CN103995081B - 2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷在三叉苦药材质量检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷(C20H28O14)的应用，属于药物分析技术领域。本发明涉及2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷在三叉苦药材质量检测中的应用，是以三叉苦药材中含有的专属性成分2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷作为指标成分，采用常规的薄层色谱法和常规的高效液相色谱法对三叉苦药材进行鉴别和含量测定。建立三叉苦药材中2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷的薄层色谱鉴别方法和含量测定方法，应用于药材质量检测，能准确控制药材的真伪和优劣，确保药材的有效性和安全性，具有非常重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷(C20H28O14)的应用，属于药物分析技术领域。
背景技术
三叉苦为芸香科吴茱萸属植物三桠苦Evodia lepta(Spreng.)Merr.的干燥枝叶(《中国药典》1977年版一部，人民卫生出版社，1978)或干燥全株(《广西中药材标准》1990版，广西科学技术出版社，1992)或干燥茎及带叶嫩枝(《湖南省中药材标准》【2009年版】，湖南科学技术出版社，2010)。三叉苦又名三丫苦、小黄散、鸡骨树、三叉虎等，傣药称为“郎晚”。2008年英文版《中国植物志》第11卷(《Flora of China》Vol.11)则把三桠苦归置于蜜茱萸属，拉丁名为Melicope pteleifolia(Champion ex Bentham)T.G.Hartley。三叉苦产于云南、广东、广西、海南、福建、台湾、江西、浙江以及柬埔寨、老挝、越南、缅甸、泰国等地。
三叉苦为常绿灌木或小乔木或乔木，高(1～)2～6(～8)米，茎枝无刺，树皮灰白或灰绿或青灰色，嫩枝及叶柄均无毛，嫩枝的节部常呈压扁状。叶对生，3小叶，偶有2小叶或单小叶同时存在，叶柄基部稍增粗，小叶长椭圆形，两端尖，长5～20厘米，宽2～8厘米，无毛，全缘，油点多，有类似柑橘叶的香气；小叶柄1～4毫米。伞房圆锥花序，腋生，花小，甚多，单性，雌雄异株；萼片及花瓣均4片；萼片细小，长约0.5毫米；花瓣淡黄色或白色，长1～2毫米，常有透明油点，干后油点变暗褐至褐黑色；雄花的退化雌蕊细垫状凸起，密被白色短毛，雄蕊4～5，与花瓣互生；雌花的退化不育雄蕊4，有花药而无花粉，花柱与子房等长或略短，柱头头状。开裂的蓇葖果，分果瓣淡黄色或茶褐色，干时内卷与内果分离，散生肉也可见的透明油点，每分果瓣有1粒种子；种子卵珠形，长2～4(～5)毫米，厚2～3毫米，蓝黑色，有光泽。花期3～6月，果期6～10月。
三叉苦始载于《岭南采药录》，在《福建中草药》、广州部队《常用中草药手册》、《广西中草药》中，以及《云南中草药》、《云南思茅中药选集》、《德宏民族药志》、《西双版纳傣药志》、《基诺族医药》等云南民族药专著中均有记载。三叉苦是药食两用植物，已经在三九胃泰、三九感冒灵、消结安胶囊等30多种中药民族药成方制剂中得到广泛应用。三叉苦具有清热解毒、消炎止痛、行气止痛、燥湿止痒、祛风除湿等功效，主要用于感冒、咽喉肿痛、胃脘痛、风湿痹痛、皮肤瘙痒等疾病的治疗。
目前，已经从三叉苦中分离鉴定了130种以上的化合物，其中，主要有生物碱、苯并吡喃、苯并二氢吡喃、黄酮、香豆素、苯乙酮等，三叉苦中的这些化合物虽然都具有鲜明的结构特征，如普遍存在异戊烯基结构等，但是，这些化合物基本都不是三叉苦的特征性成分，都不具有专属性。三叉苦药材质量标准，包括《中国药典》1977版一部和广东、广西、湖南等地方药材标准，除《广西中药材标准》(1996年第二册)收载有与对照药材比较的TLC鉴别外，其余均只有性状鉴别或性状和显微鉴别，无专属性强、能有效控制药材真伪、优劣的质量控制指标和方法。目前也未见三叉苦特征性、专属性成分的研究报道。而药材质量检测对确保成方制剂产品安全、有效、质量稳定如一，具有重要的实际意义。
发明内容
本发明的目的是为了准确检测三叉苦药材的质量，提供一种2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷在三叉苦药材质量检测中的新应用。
本发明涉及2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷在三叉苦药材质量检测中的应用，是以三叉苦药材中含有的专属性成分2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷作为指标成分，采用常规的薄层色谱法和常规的高效液相色谱法对三叉苦药材进行鉴别和含量测定。
本发明应用2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷进行三叉苦药材的鉴别和含量测定的步骤如下：
一、用常规方法制备得到2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷；
二、2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷对照品溶液的制备
称取2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷对照品，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成每1ml含0.001～1mg的溶液，滤过，取续滤液作为对照品溶液，溶剂是甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、水或这些溶剂任意比例的混合溶液；
三、供试品溶液的制备
取三叉苦茎或叶，粉碎，混匀，取粉末供试品精密称定，供试品含2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷0.01～10mg；在上述供试品中加入5～100ml溶剂，所述的溶剂是甲醇、乙醇、正丁醇、乙腈、丙酮、水或这些溶剂任意比例的混合溶液，超声处理5～60分钟，或加热回流5～60分钟，放冷，滤过，滤液按照以下方法中的一种处理，制成供试品溶液：
(1)取滤液，加相应溶剂稀释制成每1ml含2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷0.001～1mg的溶液，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
(2)取滤液，蒸干，残渣加水2～30ml使溶解，用乙酸乙酯萃取2～5次，每次2～30ml，分取水层液，蒸干，残渣加溶剂1～10ml使溶解，滤过，取续滤液作为供试品溶液，溶剂是甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、水或这些溶剂任意比例的混合溶液；
(3)取滤液，蒸干，残渣加水2～30ml使溶解，加在D101大孔吸附树脂柱上，树脂柱内径1～2.5cm，树脂床高2～15cm，用水10～100ml洗脱，弃去洗脱液，再用体积百分比为5～50％的甲醇或5～50％的乙醇20～200ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加溶剂1～10ml使溶解，滤过，取续滤液作为供试品溶液，溶剂是甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、水或这些溶剂任意比例的混合溶液；
(4)取滤液，蒸干，残渣加水2～5ml使溶解，加入等体积的2～4mol/LHCl溶液，90℃水浴中保温15～150分钟，滤过，取续滤液作为供试品溶液，或加入1倍体积以上的相应溶剂稀释后滤过，取续滤液作为供试品溶液，溶剂是甲醇、乙醇、乙腈或丙酮；
四、薄层色谱鉴别
照薄层色谱法(《中国药典》一部附录ⅥB)试验，吸取上述供试品溶液1～10μl和对照品溶液1～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，用氯仿-甲醇-甲酸-水5～9:1～5:0.2～1:0.2～1、或甲醇-水10:0.2～2、或正丁醇-乙酸-甲酸-水10:0～5:0～5:0.1～0.5的上清液作为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5～20％硫酸乙醇溶液、或1～10％三氯化铁乙醇溶液、或2～10％香草醛5～20％硫酸乙醇溶液、或0.5～2％三氯化铝乙醇溶液作为显色剂，室温或加热显色，365nm紫外光灯下或日光下检视；
五、高效液相色谱含量测定
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-酸水溶液或乙腈-水溶液5～15：95～85、甲醇-酸水溶液或甲醇-水溶液5～30：95～70为流动相，酸水是体积百分比为0.05～5％的甲酸溶液、乙酸溶液、磷酸溶液、三氟乙酸溶液中的任意一种，检测波长为230±3nm或285±3nm；理论塔板数按2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷峰计算不低于3000；
测定方法照高效液相色谱法(《中国药典》一部附录ⅥD)测定，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1～20μl，分别注入液相色谱仪，测定，即得。
所述的常规方法制备2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷(C20H28O14)，可以是以下方法：
取三叉苦的干燥叶，粉碎成粗粉，用体积百分比为0～100％的甲醇或乙醇或正丁醇回流提取，提取液减压浓缩得浸膏，浸膏加水溶解，用正己烷萃取，水层除去溶剂后通过D101大孔吸附树脂柱，水洗涤，5～60％乙醇洗脱，洗脱液减压干燥，干燥物加甲醇溶解，拌膏，上硅胶柱分离，乙酸乙酯-甲醇混合溶液洗脱，收集目标流分，减压干燥，干燥物加水溶解，反复通过ODS柱纯化，5～30％甲醇洗脱，收集目标流分，冷冻干燥，即得2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷纯品，经MS、1H-NMR、13C-NMR等确定结构，HPLC检查面积归一法计算纯度为98.59％。2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷溶于水、甲醇、乙醇等溶剂。
2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷(C20H28O14)是三叉苦药材的主要专属性成分，在我们检测的来自云南、广东、广西等不同产地、不同季节的26份三叉苦药材样品中，均含有一定量的2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷，而在我们同时检测的同为芸香科吴茱萸属的吴茱萸Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.的叶、果实，以及同为芸香科的飞龙掌血属的飞龙掌血Toddalia asiatica(L.)Lam.、柑橘属的佛手Citrus medica L.(栽培种)和香橼C.medica L.(栽培种)和甜橙C.sinensis(L.)Osb.(栽培种)、花椒属的云南花椒Zanthoxylum khasianum Hook.(栽培种)、金橘属的金柑Fortunella japonica(Thunb.)Swingle(栽培种)等植物的叶，均不含有2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷。因此，建立三叉苦药材中2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷的薄层色谱鉴别方法和含量测定方法，应用于药材质量检测，能准确控制药材的真伪和优劣，确保药材的有效性和安全性，具有非常重要的意义。
本发明首次发现2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷为三叉苦的专属性成分，将2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷(C20H28O14)作为指示性成分，采用常规的薄层色谱法和常规的高效液相色谱法对三叉苦药材进行鉴别和含量测定，专属性好，操作简便，可准确检测药材的真伪和质量，具有实际意义。
三叉苦中2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷(C20H28O14)的薄层色谱鉴别和高效液相色谱含量测定的方法学研究：
1、仪器与材料
研究用药材样品共26个，其中18个于不同季节采自云南、广东、广西的不同地区，均经鉴定为芸香科植物三叉苦Evodia lepta(Spreng)Merr.，8个购买自安徽亳州中药材市场等中药材市场，经鉴定均为三叉苦Evodia lepta(Spreng)Merr.。
薄层板：海洋牌100×100mm或50×100mm预制硅胶薄层板，厚度0.20～0.25mm，青岛海洋化工厂分厂。
薄层色谱：手动点样用注射器，双槽展开缸(L220×W60×H60，L110×W60×H60)，WFH-201B暗箱试紫外透射反射仪(上海精科实业有限公司)，Canon SX120IS数码相机拍摄成像记录。
高效液相色谱：Agilent1100和Waters H-CLASS UPLC高效液相色谱仪，Agilent Zorbax SB-C18(4.6×250mm，5μm)色谱柱，或BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)色谱柱。
其他：SI-114丹佛电子天平，MS105梅特勒电子天平，SK3300HP型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷对照品(自制，批号130819、纯度98.74％)；HPLC用乙腈和甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
2、样品取样量的确定
三叉苦不同产地、不同季节、不同部位样品中2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷含量存在差异，根据供试品溶液的制备和对照品TLC点样量和HPLC进样量试验结果，拟订供试品含2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷0.01～10mg。
3、提取方法的选择
以甲醇作为提取溶剂，考察了回流提取和超声提取2种提取方法，分别处理5～60分钟，结果表明，2种提取方法均可行，色谱效果一致，提取时间较短时提取率稍低，能满足TLC鉴别的要求，但不能满足HPLC含量测定的要求，提取时间超过30分钟即可提取完全。
4、提取溶剂的选择
称取三叉苦(批号101104)茎粗粉(通过三号筛)、叶粗粉(通过四号筛)各8份，每份含2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷约1mg，精密称定，分别精密加入水、50％甲醇、甲醇、50％乙醇、乙醇、50％正丁醇、50％乙腈、50％丙酮各50ml，称定重量，加热回流提取60分钟，放冷，再称定重量，分别用相应的溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，或取滤液照上述方法(3)经D101大孔吸附树脂柱处理制得供试品溶液，照上述色谱条件，以甲醇-0.1％磷酸溶液(20:80)为流动相，检测波长285nm，依法进行TLC检测和HPLC检测。结果表明，几种提取溶剂的提取率和色谱效果基本一致。
5、提取溶剂加量的选择
不同样品中2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷含量不同，取样量也就不同，TLC鉴别和HPLC含量测定对提取率的要求也不同，经试验，溶剂加量在5～100ml之间，能够满足不同样品、不同检测目的的要求。
6、提取溶液的处理
(1)提取溶液加相应溶剂稀释制成每1ml含2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷0.001～1mg的溶液，滤过，取续滤液作为供试品溶液，色谱效果基本符合要求。
(2)提取溶液蒸干，按常规方法，残渣加水使溶解，用乙酸乙酯进行萃取，分取水层液，蒸干，残渣加甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、水或这些溶剂任意比例的混合溶液1～10ml使溶解，所得溶液作为供试品溶液，色谱效果符合要求，部分样品色谱效果更好。
(3)提取溶液蒸干，按常规方法，残渣加水2～30ml使溶解，用D101大孔吸附树脂柱(内径1～2.5cm，树脂床高2～15cm)进行纯化处理，用水10～100ml洗脱可以去除不吸附的杂质，弃去洗脱液，再用体积百分比为5～50％的甲醇或5～50％的乙醇25～200ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、水或这些溶剂任意比例的混合溶液1～10ml使溶解，所得溶液作为供试品溶液，色谱效果符合要求，部分样品色谱效果更好。
(4)三叉苦中含有一定量的不同的2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷的酯类衍生物，按常规方法进行酸水解，即可将这些衍生物转化为2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷，增加供试品溶液中2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷的量。经试验，提取溶液蒸干，残渣加水2～5ml使溶解，加入等体积的2～4mol/LHCl溶液，使2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷在1～2mol/LHCl溶液中90℃条件下水解15～150分钟，2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷的量即可达到最大值，所得溶液直接作为供试品溶液，或加入1倍体积以上的甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、水或这些溶剂任意比例的混合溶液稀释后作为供试品溶液，色谱效果符合要求，部分样品色谱效果更好。
7、对照品溶液和供试品溶液溶剂选择
根据2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷的溶解性，经试验，甲醇、乙醇、正丁醇、乙腈、丙酮、水或这些溶剂任意比例的混合溶液均可作为对照品溶液和供试品溶液的溶剂。
8、薄层色谱鉴别展开剂和显色剂的选择
取上述供试品溶液，分别以不同比例的氯仿-甲醇-甲酸-水、或甲醇-水、正丁醇-乙酸-甲酸-水的上清液、或其他相似极性的展开剂作为展开剂，以不同浓度的硫酸乙醇溶液、或三氯化铁乙醇溶液、或香草醛硫酸乙醇溶液、或三氯化铝乙醇溶液作为显色剂，依法试验，结果表明，这些展开剂、显色剂均可行，色谱效果有一定差异，但均能达到要求。
9、高效液相色谱含量测定方法研究：
(1)检测波长的选择2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷甲醇溶液(50μg/ml)在200至800nm范围内扫描，结果在230nm和285nm波长处有最大吸收，经试验，在230nm±2nm和285±2nm波长处检测，结果除了峰面积不一样之外，其他基本一致，它们均可作为检测波长。
(2)流动相的选择考察了乙睛-0.1％磷酸、乙睛-水、乙睛-1％冰醋酸溶液(PH2.5)、乙睛-0.5％三乙胺0.1％磷酸溶液、乙睛-(0.1％磷酸0.2％四氢呋喃)、乙腈-0.1％三氟乙酸、甲醇-0.1％磷酸、甲醇-水、甲醇-1％冰醋酸、乙腈-甲醇-0.1％磷酸溶液10个系统。结果表明，都符合中国药典一部附录VID规定的要求，色谱效果基本一致。
10、高效液相色谱含量测定线性关系试验
取2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷对照品，精密称定，置10ml量瓶中，加50％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，用50％甲醇稀释制成不同浓度的对照品溶液，分别精密吸取10μl，照拟定的色谱条件，以甲醇-0.1％磷酸溶液(20:80)为流动相，检测波长285nm，依法测定，结果见表1。
表1 2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷含量测定线性关系试验结果
| 浓度(μg·ml-1) | 4.9788 | 7.4682 | 24.8940 | 49.7880 | 124.4699 | 248.9398 |
| 峰面积 | 144.154 | 199.253 | 581.525 | 1043.000 | 2610.070 | 5216.330 |
以2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷的浓度(μg·ml-1)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，经回归处理，回归方程为Y＝20.8101X+30.0755，相关系数r＝0.9999。结果表明，2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷的浓度在5.0～248.9μg·ml-1范围内线性关系良好。
11、高效液相色谱含量测定精密度试验
取2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷对照品溶液(49.7880μg/ml)，照拟定的色谱条件，以甲醇-0.1％磷酸溶液(20:80)为流动相，检测波长285nm，连续依次进样5次，每次进样10μl，分别依法测定，记录峰面积，测定结果见表2。结果表明，色谱系统精密度良好，RSD为2.50％。
表2 2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷含量测定精密度试验结果
12、高效液相色谱含量测定供试品溶液稳定性试验
取三叉苦(批号101104)叶，粉碎成粗粉，称取0.25g，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，加热回流提取60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，加水稀释至10ml，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，照拟定的色谱条件，以甲醇-0.1％磷酸溶液(20:80)为流动相，检测波长285nm，分别于0、2、4、8、24小时，依法测定，计算2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷的含量，结果见表3。
表3 三叉苦叶中2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷含量测定供试品溶液稳定性试验结果
结果表明，供试品溶液稳定性较好，在24小时内测定结果基本一致。
13、高效液相色谱含量测定重复性试验
取三叉苦(101104批)叶，粉碎成粗粉，称取6份样品，每份0.25g，分别精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，加热回流提取60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，加水稀释至10ml，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，照拟定的色谱条件，以甲醇-0.1％磷酸溶液(20:80)为流动相，检测波长285nm，分别依法测定，计算2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷的含量，结果见表4。
表4 三叉苦叶中2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷含量测定重复性试验结果
结果表明，测定方法的重复性较好。
14、高效液相色谱含量测定准确度(加样回收率)试验
分别称取三叉苦(批号101104)叶粗粉6份，每份约0.125g，精密称定，分别精密加入2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷对照品甲醇溶液(0.24648mg·ml-1)5ml，加甲醇20ml，称定重量，加热回流提取60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，加水稀释至10ml，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，照拟定的色谱条件，以甲醇-0.1％磷酸溶液(20:80)为流动相，检测波长285nm，分别依法测定，计算，结果见表5。
表5 三叉苦叶中2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷含量测定准确度试验结果
结果表明，测定方法的准确度较好。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容再做进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围权限于以下的实例。
实施例1：取三叉苦(批号101104)茎粗粉5g，加50％甲醇50ml，超声处理30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加在D101大孔吸附树脂柱(内径1.8cm，树脂床高8cm)上，用水50ml洗脱，弃去洗脱液，再用体积百分比为15％的乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷对照品，加甲醇制成1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》一部附录VIB)试验，吸取上述供试品溶液、对照品溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-甲酸-水(7:3:0.5:0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
实施例2：基本同实施例1，不同之处是取三叉苦(批号101104)叶粗粉0.1g作为供试品。
实施例3：取三叉苦(批号101104)叶粗粉约0.25g，精密称定，置100mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，加热回流提取60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5mL，加水稀释至10mL，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
取2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含50μg的溶液，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照品溶液。
用Agilent Zorbax SB-C18(4.6×250mm，5μm)色谱柱，以甲醇-0.1％磷酸溶液(20:80)为流动相；检测波长285nm；柱温30℃；流速1.0ml·min-1。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法(《中国药典》一部附录ⅥD)测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。
实施例4：基本同实施例3，不同之处是取实施例3的供试品溶液2.5mL，蒸干，加水2.5mL使溶解，加4mol/LHCl溶液2.5mL，90℃条件下水解30分钟，加甲醇稀释至10mL，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
实施例5：基本同实施例3，不同之处是取取三叉苦(批号101104)茎粗粉1g作为供试品。
Claims (1)
1.2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷在三叉苦药材检测中的应用，其特征在于是以三叉苦药材中含有的专属性成分2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷作为指标成分，采用常规的薄层色谱法和常规的高效液相色谱法对三叉苦药材进行鉴别和含量测定，其鉴别和含量测定的步骤如下：
一、用常规方法制备得到2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷；
二、2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷对照品溶液的制备
称取2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷对照品，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成每1ml含0.001～1mg的溶液，滤过，取续滤液作为对照品溶液，所述的溶剂是甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、水或这些溶剂任意比例的混合溶液；
三、供试品溶液的制备
取三叉苦茎或叶，粉碎，混匀，取粉末供试品精密称定，供试品含2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷0.01～10mg；在上述供试品中加入5～100ml溶剂，所述的溶剂是甲醇、乙醇、正丁醇、乙腈、丙酮、水或这些溶剂任意比例的混合溶液，超声处理5～60分钟，或加热回流5～60分钟，放冷，滤过，滤液按照以下方法中的一种处理，制成供试品溶液：
(1)取滤液，加入上述所述的溶剂中的相应溶剂稀释制成每1ml含2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷0.001～1mg的溶液，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
(2)取滤液，蒸干，残渣加水2～30ml使溶解，用乙酸乙酯萃取2～5次，每次2～30ml，分取水层液，蒸干，残渣加溶剂1～10ml使溶解，滤过，取续滤液作为供试品溶液，所述的溶剂是甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、水或这些溶剂任意比例的混合溶液；
(3)取滤液，蒸干，残渣加水2～30ml使溶解，加在D101大孔吸附树脂柱上，树脂柱内径1～2.5cm，树脂床高2～15cm，用水10～100ml洗脱，弃去洗脱液，再用体积百分比为5～50％的甲醇或5～50％的乙醇20～200ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加溶剂1～10ml使溶解，滤过，取续滤液作为供试品溶液，所述的溶剂是甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、水或这些溶剂任意比例的混合溶液；
(4)取滤液，蒸干，残渣加水2～5ml使溶解，加入等体积的2～4mol/LHCl溶液，90℃水浴中保温15～150分钟，滤过，取续滤液作为供试品溶液，或加入1倍体积以上的相应溶剂稀释后滤过，取续滤液作为供试品溶液，所述的溶剂是甲醇、乙醇、乙腈或丙酮；
四、薄层色谱鉴别
照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液1～10μl和对照品溶液1～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，用氯仿-甲醇-甲酸-水5～9:1～5:0.2～1:0.2～1、或甲醇-水10:0.2～2、或正丁醇-乙酸-甲酸-水10:0～5:0～5:0.1～0.5的上清液作为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5～20％硫酸乙醇溶液、或1～10％三氯化铁乙醇溶液、或2～10％香草醛5～20％硫酸乙醇溶液、或0.5～2％三氯化铝乙醇溶液作为显色剂，室温或加热显色，365nm紫外光灯下或日光下检视；
五、高效液相色谱含量测定
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-酸水溶液或乙腈-水溶液5～15：95～85、甲醇-酸水溶液或甲醇-水溶液5～30：95～70为流动相，所述的酸水是体积百分比为0.05～5％的甲酸溶液、乙酸溶液、磷酸溶液、三氟乙酸溶液中的任意一种，检测波长为230±3nm或285±3nm；理论塔板数按2,4,6-三羟基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷峰计算不低于3000；
测定方法照高效液相色谱法测定，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1～20μl，分别注入液相色谱仪，测定，即得。
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