CN103960299B - 一种制备细菌生物膜抑制剂的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用天然成分复配制备细菌生物膜天然抑制剂的方法，其特征步骤为：将干牛蒡叶充分粉碎。加入水，进行复合酶酶解，得到牛蒡叶水提液，浓缩得到浓缩物a。然后向酶解过的牛蒡叶渣中，加入乙醇溶液，超声微波协同萃取，过滤，浓缩得提取物b。将浓缩物a和b合并，分散在水中，上柱进行柱层析，进行梯度洗脱，得到乙醇洗脱物，将乙醇洗脱物与茶多酚复配，即为细菌生物膜天然抑制剂。本发明利用超声微波协同萃取技术与生物酶技术进行提取，大大缩短了提取时间，提高了提取率，再采用柱层析技术进行纯化，得到了抑制生物膜活性较强的牛蒡叶组分，再与茶多酚进行复配，得到了抑制生物膜活性强的天然抑制剂。
Description
技术领域
本发明属于天然产物领域，本发明涉及以天然组分复配制备细菌生物膜天然抑制剂的方法，包括利用超声微波协同萃取技术、酶技术与柱层析技术制备生物膜天然抑制剂的方法。
背景技术
据统计，我国牛蒡产量大，如牛蒡根在徐州地区的亩产达1500Kg，叶子约为每亩1000Kg。牛蒡叶基本全部废弃，造成了严重的资源浪费，而且容易污染环境。而牛蒡叶中含有的有效成分具有抗菌能力。因此对牛蒡叶中的多酚成分进行开发利用，既可以综合利用废弃资源，又可以制备大量的活性成分，具有重要的经济、社会意义。
在食品等行业，细菌生物膜是一个顽固的污染源，造成食品变质，而且是公共健康问题的起因。而且，生物膜细菌对抗生素和杀菌消毒剂的耐药性比浮游的非生物膜细菌强10-1000倍，传统的清洗和消毒疗法对生物膜的控制效率很低。因此，寻找与制备细菌生物膜抑制剂对提高食品安全水平、保障公民健康具有重要意义。
目前，关于生物膜抑制剂的研究才刚起步。有研究表明，多酚成分具有较强的生物膜抑制活性，牛蒡叶富含多酚成分，是一种能够抑制生物膜的良好资源。然而关于牛蒡叶中生物膜抑制剂的研究较少，采用超声微波辅助提取及柱层析技术从牛蒡叶中分离制备生物膜抑制剂的研究未见报道。本发明首先采用新技术制备生物膜抑制剂，然后与能够抑制细菌生物膜的茶多酚复配，前期研究表明两者具有协同增效作用，两者混合复配后得到一种活性更强的细菌生物膜抑制剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备细菌生物膜抑制剂的方法，以牛蒡加工的副产物牛蒡叶为原料，分离制备得到乙醇组分，再与茶多酚复配，得到细菌生物膜天然抑制剂。这种方法能够充分利用牛蒡叶资源，并且能够提供高效的细菌生物膜天然抑制剂，为牛蒡的综合利用与深加工提供了新的方法。
本发明的技术方案：提供一种制备细菌生物膜抑制剂的方法，包括如下步骤：
(1)将干牛蒡叶粉碎，过筛，干牛蒡叶粉碎至50-200目以下，将牛蒡叶粉末与溶剂混合，以水为溶剂，牛蒡叶粉末与溶剂的质量比为1∶5-1∶100。加入复合酶进行酶解，复合酶由纤维素酶和蛋白酶组成，纤维素酶与蛋白酶的质量比为1∶0.5-1∶5，复合酶的添加量为0.1-100mg/g(牛蒡叶)，酶解完成后过滤，得到牛蒡叶水提液，30-90℃减压浓缩至无溶剂，得到浓缩物a。所得牛蒡叶残渣待用。
(2)在牛蒡叶残渣中加入5％-90％的乙醇溶液作为溶剂，乙醇溶液与实验开始时所用的牛蒡叶粉末的质量比为1∶1-100∶1，进行超声微波协同萃取，超声波功率为0.05-100Kw，微波功率为0.1-2500Kw，提取时间为0.2-1500min，过滤。将上清液30-90℃减压浓缩至无溶剂，得到浓缩物b。
(3)将浓缩物a和b合并，分散于水中，合并后的浓缩物与水的质量比为1∶1-1∶50，得到悬液，上柱进行层析，层析柱的填料为大孔树脂、聚酰胺树脂或者离子交换树脂，悬液与树脂的质量比为1∶2-1∶100，依次分别用不同浓度的乙醇溶液进行梯度洗脱，每个梯度洗脱的体积为1-10个柱体积(BV)，乙醇溶液中乙醇的质量浓度为0-70％。分别收集洗脱液，得到不同浓度乙醇溶液的系列洗脱溶液。
(4)将某些浓度的乙醇溶液的洗脱溶液合并，30-90℃减压浓缩，20-100℃真空干燥或80-130℃喷雾干燥或0.5-200Kw微波辅助干燥。得到乙醇溶液洗脱组分。
(5)将得到的乙醇洗脱组分与纯度为70％-99％的茶多酚混合，茶多酚与牛蒡叶乙醇洗脱物的质量比为1∶2-1∶10，复配得到的即为细菌生物膜天然抑制剂。
本发明的有益效果是：本发明利用超声微波协同萃取技术与生物酶技术进行提取，大大缩短了提取时间，提高了提取率，再采用柱层析技术、梯度洗脱进行纯化，得到了对细菌生物膜具有一定抑制活性的牛蒡叶柱层析组分。然后将牛蒡叶活性组分与具有生物膜抑制活性的茶多酚进行混合复配，两者协同增效，得到活性很强的细菌生物膜抑制剂。本发明的细菌生物膜抑制剂对食源性致病菌生物膜的抑制能力强，测得所制备的生物膜抑制剂完全抑制金黄色葡萄球菌生物膜的最小浓度为0.1-0.25mg/ml。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的详细描述，但本发明不局限于这些实例。
实施例1
取干牛蒡叶10g，将干牛蒡叶粉碎至200目以下，然后将牛蒡叶粉末与水混合，牛蒡叶粉末与水的质量比为1∶20。加入复合酶进行酶解，纤维素酶与蛋白酶的质量比为1∶1，复合酶的添加量为3mg/g(牛蒡叶)，酶解完成后过滤，得到牛蒡叶水提液，50℃减压浓缩至无溶剂，得到浓缩物a。所得牛蒡叶残渣待用。在牛蒡叶残渣中加入15％的乙醇溶液作为溶剂，乙醇溶液与实验开始时所用的牛蒡叶粉末的质量比为2∶1，进行超声微波协同萃取，超声波功率为500w，微波功率为400w，提取时间为1.5min，过滤。将上清液50℃减压浓缩至无溶剂，得到浓缩物b。将浓缩物a和b合并，分散于水中，合并后的浓缩物与水的比例为1∶6，得到悬液，上大孔树脂柱进行层析，悬液与大孔树脂的质量比为1∶5，依次分别采用水、5％乙醇溶液、40％乙醇溶液进行梯度洗脱，水洗脱的体积为2BV，5％乙醇溶液的洗脱体积为1BV，40％乙醇溶液的洗脱体积为3BV，分别收集洗脱液。将40％乙醇溶液的洗脱液50℃减压浓缩，60℃真空干燥，得到乙醇溶液洗脱组分。将得到的乙醇洗脱组分与纯度为80％的茶多酚按照质量比5∶2混合，即为细菌生物膜天然抑制剂。
实施例2
将干牛蒡叶粉碎至100目以下，将200g牛蒡叶粉末与水混合，牛蒡叶粉末与水的质量比为1∶6。加入复合酶进行酶解，纤维素酶与蛋白酶的质量比为1∶2，复合酶的添加量为1mg/g(牛蒡叶)，酶解完成后过滤，得到牛蒡叶水提液，65℃减压浓缩至无溶剂，得到浓缩物a。在牛蒡叶残渣中加入30％的乙醇溶液作为溶剂，乙醇溶液与实验开始时所用的牛蒡叶粉末的质量比为5∶1，进行超声微波协同萃取，超声波功率为500w，微波功率为600w，提取时间为7min，过滤。将上清液55℃减压浓缩至无溶剂，得到浓缩物b。将浓缩物a和b合并，分散于水中，合并后的浓缩物与水的比例为1∶5，得到悬液，上聚酰胺树脂柱进行层析，悬液与聚酰胺树脂的质量比为1∶10，依次分别采用水、10％乙醇溶液、30％乙醇溶液，60％乙醇溶液进行梯度洗脱，水洗脱的体积为2BV，10％乙醇溶液的洗脱体积为2BV，30％乙醇溶液的洗脱体积为3BV，60％乙醇溶液的洗脱体积为2BV。分别收集洗脱液，将30％乙醇溶液的洗脱液与60％乙醇溶液的洗脱液合并，65℃减压浓缩，95℃喷雾干燥，得到乙醇溶液洗脱组分，将此洗脱组分与纯度为90％的茶多酚混合，乙醇溶液洗脱组分与茶多酚的质量比为5∶1，得到的复配物即为细菌生物膜抑制剂。
实施例3
取牛蒡叶1000g，粉碎至50目以下，将牛蒡叶粉末与30升水混合，加入50g复合酶进行酶解，纤维素酶与蛋白酶的质量比为2∶1，酶解完成后过滤，得到牛蒡叶水提液，65℃减压浓缩至无溶剂，得到浓缩物a。在牛蒡叶残渣中加入5000ml40％的乙醇溶液作为溶剂，进行超声微波协同萃取，超声波功率为500w，微波功率为900w，提取时间为20min，过滤。将上清液60℃减压浓缩至无溶剂，得到浓缩物b。将浓缩物a和b合并，分散于水中，合并后的浓缩物与水的比例为1∶9，得到悬液，上大孔树脂柱进行层析，悬液与大孔树脂的质量比为1∶10，依次分别采用水、6％乙醇溶液、35％乙醇溶液进行梯度洗脱，水洗脱的体积为3BV，6％乙醇溶液的洗脱体积2BV，35％乙醇溶液的洗脱体积为4BV。分别收集洗脱液。将35％乙醇溶液的洗脱溶液60℃减压浓缩，70℃真空干燥，得到乙醇溶液洗脱组分，将这些乙醇溶液洗脱组分与纯度为95％的茶多酚混合，乙醇洗脱组分与茶多酚的质量比为10∶1，即为细菌生物膜抑制剂。
实施例4
细菌生物膜抑制活性的测定方法：
主要采用结晶紫染色法进行分析。分别加对数生长期的菌液(100ul)及细菌生物膜天然抑制剂溶液(100ul/50ul)于24孔PVC板，加入一定毫升培养基，使之与菌液、抑制剂之和为1ml，同时留一排只加培养基作为空白对照组，再留一排加菌液和培养基、不加入药物作为正对照组，培养24h。吸掉培养物，用无菌生理盐水冲洗，然后甩干或者拍干，在室温下风干。然后加入0.5ml1％的结晶紫染色15min，弃去多余染液后，用去离子水冲洗2遍，加入95％的乙醇，放置5min，然后将溶液移至另一块96孔板，酶标仪570nm进行检测。
抑制率计算方法：细菌生物膜天然抑制剂对细菌生物膜的抑制率＝(加抑制剂之组的平均吸光度-空白对照组的平均吸光度)/(正对照组的平均吸光度-空白对照组的平均吸光度)
抑制率达到100％的最小抑制剂浓度即为抑制细菌生物膜的最小浓度。
测定得出，本发明的细菌生物膜抑制剂对金黄色葡萄球菌生物膜的最小抑制浓度为0.1-0.25mg/ml。
Claims (1)
1.一种制备细菌生物膜抑制剂的方法，其特征步骤为：
取干牛蒡叶10g，将干牛蒡叶粉碎至200目以下，然后将牛蒡叶粉末与水混合，牛蒡叶粉末与水的质量比为1∶20；加入复合酶进行酶解，复合酶的组成为纤维素酶和蛋白酶，纤维素酶与蛋白酶的质量比为1∶1，复合酶与牛蒡叶质量比为3∶1000，酶解完成后过滤，得到牛蒡叶水提液，50℃减压浓缩至无溶剂，得到浓缩物a；所得牛蒡叶残渣待用；在牛蒡叶残渣中加入15％的乙醇溶液作为溶剂，乙醇溶液与实验开始时所用的牛蒡叶粉末的质量比为2∶1，进行超声微波协同萃取，超声波功率为500w，微波功率为400w，提取时间为1.5min，过滤；将上清液50℃减压浓缩至无溶剂，得到浓缩物b；将浓缩物a和b合并，分散于水中，合并后的浓缩物与水的比例为1∶6，得到悬液，上大孔树脂柱进行层析，悬液与大孔树脂的质量比为1∶5，依次分别采用水、5％乙醇溶液、40％乙醇溶液进行梯度洗脱，水洗脱的体积为2BV，5％乙醇溶液的洗脱体积为1BV，40％乙醇溶液的洗脱体积为3BV，分别收集洗脱液；将40％乙醇溶液的洗脱液50℃减压浓缩，60℃真空干燥，得到乙醇溶液洗脱组分；将得到的乙醇洗脱组分与纯度为80％的茶多酚按照质量比5∶2混合，即为细菌生物膜天然抑制剂。
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