CN103881912B - 一种中国被毛孢的长期保藏方法 - Google Patents

一种中国被毛孢的长期保藏方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103881912B
CN103881912B CN201310706395.2A CN201310706395A CN103881912B CN 103881912 B CN103881912 B CN 103881912B CN 201310706395 A CN201310706395 A CN 201310706395A CN 103881912 B CN103881912 B CN 103881912B
Authority
CN
China
Prior art keywords
long term
term storage
storage method
preservation
plane
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201310706395.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103881912A (zh
Inventor
沙涛
普春龙
张亚平
田国樑
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yunnan University YNU
Original Assignee
Yunnan University YNU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yunnan University YNU filed Critical Yunnan University YNU
Priority to CN201310706395.2A priority Critical patent/CN103881912B/zh
Publication of CN103881912A publication Critical patent/CN103881912A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103881912B publication Critical patent/CN103881912B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Mushroom Cultivation (AREA)

Abstract

本发明公开了一种中国被毛孢的长期保藏方法，该方法是从冬虫夏草分离得到菌丝体，然后将其在PDA斜面培养，再将斜面培养好的菌丝体转接至PDA平板，18℃培养30天后，用解剖刀将其切成带菌丝体的琼脂块，将琼脂块移至无菌的10-20％甘油的冷冻管中，用封口膜将冷冻管盖封好，置于-70℃冰箱内保藏。本发明降低了菌种因转接次数多而造成菌种的变异和污染率的问题。

Description

一种中国被毛孢的长期保藏方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及的是一种中国被毛孢的长期保藏方法。
背景技术
冬虫夏草(Ophiocordycepssinensis)是名贵中药和珍稀滋补品，是由其无性型中国被毛孢(Hirsutellasinensis)侵染蝠蛾属(Hepialusspp.)幼虫形成的菌虫复合体，分布在我国青海、西藏、四川、云南和甘肃等地的海拨3500～5000m高寒灌丛草甸。
由于冬虫夏草菌具有完全形(也称为有性世代)和不完全形(也称无性世代)两个完全不相同的形态，10年前菌种鉴定方面手段落后，分子鉴定还未开展，有很长一段时期大都仅凭分离菌丝形态误将蝙蝠蛾拟青霉当作冬虫夏草菌种来培养，走了不少弯路。在冬虫夏草无性型的确定问题上，学术界一直争论不休。目前，与冬虫夏草有关的无性型菌种已报道有22个学名，涉及13个属之多，而且从NCBI数据库检索得到的多个已注册为“冬虫夏草”的序列彼此之间的差异十分显著。
菌种保藏是运用物理、生物手段让菌种处于完全休眠状态，使在长时间储存后仍能保持菌种原有生物特性和生命力的菌种储存措施。冬虫夏草菌种的分离比较困难，而传统的斜面4保藏，只能短期(6个月)保藏，其转种频繁，这就造成了工作量较大，菌种易变异等问题。由于频繁转种，污染的几率也就大。因此菌种的长期保藏也是冬虫夏草研究及开发亟待解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术在保藏冬虫夏草菌中存在的问题，提供了一种中国被毛孢的长期保藏方法。
本发明的技术方案如下：
一种中国被毛孢的长期保藏方法，是从冬虫夏草分离得到菌丝体，然后将其在PDA斜面18℃培养30天，将斜面培养好的菌丝体转接至PDA平板，18℃培养30天后，用解剖刀将其切成带菌丝体的琼脂块，将琼脂块移至无菌的甘油冷冻管中，用封口膜将冷冻管盖封好，置于冰箱内保藏。
所述的长期保藏方法，其带菌丝体的琼脂块的大小为5*5mm。
所述的长期保藏方法，其甘油的体积浓度为10-20％。
所述的长期保藏方法，其冰箱内保藏温度为-70℃。
所述的长期保藏方法，其保藏时间为4年以上。
本发明降低了菌种因转接次数多而造成菌种的变异和污染率的问题。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
1、材料与方法
1.1供试菌种
从云南省中甸白马雪山虫草分离得到菌丝体，经ITS序列鉴定为中国被毛孢。
1.2菌丝体的分离方法：新鲜的冬虫夏草，取子座部分，用消毒酒精进行表面消毒，用镊子取1*2mm大小的组织块放在PDA平板上18℃培养，每天在解剖镜下观察生长情况。将组织块萌发菌丝、生长较慢、致密的菌丝体移至PDA斜面18℃继续培养，期间观察有无污染。取无污染的斜面菌丝体，提取DNA，ITS引物PCR扩增、测序，通过序列比对鉴定是否是中国被毛孢。
1.3PDA试管斜面菌种的培养方法：马铃薯洗净去皮，称取300g，将马铃薯切成小块，加水煮沸20～30分钟，能被玻璃棒戳破即可，用四层纱布过滤，补足水分至1000毫升。再加葡萄糖20克，琼脂15～20克，ph自然。再加热使琼脂融化，分装试管，加塞、包扎，(121℃)灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。
取中国被毛孢菌丝体置于上述试管斜面，18℃培养30天左右。
1.4斜面低温保藏法
将培养好的PDA试管斜面菌种，放置于4℃冰箱内保存。
1.5石蜡油保藏法
将培养好的PDA试管斜面菌种，加5ml无菌石蜡油，将试管置于4℃冰箱内保存。
1.6琼脂块甘油保藏法
将斜面培养好的菌种转接至PDA平板，18℃培养30天后，用解剖刀切成5*5mm大小的带菌丝体的琼脂块，将琼脂块移至无菌的体积浓度为10-20％甘油的冷冻管中，用封口膜将冷冻管盖封好，置于-70℃冰箱内保存。
2、实验结果
表1是三种菌种保藏方法对保藏中国被毛孢菌种的比较。从表1可以看出，由于在低温条件下，斜面半年以上就已经失去大部分水分而干掉。斜面低温保藏法保藏的中国被毛孢，比较适合短期3～6个月保藏。石蜡油保藏法保藏的中国被毛孢，可以保藏2年以上，但菌种活化时间较长，菌丝体长势较差。琼脂块甘油保藏法保藏的中国被毛孢最好，菌种活化时间较短，菌丝体长势好，目前已保藏了四年多。因此，琼脂块甘油保藏法适合长时间保藏中国被毛孢菌种。
表1三种菌种保藏方法对保藏中国被毛孢菌种的比较
注：+++表示菌丝体生长最好；++表示菌丝体生长一般；+表示菌丝体生长较差；0表示菌丝体不生长。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (4)

1.一种中国被毛孢的长期保藏方法，其特征在于，从冬虫夏草分离得到菌丝体，然后将其在PDA斜面18℃培养30天，将斜面培养好的菌丝体转接至PDA平板，18℃培养30天后，用解剖刀将其切成带菌丝体的琼脂块，将琼脂块移至无菌的甘油冷冻管中，用封口膜将冷冻管盖封好，置于冰箱内保藏；
所述冰箱内保藏温度为-70℃。
2.根据权利要求1所述的长期保藏方法，其特征是，带菌丝体的琼脂块的大小为5*5mm。
3.根据权利要求1所述的长期保藏方法，其特征是，甘油的体积浓度为10-20％。
4.根据权利要求1所述的长期保藏方法，其特征是，保藏时间为4年以上。
CN201310706395.2A 2013-12-20 2013-12-20 一种中国被毛孢的长期保藏方法 Active CN103881912B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310706395.2A CN103881912B (zh) 2013-12-20 2013-12-20 一种中国被毛孢的长期保藏方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310706395.2A CN103881912B (zh) 2013-12-20 2013-12-20 一种中国被毛孢的长期保藏方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103881912A CN103881912A (zh) 2014-06-25
CN103881912B true CN103881912B (zh) 2016-05-04

Family

ID=50951039

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310706395.2A Active CN103881912B (zh) 2013-12-20 2013-12-20 一种中国被毛孢的长期保藏方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103881912B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104450521B (zh) * 2014-12-22 2017-07-07 东莞市生物技术研究所 一种长期保存蛹虫草菌种的方法
CN113061534A (zh) * 2021-02-22 2021-07-02 广东省食用菌行业协会 一种中国被毛孢的菌株保藏方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1478886A (zh) * 2003-06-14 2004-03-03 安徽林苑虫草研究所 一种中国被毛孢液体菌种发酵工艺方法
CN102220249A (zh) * 2011-06-13 2011-10-19 杭州柯氏生物科技有限公司 一种中国被毛孢的生产方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1478886A (zh) * 2003-06-14 2004-03-03 安徽林苑虫草研究所 一种中国被毛孢液体菌种发酵工艺方法
CN102220249A (zh) * 2011-06-13 2011-10-19 杭州柯氏生物科技有限公司 一种中国被毛孢的生产方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
液氮超低温保藏法是菌种长期保藏的最有效最可靠的方法;天驰液氮罐;《http://www.tianchiyedanguan.com/Problem/483.html》;20131216;1 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN103881912A (zh) 2014-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103952362B (zh) 一株对多种植物病原菌具抑菌活性的柑橘内生放线菌
CN104726383A (zh) 解淀粉芽孢杆菌jk6及生物肥和应用
CN112438277B (zh) 一种炭角菌科真菌sj18及其在松材线虫防治上的应用
CN104195055A (zh) 一种尖孢镰刀菌及其在铁皮石斛抗叶斑病中的应用
CN107988087A (zh) 一株有促生作用的蓝莓内生真菌及其应用
de Basanta et al. Techniques for recording and isolating Myxomycetes
CN106010987B (zh) 一种对突背蔗犀金龟具有致病力的白僵菌菌株及其应用
CN103881912B (zh) 一种中国被毛孢的长期保藏方法
CN104232748B (zh) 一种杨梅苗木是否携带凋萎病菌的快速分子检测方法
CN104472221B (zh) 一种由天然冬虫夏草子实体发酵菌丝的方法
CN102703550B (zh) 一种从蜡样芽孢杆菌高密度发酵液中提取蛋白质的方法
CN105462882B (zh) 一种用于防治作物黄萎病的铜绿假单胞菌及其应用
CN115960777B (zh) 一株假真菌样芽孢杆菌及其在蔬菜疫病防治中的应用
de Basanta et al. Techniques for recording and isolating myxomycetes: updated
CN105441332A (zh) 一种从柞蚕中分离的白僵菌及其应用
CN104962501A (zh) 一种抗蔬菜水果灰霉病的菌株、拮抗剂的制备及应用
CN115287225A (zh) 一株寡养单胞菌菌株kc098，其发酵液及应用
CN105695335A (zh) 一种新的黄曲霉及其用途
CN108203695A (zh) 一株杜鹃花类菌根真菌功能菌株及其应用
CN104920066B (zh) 提高冬虫夏草寄主感染率的方法
Ma et al. Tolerance of ectomycorrhizal fungus mycelium to low temperature and freezing–thawing
CN102870597A (zh) 一株暗褐网柄牛肝菌菌株
CN105624049A (zh) 一种草坪币斑病菌的分离方法
CN107325973A (zh) 一株对榛椿象具有强致病力的白僵菌菌株及其应用
CN105238697A (zh) 一株牡丹内生真菌及该菌生产丹皮酚的工艺

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant