后细菌裂解液上清；泳道2为诱导后细菌裂解液沉淀；
图5通过SDS-PAGE凝胶电泳分析经亲和层析柱Ni Sepharose 6 Fast Flow纯化的hcGSN蛋白，其中，M为蛋白分子量标准；泳道1为上样样品；泳道2-5为从亲和层析柱洗脱的hcGSN蛋白样品；
图6通过Western blot鉴定重组蛋白hcGSN，其中，M为蛋白分子量标准；泳道1为SHSY-5Y细胞的总蛋白；泳道2为纯化的hcGSN蛋白样品。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：
实施例1
合成扩增人胞质凝溶胶蛋白hcGSN基因的引物，引物设计如下：
上游引物FW(hcGSN)：5′- CAGGCCTCGAGGTGGTGGAACACCCCGAGTTCCTC -3′；
下游引物RV(hcGSN)：5′-CACGCCTCGAGCTAGGCAGCCAGCTCAGCCATGG-3′；
其中上游引物和下游引物中都引入了的限制性内切酶XhoI的单酶切位点。
实施例2
本实施例说明pET-15b-hcGSN重组表达载体的构建。
以人血浆凝溶胶蛋白cDNA（GenBank: X04412.1）为模板，使用实施例1中的上游引物FW(hcGSN)和下游引物RV(hcGSN)，通过PCR扩增hcGSN基因。具体PCR程序如下：95℃预变性5分钟；95℃变性1分钟，64℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，总循环数是25；最后72℃延伸10分钟。用限制性内切酶XhoI分别酶切PCR产物和原核表达载体pET15b。酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒回收得到相应的DNA片段。利用T4 DNA连接酶在16℃进行过夜连接，并将连接产物转化于大肠杆菌DH5α感受态细胞，37℃培养。从转化平板上挑取单克隆，利用菌落PCR的方法来筛选含有pET-15b-hcGSN重组表达载体的阳性克隆。实验结果（见图1）显示，经菌落PCR得到分子量大约为2200 bp的PCR扩增产物（泳道1），初步鉴定为阳性。从筛选出的阳性克隆中提取质粒，并进行XhoI单酶切鉴定。如图2中泳道1显示，重组质粒经XhoI单酶切得到分子量大约为2200 bp的hcGSN DNA片段。另一个分子量大约为5700bp的DNA片段为pET-15b载体的酶切片段。最后将重组质粒pET-15b-hcGSN进行DNA序列分析测定，测序结果完全正确，证明pET-15b-hcGSN表达载体构建成功。
实施例3
本实施例说明hcGSN重组蛋白的表达。
将实施例2构建好的pET-15b-hcGSN重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，获得含有重组质粒的工程菌株。挑取工程菌株的单菌落，接种于LB液体培养基，在37℃下培养过夜。第二天按照1%接种量转至新鲜LB培养基，37℃震荡培养至OD600nm达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4的IPTG诱导4小时。同时设置未加IPTG诱导的菌液作为对照。然后收集菌液，于5000rpm离心获得菌体沉淀。向沉淀中加入SDS-PAGE凝胶电泳的上样缓冲液50mM Tris-HCl（含2% SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油，50 mM NaCl, 0.5 mM PMSF, 100mM DTT，pH 6.8），裂解大肠杆菌。然后进行SDS-PAGE凝胶电泳，检测hcGSN重组蛋白的表达情况。如图3显示，未经IPTG诱导的对照组（泳道1）在90kD附近无蛋白条带出现。在0.4mM IPTG的诱导下（泳道2），hcGSN重组蛋白有显著性表达，在90kD附近出现明显条带，与预期结果相符。这一结果说明hcGSN重组蛋白在大肠杆菌中得到有效的表达。
收集0.4mM IPTG诱导4h后的工程菌，加入裂解液（50 mM Tris-HCl，50 mM NaCl，1 mM PMSF, pH8.0）重悬菌体，并置于冰浴中超声波裂解。同时设置未加IPTG诱导的菌液作为对照。然后将细菌裂解液于15,000 rpm离心20分钟。分别获取上清和沉淀，利用SDS-PAGE凝胶电泳，分析目的hcGSN重组蛋白在大肠杆菌中是否为可溶性表达。从图4中可以看出，在0.4mM IPTG的诱导下，hcGSN重组蛋白主要在上清（泳道1）中表达，沉淀（泳道2）中表达量相对较低。说明在37 ℃培养下，hcGSN重组蛋白主要以可溶形式存在。
实施例4
本实施例说明hcGSN重组蛋白的分离纯化。
离心收集0.4 mM IPTG 诱导4小时后的hcGSN表达菌。在冰上超声波破碎后，15,000 rpm离心20分钟，收集上清。将上清上样于镍离子亲和层析柱 Ni Sepharose 6 Fast Flow (购自GE Healthcare公司)。分别用含10mM咪唑和60mM咪唑的清洗缓冲液(50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 8.0)清洗亲和层析柱，除去非特异性结合的杂蛋白。然后使用含有100 mM咪唑的洗脱缓冲液 (50mM Tris-HCl，50 mM NaCl, pH 8.0) 洗脱hcGSN蛋白，并利用SDS-PAGE凝胶电泳检测hcGSN蛋白的纯化效果。收集亲和层析柱的洗脱液，进行SDS-PAGE凝胶电泳，检测hcGSN蛋白的纯化效果，合并纯度较高的蛋白。如图5所示，与泳道1的上样样品相比，泳道2-5中经过亲和层析纯化的hcGSN蛋白的纯度达到90%以上。
使用超滤离心管浓缩经过亲和层析纯化的hcGSN蛋白样品，然后将其上样于用缓冲液 (50mM Tris-HCl, 50mM NaCl, pH 8.0)平衡好的凝胶过滤层析柱Sephadex G25 (购自GE Healthcare公司)进行脱盐处理。1L发酵液所得菌体经纯化后最终可以得到30mg纯度在90%以上的hcGSN蛋白。
实施例5
本实施例说明hcGSN重组蛋白的鉴定。
为了进一步鉴定纯化出的hcGSN重组蛋白，我们分别将人神经母细胞瘤SHSY-5Y细胞总蛋白和纯化的hcGSN蛋白制样进行Western blot。首先，将制备好的样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后将样品转移到硝酸纤维素膜上。用5%的脱脂牛奶封闭硝酸纤维素膜1小时后，按1：1000 的比例加入抗凝溶胶蛋白的单克隆抗体。在37℃下孵育2小时，然后用含0.05% Tween-20的TBS缓冲液洗去一抗，再加入辣根过氧化物酶标记的IgG二抗，孵育1小时后，洗去二抗，再利用ECL显色发光试剂盒并结合胶片显影观察实验结果。如图6所示，抗凝溶胶蛋白的特异性抗体可以识别hcGSN重组蛋白（泳道2），目的蛋白的条带出现在预期位置（90 kD附近），与SHSY-5Y细胞表达的内源性hcGSN分子量相同（泳道1）。
本发明利用了基因工程的方法，诱导表达人胞质凝溶胶蛋白，并利用镍离子亲和层析一步纯化等简便技术，可以得到较高纯度的重组人胞质凝溶胶蛋白；本发明实现了人胞质凝溶胶蛋白在大肠杆菌中的大量可溶性表达，经镍离子亲和层析纯化后每升发酵液可以获得30mg带有His标签的重组蛋白hcGSN；该方法提供了一种高效生产重组人胞质凝溶胶蛋白的方法，采用大肠杆菌表达系统，能够快速、简便、稳定地获得高纯度的人胞质凝溶胶蛋白。
Claims (2)
1.一种人胞质凝溶胶蛋白的表达纯化方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
（1）构建含有人胞质凝溶胶蛋白基因（hcGSN）的重组表达载体pET-15b-hcGSN；
（2）将重组表达载体pET-15b-hcGSN转化于大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有重组质粒的工程菌株；
（3）将工程菌接种于LB液体培养基中培养，加入终浓度为0.4mM的IPTG，于37℃诱导表达4小时；
（4）5000rpm离心收集菌体并于冰浴中超声波裂解，然后15000rpm离心获取上清；
（5）将上清上样于镍离子亲和层析柱Ni Sepharose 6 Fast Flow，纯化得到N端带有His标签的重组蛋白hcGSN。
2.根据权利要求1所述的人胞质凝溶胶蛋白的表达纯化方法，其特征在于：所述的His标签与hcGSN的氨基酸序列之间还设计有凝血酶的切割位点，即Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410268959.3A CN104004780A (zh) | 2014-06-17 | 2014-06-17 | 一种人胞质凝溶胶蛋白的表达纯化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410268959.3A CN104004780A (zh) | 2014-06-17 | 2014-06-17 | 一种人胞质凝溶胶蛋白的表达纯化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104004780A true CN104004780A (zh) | 2014-08-27 |
Family
ID=51365687
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410268959.3A Pending CN104004780A (zh) | 2014-06-17 | 2014-06-17 | 一种人胞质凝溶胶蛋白的表达纯化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104004780A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105403558A (zh) * | 2015-11-18 | 2016-03-16 | 沈阳药科大学 | 一种快速检测铅离子的方法 |
| CN110592132A (zh) * | 2019-10-09 | 2019-12-20 | 武汉博欧特生物科技有限公司 | 恶臭假单胞菌kt2440蛋白同源表达载体的构建及表达、纯化方法 |
| CN112553231A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-03-26 | 华南农业大学 | 一种重组人热休克蛋白HSP90-His及其表达和纯化方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009094194A2 (en) * | 2008-01-25 | 2009-07-30 | The General Hospital Corporation | Diagnostic and therapeutic uses of gelsolin in renal failure |
| CN102321629A (zh) * | 2011-08-09 | 2012-01-18 | 宁波大学 | 从浙江枝吻纽虫中制备凝溶胶蛋白的方法 |
-
2014
- 2014-06-17 CN CN201410268959.3A patent/CN104004780A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009094194A2 (en) * | 2008-01-25 | 2009-07-30 | The General Hospital Corporation | Diagnostic and therapeutic uses of gelsolin in renal failure |
| CN102321629A (zh) * | 2011-08-09 | 2012-01-18 | 宁波大学 | 从浙江枝吻纽虫中制备凝溶胶蛋白的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JI L.等: "Gelsolin is proteolytically cleaved in the brains of individuals with Alzheimer’s disease", 《JOURNAL OF ALZHEIMER’S DISEASE》 * |
| SHINJI KAMADA 等: "A cloning method for caspase substrate that uses the yeast two-hybrid system：Cloning of the antiapoptotic gene gelsolin", 《PROC. NATL. ACAD. SCI. USA》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105403558A (zh) * | 2015-11-18 | 2016-03-16 | 沈阳药科大学 | 一种快速检测铅离子的方法 |
| CN105403558B (zh) * | 2015-11-18 | 2019-04-02 | 沈阳药科大学 | 一种快速检测铅离子的方法 |
| CN110592132A (zh) * | 2019-10-09 | 2019-12-20 | 武汉博欧特生物科技有限公司 | 恶臭假单胞菌kt2440蛋白同源表达载体的构建及表达、纯化方法 |
| CN112553231A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-03-26 | 华南农业大学 | 一种重组人热休克蛋白HSP90-His及其表达和纯化方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104004780A (zh) | 一种人胞质凝溶胶蛋白的表达纯化方法 | |
| CN106478808B (zh) | 识别ny-eso-1抗原短肽的t细胞受体 | |
| CN103880943A (zh) | 一种rhNGF成熟肽的制备方法 | |
| CN106336457A (zh) | 识别mage-a3抗原短肽的t细胞受体 | |
| CN104774270A (zh) | 一种腺癌特异性EpCAM-GM-CSF基因重组融合蛋白及其制备方法 | |
| CN103088050B (zh) | 一种成熟人β防御素-2及其制备方法 | |
| CN110305224B (zh) | 一种具有阻抗蛋白聚集功能的Aβ42修饰蛋白及其表达与纯化方法 | |
| CN110054687B (zh) | 草鱼atg12多克隆抗体及其制备方法 | |
| CN105801691B (zh) | 一种hpv16e7单克隆抗体及其制备方法和应用 | |
| CN107446941A (zh) | 基于自聚集短肽诱导的天蚕素a抗菌肽及其制备方法 | |
| CN107090442B (zh) | 一种N糖基转移酶BtNGT及其应用 | |
| CN101643511A (zh) | 抑制端粒酶活性的融合蛋白、其制备及应用 | |
| CN103103209B (zh) | 一种家蚕气味结合蛋白BmOBP2的表达纯化方法 | |
| CN105753980B (zh) | 一种hpv18 e6单克隆抗体及其制备方法和应用 | |
| CN114478776B (zh) | 一种抗鸡tlr15蛋白的多克隆抗体及制备方法 | |
| CN106132986B (zh) | TRAIL穿膜肽样突变体MuR5、制备方法及应用 | |
| CN107686519B (zh) | 抗小鼠mxra7单克隆抗体的制备方法及其应用 | |
| CN102776154A (zh) | 小鼠抗人β-Tubulin单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株 | |
| CN113321721B (zh) | 一种细胞外Ezrin蛋白及其应用 | |
| CN104004726A (zh) | 穿膜型的带有荧光标签的talen-r11蛋白及其制备方法和应用 | |
| KR101354652B1 (ko) | 세포투과성 ｐ５３ 재조합 단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암 조성물 | |
| CN110204615B (zh) | 一种刚地弓形虫泛素激活酶1（TgUba1）多克隆抗体及其制备方法和应用 | |
| CN106913864A (zh) | 融合蛋白tat‑dcf1的新用途 | |
| CN103789340A (zh) | 一种高效制备重组人mica蛋白的方法 | |
| CN108178797B (zh) | 一种抗家蚕BmSRC多克隆抗血清、制备方法及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140827 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |