CN102321629A

CN102321629A - 从浙江枝吻纽虫中制备凝溶胶蛋白的方法

Info

Publication number: CN102321629A
Application number: CN201110226004A
Authority: CN
Inventors: 李晔; 陈蕾; 苏秀榕; 李太武; 李振; 周君; 李成华
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2011-08-09
Filing date: 2011-08-09
Publication date: 2012-01-18

Abstract

本发明公开了浙江枝吻纽虫体壁通过RNA提取、cDNA合成、酶切、连接转化、重组质粒转化、重组蛋白诱导表达和重组蛋白的分离纯化，cDNA合成后用适合的双酶切引物进行PCR扩增得到目的片段的PCR产物，对引物和适合的表达载体双分酶切后连接，再转化到适合的宿主，分离纯化采用Ni-NTAHis.BindResin试剂盒的改进操作的方法，在非变性的条件下进行，从而省却了繁琐的复性步骤，也更有利于保持重组蛋白的天然活性，得到纯度较高的重组凝溶胶蛋白，本法制备的重组凝溶胶蛋白以可溶性的形式存在，且浓度约为85%，对肿瘤细胞呈现出明显的抑制作用，本发明的方法科学合理，简便易行，易于推广。

Description

从浙江枝吻纽虫中制备凝溶胶蛋白的方法

技术领域

本发明涉及凝溶胶蛋白的制备方法，具体涉及从浙江枝吻纽虫中制备凝溶胶蛋白的方法。

背景技术

凝溶胶蛋白(Gelsolin)最早是在兔肺的巨噬细胞中发现，是一种重要的肌动蛋白结合蛋白，其参与到细胞运动、细胞程序性死亡等生命活动中。目前凝溶胶蛋白的研究主要集中在结构、作用机制以及对某些疾病的影响；已有研究显示，凝溶胶蛋白具有治疗感染和治风湿性炎症的作用，也有明显的肿瘤抑制作用，在多种肿瘤中表达明显降低，与恶性肿瘤的发生和发展密切相关，被认为是一个候选的抑癌基因。

浙江枝吻纽虫(Dendrorhynchus zhejiangensis)，属于纽形动物门(Nematinea)、异纽目(Heteronemertea)、纵沟虫科(Lineidae)、枝吻纽虫属(Dendrorhynchus)，最早在浙江省东部奉化市沿海的虾塘中发现，因其独特的分支状的吻系统而得名。纽虫动物具有极强的再生能力，独特的脂肪代谢方式，适应能力，但对它的各方面研究国内外均较少见，其中关于纽虫中凝溶胶蛋白的抗肿瘤作用和该蛋白的制备纯化方法未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供从浙江枝吻纽虫中制备凝溶胶蛋白的方法，该凝溶胶蛋白纯度较高，约为85%，具有抗肿瘤活性。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：从浙江枝吻纽虫中制备凝溶胶蛋白的方法，包括下述步骤：

a、RNA提取：清洗浙江枝吻纽虫得到浙江枝吻纽虫体壁，将浙江枝吻纽虫体壁速冻于液氮中，研磨成粉，然后用RNAiso plus RNA提取试剂盒（购于Takara公司）提取总RNA，具体方法依照试剂盒说明进行操作：体壁组织研磨成粉后，加入RNAiso裂解液，浙江枝吻纽虫体壁与裂解液的重量体积比为1：20，匀浆，室温下静置5分钟，4℃，12000 rpm/min离心5分钟，取第一上清液，加入氯仿，第一上清液与氯仿的体积比为5：1，待溶液充分乳化后，室温下静置5分钟，4℃，12000 rpm/min离心15分钟，取第二上清液，加入异丙醇，第二上清液与异丙醇的体积比为1：1，室温下静置10分钟，4℃，12000 rpm/min离心10分钟，弃上清，沉淀用75%乙醇振荡洗涤，4℃，12000 rpm/min离心多少时间，干燥沉淀等得到总RNA；

b、cDNA合成：将提取的总RNA用cDNA试剂盒（购于Takara公司）合成cDNA，具体合成方法依该cDNA试剂盒说明操作，然后用下述引物进行PCR扩增，G-R: 5’-CGGGATCCAT GTCTGGACTT GTAAAA-3’（斜体为BamHⅠ的酶切位点）和G-F: 5’-CCCAAGCTTT CAAGCCATGA GTGTCTT-3’（斜体为Hind Ⅲ的酶切位点），引物由上海生工生物工程有限公司合成，PCR扩增程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min；72℃ 10 min， PCR扩增后，用胶体金回收试剂盒（购自Omega公司）回收，具体回收方法依该回收试剂盒说明操作，切胶回收得到含纽虫凝溶胶蛋白的目的片段的PCR产物；

c酶切：目的片段双酶切体系为：13 μl（约含2 μgDNA）上述PCR产物，1 μl BamHⅠ酶，1 μl Hind Ⅲ酶，2 μl 10×K缓冲液（buffer），加水补到总体积为20μl，37℃作用2 h，用回收试剂盒（购自Omega公司）回收，具体回收方法依该回收试剂盒说明操作，得到酶切后的目的片段；pET28a（+）载体的双酶切体系为：2 μl（含1 μg载体DNA）pET28a（+）载体（购自Invitrogen公司），0.5 μl BamHⅠ酶，0.5 μl Hind Ⅲ酶，1 μl 10×K 缓冲液，加水补到总体积为10μl，37℃作用2 h，回收试剂盒（购自Omega公司）回收，具体回收方法依该回收试剂盒说明操作，得到酶切后的pET28a（+）表达载体； BamHⅠ、Hind Ⅲ和K buffer均购自NEB公司；

d连接转化：将上述酶切后的目的片段与酶切后的pET28a（+）表达载体进行连接，具体连接体系为：酶切后的目的片段7μl，酶切后的pET28a（+）表达载体1μl，T4 DNA ligase buffer 1μl，T4 DNA ligase 1μl，16℃连接过夜，连接结束后，转化至E. coli DH5α中，得到含目的片段-pET28a（+）的E. coli DH5α质粒； T4 DNA ligase buffer、T4 DNA ligase和E. coli DH5α均购于Takara公司；

e重组质粒转化：将上述含目的片段-pET28a（+）的E. coli DH5α质粒涂布于含50μg/ml 卡那霉素的LB培养基上，挑取阳性克隆，进行PCR检测并测序，通过与NCBI（AAB02227、CAB04676、EDV38176、ACM777881、CAA24529、ACD13863）上的序列比对后，提取序列正确的重组质粒重新转化至E. coli BL21（DE3）（购于Takara公司），得到含目的片段-pET28a（+）E. coli BL21质粒；

f重组蛋白诱导表达：将上述含目的片段-pET28a（+）E. coli BL21质粒接种到含50μg/ml 卡那霉素的LB培养基(购于上海生工)上，37℃，120 r/min振荡培养至生长对数期为A₆₀₀=0.6-0.8，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）使其终浓度为1 mmol/L，37℃诱导4 h，菌液经12000 r/min，离心5 min后，弃上清，菌体沉淀冻存备用；

g重组蛋白的分离纯化：上述步骤f得到的菌体采用Ni-NTA His. Bind Resin试剂盒（购于Novagen公司）进行分离纯化，具体操作按照试剂盒说明并进行简单改进：3ml菌体沉淀悬浮于200μl 的Wash Buffer溶液中，该Wash Buffer溶液pH 8.0，含有50 mM NaH₂PO₄，300 mM NaCl和 10 mM imidazole（购于Invitrogen公司），在4℃，400 W，5-10 min超声破碎，然后在12000 r/min，离心10 min，取上清加入50μl 的Ni-NTA Agarose，用250μl的 Wash Buffer溶液分三次洗涤，洗去非特异性结合的杂蛋白；然后用25μl的Elution Buffer溶液分三次洗脱，得到洗脱液，Elution Buffer溶液pH 8.0，含有50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl和250 mM imidazole，洗脱液装入透析袋中，加入pH7.5，Tris-HCl浓度为50 mM的透析液，所述洗脱液与所述透析液的体积比为1：100，在4℃透析过夜亲和，层析，分离纯化，得到重组凝溶胶蛋白。

分离纯化后的重组凝溶胶蛋白通过10%SDS-PAGE检测纯度，并运用超微量仪测定浓度。实验的结果显示通过此种方法制备的重组凝溶胶蛋白具有较好的纯度（约85%）。该重组凝溶胶蛋白作用于人胃癌细胞株MGC803，经MTT比色法显示，与对照组比较，对MGC803细胞的增殖有明显的抑制作用，减缓了细胞的生长速度，且随着蛋白浓度的增加和作用时间的延长，其对细胞增殖的抑制作用明显增强。蛋白作用24 h时，浓度为0.3μg/ml的蛋白对MGC803细胞的抑制率为16.37%，蛋白浓度为 3μg/ml时对MGC803细胞的抑制率为22.04%，蛋白浓度为30μg/ml对MGC803细胞的抑制率为34.53%。

与现有技术相比，本发明的优点在于浙江枝吻纽虫体壁通过RNA提取、cDNA合成、酶切、连接转化、重组质粒转化、重组蛋白诱导表达和重组蛋白的分离纯化，cDNA合成后用适合的双酶切引物进行PCR扩增得到目的片段的PCR产物，对引物和适合的表达载体双分酶切后连接，再转化到适合的宿主，分离纯化采用Ni-NTA His. Bind Resin试剂盒的改进操作的方法，在非变性的条件下进行，从而省却了繁琐的复性步骤，也更有利于保持重组蛋白的天然活性，得到纯度较高的重组凝溶胶蛋白，本法制备的重组凝溶胶蛋白以可溶性的形式存在，且浓度约为85%，对肿瘤细胞呈现出明显的抑制作用，本发明的方法科学合理，简便易行，易于推广。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例

从浙江枝吻纽虫中制备凝溶胶蛋白的方法，包括下述步骤：

a、RNA提取：清洗浙江枝吻纽虫得到浙江枝吻纽虫体壁，将浙江枝吻纽虫体壁速冻于液氮中，研磨成粉，然后用RNAiso plus RNA提取试剂盒提取总RNA，具体方法依照试剂盒说明进行操作：体壁组织研磨成粉后，称重5克，加入100ml的RNAiso裂解液，匀浆，室温下静置5分钟，4℃，12000 rpm/min离心5分钟，取第一上清液，加入氯仿，第一上清液与氯仿的体积比为5：1，待溶液充分乳化后，室温下静置5分钟，4℃，12000 rpm/min离心15分钟，取第二上清液，加入异丙醇，第二上清液与异丙醇的体积比为1：1，室温下静置10分钟，4℃，12000 rpm/min离心10分钟，弃上清，沉淀用75%乙醇振荡洗涤，4℃，12000 rpm/min离心多少时间，干燥沉淀得到浙江枝吻纽虫总RNA；

b、cDNA合成：将提取的总RNA用cDNA试剂盒合成cDNA，依该cDNA试剂盒说明操作合成，然后进行PCR扩增，扩增引物为CGGGATCCATGTCTGGACTTGTAAAA和CCCAAGCTTTCAAGCCATGAGTGTCTT，PCR扩增程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min；72℃ 10 min， PCR扩增后，用胶体金回收试剂盒回收，具体回收方法依该回收试剂盒说明操作，切胶回收得到含纽虫凝溶胶蛋白的目的片段的PCR产物；

c酶切：目的片段双酶切体系为：13 μl（含2 μgDNA）上述PCR产物，1 μl BamHⅠ酶，1 μl Hind Ⅲ酶，2 μl 10×K buffer，加水补到总体积为20μl，37℃作用2 h，用回收试剂盒回收，具体回收方法依该回收试剂盒说明操作，得到酶切后的目的片段；pET28a（+）载体的双酶切体系为：2 μl（含1 μg载体DNA）pET28a（+）载体，0.5 μl BamHⅠ酶，0.5 μl Hind Ⅲ酶，1 μl 10×K 缓冲液，加水补到总体积为10μl，37℃作用2 h，回收试剂盒回收，具体回收方法依该回收试剂盒说明操作，得到酶切后的pET28a（+）表达载体；

d连接转化：将上述酶切后的目的片段与酶切后的pET28a（+）表达载体进行连接，具体连接体系为：目的片段7μl，表达载体1μl，T4 DNA ligase buffer 1μl，T4 DNA ligase 1μl，16℃连接过夜，连接结束后，转化至E. coli DH5α中，得到含目的片段-pET28a（+）的E. coli DH5α质粒；

e重组质粒转化：将上述含目的片段-pET28a（+）的E. coli DH5α质粒涂布于含50μg/ml 卡那霉素的LB培养基上，挑取阳性克隆，进行PCR检测并测序，通过与NCBI上的序列比对后，提取序列正确的重组质粒重新转化至E. coli BL21（DE3），得到含目的片段-pET28a（+）E. coli BL21质粒；

f重组蛋白诱导表达：将上述含目的片段-pET28a（+）E. coli BL21质粒接种到含50μg/ml 卡那霉素的LB培养基上，37℃，120 r/min振荡培养至生长对数期为A₆₀₀=0.6-0.8，加入IPTG使其终浓度为1 mmol/L，37℃诱导4 h，菌液经12000 r/min，离心5 min后，弃上清，菌体沉淀冻存备用；

g重组蛋白的分离纯化：上述步骤f得到的菌体采用Ni-NTA His. Bind Resin试剂盒进行分离纯化，具体操作按照试剂盒说明并进行简单改进：3ml菌体沉淀悬浮于200μl 的Wash Buffer溶液中，该Wash Buffer溶液pH 8.0，含有50 mM NaH₂PO₄，300 mM NaCl和 10 mM imidazole（购于Invitrogen公司），在4℃，400 W，5-10 min超声破碎，然后在12000 r/min，离心10 min，取上清加入50μl 的Ni-NTA Agarose，用250μl的 Wash Buffer溶液分三次洗涤，洗去非特异性结合的杂蛋白；然后用25μl的Elution Buffer溶液分三次洗脱，得到洗脱液，Elution Buffer溶液pH 8.0，含有50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl和250 mM imidazole，洗脱液装入透析袋中，加入pH7.5，Tris-HCl浓度为50 mM的透析液，所述洗脱液与所述透析液的体积比为1：100，在4℃透析过夜亲和，层析，分离纯化，得到重组凝溶胶蛋白。

试验例

该重组凝溶胶蛋白（浓度分别为0.3μg/ml、3μg/ml和30μg/ml）作用于人胃癌细胞株MGC803，作用24 h时，经MTT比色法显示，与空白对照组比较，该重组凝溶胶蛋对MGC803细胞的增殖有明显的抑制作用，减缓了细胞的生长速度，且随着蛋白浓度的增加和作用时间的延长，其对细胞增殖的抑制作用明显增强：结果蛋白浓度为0.3μg/ml对MGC803细胞的抑制率为16.37%，蛋白浓度为 3μg/ml对MGC803细胞的抑制率为22.04%，蛋白浓度为30μg/ml对MGC803细胞的抑制率为34.53%，空白对照无抑制，说明本发明从浙江枝吻纽虫中制备的组凝溶胶蛋白具有明显的抗肿瘤作用。

<110>宁波大学

<120>从浙江枝吻纽虫中制备凝溶胶蛋白的方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210>1

<211> 26

<212> RNA

<213>人工序列

<220>

<223>制备浙江枝吻纽虫凝溶胶蛋白设计的正向引物

<400>1

CGGGATCCAT GTCTGGACTT GTAAAA 26

<210>2

<211> 27

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>制备浙江枝吻纽虫凝溶胶蛋白设计的反向引物

<400>2

CCCAAGCTTT CAAGCCATGA GTGTCTT 27

Claims

1.从浙江枝吻纽虫中制备凝溶胶蛋白的方法，其特征在于包括下述步骤：

a、RNA提取：清洗浙江枝吻纽虫得到浙江枝吻纽虫体壁，将浙江枝吻纽虫体壁速冻于液氮中，研磨成粉，然后用RNAiso plus RNA提取试剂盒提取总RNA，具体方法依照试剂盒说明进行操作；

b、cDNA合成：将提取的总RNA用cDNA试剂盒合成cDNA，具体合成方法依该cDNA试剂盒说明操作，然后用下述引物进行PCR扩增：CGGGATCCAT GTCTGGACTT GTAAAA和CCCAAGCTTT CAAGCCATGA GTGTCTT； PCR扩增程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min；72℃ 10 min， PCR扩增后，用胶体金回收试剂盒回收，具体回收方法依该回收试剂盒说明操作，切胶回收得到含纽虫凝溶胶蛋白的目的片段的PCR产物；

c、酶切：目的片段双酶切体系为：13 μl上述PCR产物，1 μl BamHⅠ酶，1 μl Hind Ⅲ酶，2 μl 10×K缓冲液，加水补到总体积为20μl，37℃作用2 h，用回收试剂盒回收，具体回收方法依该回收试剂盒说明操作，得到酶切后的目的片段；pET28a（+）载体的双酶切体系为：2 μlpET28a（+）载体，0.5 μl BamHⅠ酶，0.5 μl Hind Ⅲ酶，1 μl 10×K 缓冲液，加水补到总体积为10μl，37℃作用2 h，用回收试剂盒回收，具体回收方法依该回收试剂盒说明操作，得到酶切后的pET28a（+）表达载体；

d、连接转化：将上述酶切后的目的片段与酶切后的pET28a（+）表达载体进行连接，具体连接体系为：酶切后的目的片段7μl，酶切后的pET28a（+）表达载体1μl，T4 DNA ligase buffer 1μl，T4 DNA ligase 1μl，16℃连接过夜，连接结束后，转化至E. coli DH5α中，得到含目的片段-pET28a（+）的E. coli DH5α质粒；

e、重组质粒转化：将上述含目的片段-pET28a（+）的E. coli DH5α质粒涂布于含50μg/ml 卡那霉素的LB培养基上，挑取阳性克隆，进行PCR检测并测序，序列比对后，提取序列正确的重组质粒重新转化至E. coli BL21（DE3），得到含目的片段-pET28a（+）E. coli BL21质粒；

f、重组蛋白诱导表达：将上述含目的片段-pET28a（+）E. coli BL21质粒接种到含50μg/ml 卡那霉素的LB培养基上，37℃，120 r/min振荡培养至生长对数期为A₆₀₀=0.6-0.8，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷使其终浓度为1 mmol/L，37℃诱导4 h，菌液经12000 r/min，离心5 min后，弃上清，菌体沉淀冻存备用；

g、重组蛋白的分离纯化：将上述步骤f得到的菌体采用Ni-NTA His. Bind Resin试剂盒进行分离纯化，具体操作按照试剂盒说明并进行简单改进：3ml菌体沉淀悬浮于200μl 的Wash Buffer溶液中，该Wash Buffer溶液pH 8.0，含有50 mM NaH₂PO₄，300 mM NaCl和 10 mM imidazole，在4℃，400 W，5-10 min超声破碎，然后在12000 r/min，离心10 min，取上清加入50μl 的Ni-NTA Agarose，用250μl的 Wash Buffer溶液分三次洗涤，洗去非特异性结合的杂蛋白；然后用25μl的Elution Buffer溶液分三次洗脱，得到洗脱液，Elution Buffer溶液pH 8.0，含有50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl和250 mM imidazole，洗脱液装入透析袋中，加入pH7.5，Tris-HCl浓度为50 mM的透析液，所述洗脱液与所述透析液的体积比为1：100，在4℃透析过夜亲和，层析，分离纯化，得到重组凝溶胶蛋白。