CN111983099A - 一种hplc法测定十字花科蔬菜中萝卜硫素和莱菔素的方法 - Google Patents
一种hplc法测定十字花科蔬菜中萝卜硫素和莱菔素的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种HPLC法测定十字花科蔬菜中萝卜硫素和莱菔素的方法。该方法将十字花科蔬菜中的萝卜硫素和莱菔素先经过pH 5.2磷酸缓冲液水解，用乙酸乙酯提取，提取液浓缩后定容，用配有紫外检测器的高效液相色谱仪分别在波长254nm和225nm处测定，根据色谱峰的保留时间定性，外标法定量。本方法所采用的仪器目前在各个实验室中应用广泛，易于推广，具有较强的适用性，对于提升蔬菜产品的营养品质和保健功能具有重要意义，同时为十字花科蔬菜的育种和相关基因克隆提供理论依据。
Description
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，具体的说是一种HPLC法测定十字花科蔬菜中萝卜硫素和莱菔素的方法。
背景技术
萝卜硫素和莱菔素均属于异硫氰酸脂类物质，是目前公认的防癌抗癌效果最好的天然产物之一，对肝癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、前列腺癌和胃癌有明显的阻断作用。此外，萝卜硫素和莱菔素还具有抗炎抑菌、提高机体抗氧化能力和免疫力等药理作用。因此，萝卜硫素和莱菔素被视为评价十字花科蔬菜品质和营养保健价值的重要指标。
然而，目前尚未建立十字花科蔬菜中萝卜硫素和莱菔素含量的分析检测方法。CN201410239297.7公开了一种萝卜硫素提取物中萝卜硫素的HPLC定量检测方法，该方法不需要对萝卜硫素提取物进行前处理且仅仅检测萝卜硫素一种化合物，其检测方法较为简单，不适合十字花科蔬菜中萝卜硫素和莱菔素含量的检测。因此，亟需制定出一套基于HPLC技术的检测十字花科蔬菜中萝卜硫素和莱菔素含量的检测方法，对于提升蔬菜产品的营养品质和保健功能具有重要意义，同时为十字花科蔬菜的育种和相关基因克隆提供理论依据。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种HPLC法测定十字花科蔬菜中萝卜硫素和莱菔素的方法。该方法将十字花科蔬菜中的萝卜硫素和莱菔素先经过磷酸缓冲液水解，用乙酸乙酯提取，提取液浓缩后定容，用配有紫外检测器的高效液相色谱仪分别在波长254nm和225nm处测定，根据色谱峰的保留时间定性，外标法定量。本方法所采用的仪器目前在各个实验室中应用广泛，易于推广，具有较强的适用性，对于提升蔬菜产品的营养品质和保健功能具有重要意义，同时为十字花科蔬菜的育种和相关基因克隆提供理论依据。
本发明的技术方案是：一种HPLC法测定十字花科蔬菜中萝卜硫素和莱菔素的方法，其特征是，
1)前处理
称取十字花科蔬菜匀浆样品于离心管中，加入pH 5.2磷酸缓冲液，混匀，置于20-30℃水解，然后加入乙酸乙酯萃取，离心，取上层有机相，置于旋蒸瓶中，再重复萃取1-2次，合并萃取液，利用旋转蒸发仪浓缩至近干，用甲醇水溶液(甲醇:水＝7:3(V/V))定容，过滤膜，得到试样溶液待HPLC分析测定；
2)HPLC分析的色谱条件
色谱柱：C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，或性能相当者；
流动相A：0.1％磷酸-水溶液；流动相B：乙腈；
检测波长：225nm(莱菔素)；254nm(萝卜硫素)；
柱温：30℃；
流速：1mL/min；
进样量：10μL；
梯度洗脱条件，见表1；
3)标准曲线建立
配制萝卜硫素和莱菔素的标准工作溶液，以保留时间定性，外标法定量，通过标准工作液的浓度与相应的峰面积绘制标准曲线；
4)检测
试样溶液HPLC测定，以保留时间定性，外标法定量，以试样溶液中萝卜硫素或莱菔素的峰面积代入标准曲线，从而得到相应的萝卜硫素或莱菔素的浓度。
所述的十字花科蔬菜包括萝卜、大白菜、西兰花、小白菜、卷心菜等。
优选的，前处理步骤为：称取十字花科蔬菜匀浆样品1.000g于50mL离心管中，加入pH 5.2磷酸缓冲液3mL，混匀，置于25℃水解1h，然后加入乙酸乙酯40mL，萃取30min，以4500r/min离心5min，取上层有机相，置于旋蒸瓶中，再重复萃取2次，合并萃取液，利用旋转蒸发仪浓缩至近干，用1mL甲醇水溶液(甲醇:水＝7:3(V/V))定容，过0.22μm滤膜，待HPLC分析测定。
本发明的有益效果是：
1、本发明首次同时对萝卜硫素和莱菔素进行检测，前处理简单，添加平均回收率在76.84％～114.42％之间，萝卜硫素的检出限为0.5μg/mL，莱菔素的检出限为0.4μg/mL。
2、本方法所采用的仪器目前在各个实验室中应用广泛，易于推广，具有较强的适用性，对于提升蔬菜产品的营养品质和保健功能具有重要意义，同时为十字花科蔬菜的育种和相关基因克隆提供理论依据。
附图说明
图1为莱菔素标准溶液色谱图；
图2为萝卜硫素标准溶液色谱图；
图3为莱菔素的标准曲线；
图4为萝卜硫素的标准曲线。
具体实施方式
一、检测方法
1试剂与设备
萝卜硫素标准品：CAS号4478-93-7，纯度≥95％；莱菔素标准品：CAS号592-95-0，纯度≥98％；乙腈、甲醇、乙酸乙酯：色谱纯；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸：分析纯。
高效液相色谱仪Waters e2695：配有紫外检测器或二极管阵列检测器；色谱柱：C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；高速冷冻离心机；旋转蒸发仪；涡旋混合器；匀浆机；分析天平；0.22μm有机系滤膜。
2试样制备
采用四分法分取样品，取约200g新鲜样品于匀浆机中匀浆均匀，标明编号，置于-20℃条件下保存，备用。
3提取
称取蔬菜匀浆样品1.000g于50mL离心管中，加入pH 5.2磷酸缓冲液3mL，混匀，置于25℃水解1h，然后加入乙酸乙酯40mL，萃取30min，以4500r/min离心5min，取上层有机相，置于旋蒸瓶中，再重复萃取2次，合并萃取液，利用旋转蒸发仪浓缩至近干，用1mL甲醇水溶液(甲醇:水＝7:3(V/V))定容，过0.22μm滤膜，待HPLC分析测定。
4测定
4.1色谱条件
色谱柱：C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；
流动相A：0.1％磷酸-水溶液；流动相B：乙腈；
检测波长：225nm(莱菔素)；254nm(萝卜硫素)；
柱温：30℃；
流速：1mL/min；
进样量：10μL；
梯度洗脱条件，见表1。
表1梯度洗脱程序
4.2色谱分析
称取5mg(精确至0.1mg)萝卜硫素和莱菔素标准品，用甲醇溶解，转移至5mL容量瓶中，定容至刻度，得到质量浓度为1000mg/L萝卜硫素和莱菔素单标储备液。将莱菔素标准储备液用甲醇逐级稀释成300mg/L、200mg/L、100mg/L、60mg/L、30mg/L、10mg/L、5mg/L的标准工作溶液；将萝卜硫素标准储备液用甲醇逐级稀释成100mg/L、50mg/L、25mg/L、10mg/L、5mg/L的标准工作溶液。
分别取标准溶液和试样溶液上机测定，以保留时间定性，外标法定量，通过标准工作液的浓度与相应的峰面积绘制标准曲线，以试样溶液中萝卜硫素或莱菔素的峰面积代入标准曲线，从而求得相应的萝卜硫素或莱菔素的浓度。
5结果计算
样品中的萝卜硫素与莱菔素含量按下式计算：
X＝C×V/m
式中：
X──样品中萝卜硫素或莱菔素的含量，单位为微克每克(μg/g)。
C──待测液中萝卜硫素或莱菔素的质量浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)。
V──定容体积，单位为毫升(mL)。
m──样品质量，单位为克(g)。
备注：测定结果用平行测定的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
6结果与讨论
6.1色谱条件的确定
6.1.1波长的确定
萝卜硫素与莱菔素属于异硫氰酸酯成分，已有研究显示，萝卜硫素在254nm处有特征吸收峰，莱菔素在225nm处有特征吸收峰，且样品中其他成分较少有强吸收峰，因此，选定254nm作为萝卜硫素的检测波长，225nm作为莱菔素的检测波长。
6.1.2色谱柱的确定
选用反相色谱柱C18作为分离色谱柱。实验中分别选用了C18(4.6mm×100mm，5μm)、C18(4.6mm×150mm，3.5μm)和C18(4.6mm×250mm，5μm)3种柱子，结果显示，C18(4.6mm×250mm，5μm)分离度明显优于另外两种柱子。因此，选择C18(4.6mm×250mm，5μm)作为色谱柱。
6.1.3流动相条件的确定
由于甲醇和水比例接近1:1时，混合溶液粘度大，色谱柱柱压高，为降低柱压，延长色谱柱使用寿命，故选择乙腈和水作为流动相，同时加入0.1％磷酸以改善峰形。实验探讨了不同梯度洗脱程序对分离度的影响，最终确定梯度洗脱程序如表1时，萝卜硫素和莱菔素的分离度最好，萝卜硫素和莱菔素标准溶液色谱图分别如图1、2所示。
二、方法学验证
1线性范围
根据上述浓度为300mg/L、200mg/L、100mg/L、60mg/L、30mg/L、10mg/L、5mg/L的莱菔素标准工作溶液和100mg/L、50mg/L、25mg/L、10mg/L、5mg/L的萝卜硫素标准工作溶液，绘制色谱峰面积对浓度的标准曲线，在5～300mg/L浓度范围内，萝卜硫素和莱菔素的标准曲线和相关系数如表2及图2所示，线性关系均良好。
表2萝卜硫素和莱菔素标准曲线与相关系数
2方法的回收率、精密度和灵敏度
方法的准确度和精密度通过添加回收实验进行考察。在西兰花、白菜中添加萝卜硫素标准溶液，其中西兰花中添加量为40μg/g、80μg/g、170μg/g，白菜中添加量为20μg/g、40μg/g、80μg/g。在萝卜、白菜中添加莱菔素标准溶液，其中萝卜中添加量为25μg/g、45μg/g、65μg/g，白菜中添加量为20μg/g、30μg/g、40μg/g。每个浓度均做5个平行。实验结果见表～4，添加平均回收率在76.84％～114.42％之间，相对标准偏差(RSD)在1.52％～17.17％。以信噪比S/N≥3计算检出限，萝卜硫素的检出限为0.5μg/mL，莱菔素的检出限为0.4μg/mL。
表3萝卜硫素添加回收率实验(n＝5)
表4莱菔素添加回收率实验(n＝5)
三、实际样品检测
1、萝卜样品检测
称取萝卜匀浆样品1.000g于50mL离心管中，加入pH 5.2磷酸缓冲液3mL，混匀，置于25℃水解1h，然后加入乙酸乙酯40mL，萃取30min，以4500r/min离心5min，取上层有机相，置于旋蒸瓶中，再重复萃取2次，合并萃取液，利用旋转蒸发仪浓缩至近干，用1mL甲醇水溶液(甲醇:水＝7:3(V/V))定容，过0.22μm滤膜。吸取10μL经0.22μm滤膜过滤的萝卜样品莱菔素提取液，注入高效液相色谱仪，比较样品和标准品的高效液相色谱图，根据保留时间定性，外标法定量，得到萝卜中莱菔素的平均含量为38.59μg/g。
2、西兰花样品检测
称取西兰花匀浆样品1.000g于50mL离心管中，加入pH 5.2磷酸缓冲液3mL，混匀，置于25℃水解1h，然后加入乙酸乙酯40mL，萃取30min，以4500r/min离心5min，取上层有机相，置于旋蒸瓶中，再重复萃取2次，合并萃取液，利用旋转蒸发仪浓缩至近干，用1mL甲醇水溶液(甲醇:水＝7:3(V/V))定容，过0.22μm滤膜。吸取10μL经0.22μm滤膜过滤的西兰花样品萝卜硫素提取液，注入高效液相色谱仪，比较样品和标准品的高效液相色谱图，根据保留时间定性，外标法定量，得到西兰花中萝卜硫素的平均含量为22.06μg/g。
Claims (5)
1.一种HPLC法测定十字花科蔬菜中萝卜硫素和莱菔素的方法，其特征是，
1)前处理
称取十字花科蔬菜匀浆样品于离心管中，加入pH 5.2磷酸缓冲液，混匀，置于20-30℃水解，然后加入乙酸乙酯萃取，离心，取上层有机相，置于旋蒸瓶中，再重复萃取1-2次，合并萃取液，利用旋转蒸发仪浓缩至近干，用甲醇水溶液定容，过滤膜，得到试样溶液待HPLC分析测定；
2)HPLC分析的色谱条件
色谱柱：C18色谱柱，规格：250mm×4.6mm，5μm；
流动相A：0.1％磷酸-水溶液；流动相B：乙腈；
莱菔素检测波长：225nm；萝卜硫素检测波长：254nm；
柱温：30℃；
流速：1mL/min；
进样量：10μL；
3)标准曲线建立
配制萝卜硫素和莱菔素的标准工作溶液，以保留时间定性，外标法定量，通过标准工作液的浓度与相应的峰面积绘制标准曲线；
4)检测
试样溶液HPLC测定，以保留时间定性，外标法定量，以试样溶液中萝卜硫素或莱菔素的峰面积代入标准曲线，从而得到相应的萝卜硫素或莱菔素的浓度。
2.如权利要求1所述的一种HPLC法测定十字花科蔬菜中萝卜硫素和莱菔素的方法，其特征是，所述梯度洗脱条件如下：
3.如权利要求1所述的一种HPLC法测定十字花科蔬菜中萝卜硫素和莱菔素的方法，其特征是，所述的十字花科蔬菜包括萝卜、大白菜、西兰花、小白菜、卷心菜。
4.如权利要求1所述的一种HPLC法测定十字花科蔬菜中萝卜硫素和莱菔素的方法，其特征是，所述步骤1)的甲醇水溶液为：按体积比，甲醇:水＝7:3。
5.如权利要求1-4中任一项所述的一种HPLC法测定十字花科蔬菜中萝卜硫素和莱菔素的方法，其特征是，所述步骤1)前处理为：称取十字花科蔬菜匀浆样品1.000g于50mL离心管中，加入pH 5.2磷酸缓冲液3mL，混匀，置于25℃水解1h，然后加入乙酸乙酯40mL，萃取30min，以4500r/min离心5min，取上层有机相，置于旋蒸瓶中，再重复萃取2次，合并萃取液，利用旋转蒸发仪浓缩至近干，用1mL甲醇水溶液定容，过0.22μm滤膜，待HPLC分析测定。
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002015722A2 (en) * | 2000-08-21 | 2002-02-28 | Fahey Jed W | Treatment of helicobacter with isothiocyanates |
| US20060127996A1 (en) * | 2004-12-14 | 2006-06-15 | Johns Hopkins University | Method of extraction of isothiocyanates into oil from glucosinolate-containing plants and method of producing products with oil containing isothiocyanates extracted from glucosinolate-containing plants |
| CN102659651A (zh) * | 2012-03-31 | 2012-09-12 | 北京化工大学 | 一种异硫氰酸酯类化合物的制备方法 |
| US20130143963A1 (en) * | 2010-07-23 | 2013-06-06 | Auriga International | Sulforaphane stabilization |
| CN103995064A (zh) * | 2014-05-29 | 2014-08-20 | 中国计量学院 | 萝卜硫素提取物中萝卜硫素的hplc定量检测方法 |
| CN108440356A (zh) * | 2018-06-20 | 2018-08-24 | 武汉轻工大学 | 一种从萝卜籽中提取莱菔素的方法 |
-
2020
- 2020-09-01 CN CN202010902900.0A patent/CN111983099A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002015722A2 (en) * | 2000-08-21 | 2002-02-28 | Fahey Jed W | Treatment of helicobacter with isothiocyanates |
| US20060127996A1 (en) * | 2004-12-14 | 2006-06-15 | Johns Hopkins University | Method of extraction of isothiocyanates into oil from glucosinolate-containing plants and method of producing products with oil containing isothiocyanates extracted from glucosinolate-containing plants |
| US20130143963A1 (en) * | 2010-07-23 | 2013-06-06 | Auriga International | Sulforaphane stabilization |
| CN102659651A (zh) * | 2012-03-31 | 2012-09-12 | 北京化工大学 | 一种异硫氰酸酯类化合物的制备方法 |
| CN103995064A (zh) * | 2014-05-29 | 2014-08-20 | 中国计量学院 | 萝卜硫素提取物中萝卜硫素的hplc定量检测方法 |
| CN108440356A (zh) * | 2018-06-20 | 2018-08-24 | 武汉轻工大学 | 一种从萝卜籽中提取莱菔素的方法 |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| PIMAN POCASAP等: "Sulforaphene and sulforaphane in commonly consumed cruciferous plants contributed to antiproliferation in HCT116 colon cancer cells", 《ASIAN PACIFIC JOURNAL OF TROPICAL BIOMEDICINE》 * |
| POCASAP P 等: "Cancer preventive effect of Thai rat-tailed radish (Raphanus sativus L. var. caudatus Alef)", 《JOURNAL OF FUNCTIONAL FOODS》 * |
| SANGTHONG S 等: "Simultaneous quantification of sulforaphene and sulforaphane by reverse phase HPLC and their content in Raphanus sativus L. var. caudatus Alef extracts", 《FOOD CHEMISTRY》 * |
| 吴元锋 等: "芸苔属植物种子中萝卜硫素的提取工艺研究", 《食品与生物技术学报》 * |
| 王楠: "异硫代氰酸酯抗癌活性及MTBITC诱导A549细凋亡机理的研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士)医药卫生科技辑》 * |
| 田倚凡 等: "萝卜硫素-玉米醇溶蛋白纳米水分散体制备及性质", 《食品与发酵工业》 * |
| 蔡达 等: "十字花科蔬菜中莱菔素与莱菔硫烷含量测定方法研究", 《山东农业科学》 * |
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