CN103995064A - 萝卜硫素提取物中萝卜硫素的hplc定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种萝卜硫素提取物中萝卜硫素的HPLC定量检测方法，包括以下步骤：1)利用乙腈-水溶液将萝卜硫素标准品稀释成系列浓度的标准品溶液；2)称取待测萝卜硫素提取物溶于乙腈-水溶液，作为样品溶液；3)将上述标准品溶液和样品溶液分别进行高效液相色谱分析，从而分别获得标准品溶液以及样品溶液中萝卜硫素的吸收峰面积；4)建立标准曲线萝卜硫素标准曲线；5)将样品溶液萝卜硫素所得的峰面积带入上述曲线方程中，从而获得样品溶液中萝卜硫素的含量，最终得知待测的萝卜硫素提取物中萝卜硫素的含量。

Description

萝卜硫素提取物中萝卜硫素的HPLC定量检测方法

技术领域

本发明涉及一种工厂化提取物萝卜硫素的定量检测方法。

背景技术

萝卜硫素，又称“莱菔硫素”，在西兰花十字花科植物中含量较丰富，是常见抗氧化剂，是所有天然抗癌物质里，效力最强、效果最好的活性成分，具有独特的抗癌功效。大量试验证明，萝卜硫素对食道癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌及大肠癌等有很好的防治效果。它可以造成癌细胞的细胞凋亡和细胞阻滞，同时可以诱导人体内的Ⅱ相解毒酶，同时抑制Ⅰ型酶的产生，最终通过多种酶体系排出致癌物和自由基等有害成分，同时，该成分不会在人体内残留，对机体无副作用，是一种新型的抗癌成分。此外，萝卜硫素在清除肺部细菌、防治痛风等方面同样具有多重功效。以上原因,从十字花科植物中提取或者用化学法合成萝卜硫素，研制和生产保健食品具有深远意义。故对于这种天然的、具有很强防治癌症效果的物质,应该加强研究，使之实现工业化，更好地为癌症患者以及白血病患者提供辅助治疗的保健食品。

现有的检测萝卜硫素的方法也主要为高效液相色谱法，HPLC是一种检测萝卜硫素含量的有效方法，具有测试结果在准确性和精密度较高的特点，但在流动相选择、检测准确度和精密度等方面仍需改进。王向阳等利用5mmol/L四丁基溴化铵-甲醇＝90-10作为流动相分析了西兰花中萝卜硫素的含量，其波长选择227nm。顾颖娟等采用XDB-C18作为分离色谱柱，利用乙腈-水梯度洗脱方式来分析西兰花中萝卜硫素含量，波长选择254nm。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种准确性高的萝卜硫素提取物中萝卜硫素的HPLC定量检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种萝卜硫素提取物中萝卜硫素的HPLC定量检测方法，包括以下步骤：

1)、将萝卜硫素标准品溶解于乙腈-水溶液中，作为储备液；利用乙腈-水溶液将所述储备液倍比稀释成系列浓度的标准品溶液；

2)、称取4～5mg待测的萝卜硫素提取物溶于10ml乙腈-水溶液，作为样品溶液；

所述步骤1)和2)中的乙腈-水溶液，均为乙腈与水按照体积比3:7混合而得；

3)、将步骤1)所得的系列浓度的标准品溶液(即，稀释成系列浓度的标准品溶液)和步骤2)所得的样品溶液分别进行高效液相色谱分析，检测条件如下：XDB-C18column(5μm,150mm×4.6mm)色谱柱，进样量20微升，流动相为乙腈-水＝20-80(v/v)，流速1.0mL/min，柱温30℃，紫外检测波长254nm，采用外标法定量；

备注说明：流动相的用量为400～600ml(例如为500ml)。

从而分别获得标准品溶液以及样品溶液中萝卜硫素的吸收峰面积；

4)、建立标准曲线萝卜硫素标准曲线：

根据步骤3)所得结果，制备萝卜硫素系列浓度的标准品溶液的HPLC检测谱图，以峰面积(Y)为纵坐标，以质量浓度(X)为横坐标进行线性回归；得曲线方程；

备注说明：质量浓度(X)是指系列浓度的标准品溶液中的萝卜硫素的浓度。

5)、样品含量测定

根据步骤3)所得结果，将样品溶液萝卜硫素所得的峰面积带入上述曲线方程中，从而获得样品溶液中萝卜硫素的含量，最终得知待测的萝卜硫素提取物中萝卜硫素的含量。

作为本发明的萝卜硫素提取物中萝卜硫素的HPLC定量检测方法的改进：

所述系列浓度的标准品溶液中萝卜硫素的浓度为1.50～50.0μg/mL。

具体为：50.0，25.0，12.5，6.25，3.10，1.50μg/mL。

作为本发明的萝卜硫素提取物中萝卜硫素的HPLC定量检测方法的进一步改进：

所述曲线方程为：Y＝3562X+4475.8(r＝0.9994)。

为了验证本发明的方法的正确性和实用性，发明人进行了如下的试验：

1)、精密度试验

分别取3种浓度的萝卜硫素标准溶液，分别在同一条件下(按照步骤3)所述的高效液相色谱分析检测条件)连续测定3次，记录萝卜硫素的峰面积，计算RSD值(即，相对标准差，又称变异系数，反映检测方法变异程度的指标)；

当RSD值符合小于3％要求时，能证明：本发明所用方法变异程度较小。

2)、稳定性试验

精密吸取同一标准品溶液(溶于混合液和棕色瓶，即，萝卜硫素标准品溶解于乙腈-水溶液，然后保存于棕色瓶)，分别于配制后0、2、4h依法测定(如步骤3)所述的高效液相色谱分析检测条件)，分别进样20μL，每个时间段进样3次，计算RSD值；

当RSD值符合小于3％要求时，能证明：本发明样品稳定性较好。

3)、重现性试验

对同一批号或来源的萝卜硫素样品3份进行测定，记录色谱峰高。计算RSD值，观察重现性；

当RSD值符合小于5％要求时，能证明：本发明所建立检测方法重现性较好。

4)、回收率试验

准确制备已知含量的样品适量，精密称定，分别加入标准品适量，进样5次，测定萝卜硫素的峰面积，计算平均回收率及RSD。

相对于现有技术而言，本发明涉及流动相的发明点主要为以下几点：

1、流动相成分减少，本发明流动相中并未使用盐类成分，从而使得柱压大大较低。

2、检测更灵敏，定量限可以达到1.5μg/mL。

3、色谱柱压力降低，对仪器系统损伤较小。

4、本发明采用等度洗脱方式，方法较简单，使得基线较好。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1～图4为萝卜硫素色谱图；

具体如下：

图1：标准液色谱图50μg/mL；

图2：标准液色谱图12.5μg/mL；

图3：标准液色谱图1.5μg/mL；

图4：粗提物色谱图(表2中的3种待测样品是同一批样品配制而成)；

图1～图4中，峰1均代表：萝卜硫素。

具体实施方式

实施例1、一种萝卜硫素粗提物中萝卜硫素的HPLC定量检测方法，依次进行以下步骤：

1)、准确称取萝卜硫素标准品溶解于乙腈-水溶液(体积比3:7)中，作为储备液，利用乙腈-水溶液(体积比3:7)将储备液分别稀释为萝卜硫素浓度为50.0，25.0，12.5，6.25，3.10，1.50μg/mL的系列标准品溶液；

2)、准确称取5mg作为待测样品的萝卜硫素粗提物溶于10mL乙腈-水溶液(体积比3:7)中制备成供试品溶液(即，样品溶液)；

共设置了3种待测样品，分别为如表1所述的A、B、C。

3)、将步骤1)所得的标准品溶液和步骤2)所得的样品溶液分别进行高效液相色谱分析，检测条件如下：XDB-C18column(5μm,150mm×4.6mm)色谱柱，流动相为乙腈-水＝20-80(v/v)，流速1.0mL/min，柱温30℃，紫外检测波长254nm，本实验采用外标法定量。

标准品溶液/样品溶液的进样量为20μl；流动相的用量为500ml。

本发明中选择线性范围内高、中、低浓度作为质控浓度。具体如图1～图3所示。

备注说明：

浓度为50.0，25.0，12.5，6.25，3.10，1.50μg/mL的标准品溶液对应的峰面积分别为183090、90659、52244、28379、14855、7922。以峰面积(Y)为纵坐标，以质量浓度(X)为横坐标进行线性回归。X的数据单位为μg/mL。结果显示萝卜硫素标准曲线方程为Y＝3562X+4475.8(r＝0.9994)，由此说明在1.5-50μg/mL范围内线性关系较好。

备注说明：常规的萝卜硫素提取物中萝卜硫素的含量一般为0.1-2％，因此，按照本发明所述的“4～5mg待测的萝卜硫素提取物溶于10ml乙腈-水溶液”，能满足所得样品中萝卜硫素的浓度落入“1.5-50μg/mL”这个范围值内。具体而言，可通过设置不同浓度样品溶液，以能够符合要求的样品浓度为准。

4)、样品含量测定：

将样品溶液测试所得的峰面积代入上述曲线方程中，从而获得样品溶液中萝卜硫素的含量，最终得知待测的萝卜硫素粗提物中萝卜硫素的含量。

具体如下：

A的峰面积为：21088，

B的峰面积为：20151，

C的峰面积为：20891；

所得的3种样品溶液中萝卜硫素的浓度如表1所示。

然后经过如下的换算公式：含量＝C*10/5000；最终所得的3种样品中萝卜硫素的含量如表1所述。

表1、粗提物中萝卜硫素含量测定结果(n＝3)

粗提物	萝卜硫素浓度(μg/mL)	含量/％
			A	4.66	0.93
B	4.40	0.88
			C	4.61	0.92

发明人还进行了如下的验证试验：

1、精密度试验

分别取3种浓度的萝卜硫素标准溶液3.10、6.25、12.5μg/mL，分别在同一条件下连续测定3次，记录萝卜硫素的峰面积，计算RSD值。

具体如上：

3.10μg/mL时，峰面积分别为15145、15149、14855，因此RSD值为：1.12％；

6.25μg/mL时，峰面积分别为28914、28518、28379，因此RSD值为：0.97％；

12.5μg/mL时，峰面积分别为52244、52698、53988，因此RSD值为：1.71％；

结果显示3种浓度萝卜硫素的RSD均＜3％(分别为1.12％，0.97％和1.71％)，表明仪器精密度良好。

2、稳定性试验

精密吸取同一标准品溶液(浓度为12.5μg/mL，保存于棕色瓶)，分别于配制后0、2、4h依法测定，分别进样20μL，每个时间段进样3次，结果萝卜硫素的峰面积RSD分别为1.71％、0.59％及1.13％，表明供试品溶液在4h内稳定。

3、重现性试验

对作为待测样品A的萝卜硫素样品重复进行2次检测，检测方法同实施例1。

结果如下表2：

表2

上述结果显示萝卜硫素的RSD为2.38％，表明样品的重现性良好。

4、将上述表1中所示的样品A～样品C按照目前公认的检测精度最高的高效液相色谱方法进行检测，结果如下3：

表3、粗提物中萝卜硫素含量测定结果(n＝5)

5、回收率试验

准确制备已知含量的样品适量，精密称定，分别加入标准品适量，进样5次，测定萝卜硫素的峰面积，计算平均回收率及RSD，结果见表4。

表4、萝卜硫素加样回收率试验结果(n＝5)

综上所述，本发明建立了一种萝卜硫素HPLC定量检测方法，方法灵敏度、回收率、重现性均较好。萃取物中萝卜硫素含量为0.9％以上(接近1％，为表1含量的平均值)。

对比例1、将实施例1步骤3)中的流动相由“乙腈-水＝20-80(v/v)”改成乙腈-水＝10-90(v/v)；其余等同于实施例1。

最终所得的测定结果如下表5所示。

表5粗提物中萝卜硫素含量测定结果

对比例2、

将实施例1步骤3)中的流动相由“乙腈-水＝20-80(v/v)”改成0.05mol/L四甲基溴化铵-甲醇＝90-10(v/v)；其余等同于实施例1。

最终所得的测定结果如下表6所示。

表6粗提物中萝卜硫素含量测定结果

对比例3、

将实施例1步骤3)中的流动相由“乙腈-水＝20-80(v/v)”改成水-甲醇＝90-10(v/v)；其余等同于实施例1。

最终所得的测定结果如下表7所示。

表7粗提物中萝卜硫素含量测定结果

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明中萝卜硫素的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (3)

1.萝卜硫素提取物中萝卜硫素的HPLC定量检测方法，其特征是包括以下步骤：

1)、将萝卜硫素标准品溶解于乙腈-水溶液中，作为储备液；利用乙腈-水溶液将所述储备液倍比稀释成系列浓度的标准品溶液；

2)、称取4～5mg待测的萝卜硫素提取物溶于10ml乙腈-水溶液，作为样品溶液；

所述步骤1)和2)中的乙腈-水溶液，均为乙腈与水按照体积比3:7混合而得；

3)、将步骤1)所得的系列浓度的标准品溶液和步骤2)所得的样品溶液分别进行高效液相色谱分析，检测条件如下：XDB-C18column(5μm,150mm×4.6mm)色谱柱，进样量20微升，流动相为乙腈-水＝20-80(v/v)，流速1.0mL/min，柱温30℃，紫外检测波长254nm，采用外标法定量；

从而分别获得标准品溶液以及样品溶液中萝卜硫素的吸收峰面积；

4)、建立标准曲线萝卜硫素标准曲线：

根据步骤3)所得结果，制备萝卜硫素系列浓度的标准品溶液的HPLC检测谱图，以峰面积(Y)为纵坐标，以质量浓度(X)为横坐标进行线性回归；得曲线方程；

5)、样品含量测定

根据步骤3)所得结果，将样品溶液萝卜硫素所得的峰面积带入上述曲线方程中，从而获得样品溶液中萝卜硫素的含量，最终得知待测的萝卜硫素提取物中萝卜硫素的含量。

2.根据权利要求1所述的萝卜硫素提取物中萝卜硫素的HPLC定量检测方法，其特征是：

所述系列浓度的标准品溶液中萝卜硫素的浓度为1.50～50.0μg/mL。

3.根据权利要求1或2所述的萝卜硫素提取物中萝卜硫素的HPLC定量检测方法，其特征是：

所述曲线方程为：Y＝3562X+4475.8(r＝0.9994)。