CN103869019A - 一种凤冈锌硒茶的hplc指纹图谱的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种凤冈锌硒茶的HPLC指纹图谱的建立方法，包括供试品溶液的制备、指纹图谱的制作、标准指纹谱图的确认，利用SPSS及SIMCA-P+统计分析软件选择了29批中的20批凤冈锌硒茶样品、4批六盘水茶叶样品、5批都匀茶叶样品、9批铜仁茶叶样品及14批湄潭茶叶样品进行凤冈锌硒茶指纹图谱模型验证，结果显示所建凤冈锌硒茶指纹图谱能有效应用与凤冈锌硒茶的真伪鉴别及产地确认，所建指纹图谱模型能更好的应用于凤冈锌硒茶的地理产品保护及其更全面的质量控制。

Description

一种凤冈锌硒茶的HPLC指纹图谱的建立方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种凤冈锌硒茶的HPLC指纹图谱的建立方法。

背景技术

凤冈地处黔北高原的富锌富硒地带，境内丘陵广布，土壤主要以微酸性黄壤为主，且富含锌、硒等微量元素，土壤PH值4.5～6.5，土层深厚，土壤疏松肥沃，有机质和氮、磷、钾含量丰富。凤冈锌硒茶产于贵州省遵义市凤冈县，是贵州省凤冈县的名优绿茶，也是全国唯一的集锌、硒、有机三位一体的天然营养保健茶，具有色泽绿润、汤色绿亮、滋味醇厚、叶底嫩绿鲜活等特点，2006年1月国家质检总局批准对凤冈锌硒茶实施地理标志产品保护。

中药指纹图谱是指某种(或某产地)中药材或中成药进行适当处理后,采用一定的分析手段得到的、能够标示该中药材或中成药特性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱,它具有特征性和稳定性。通过指纹图谱的特征性,能有效鉴别样品的真伪或产地；通过其主要特征峰的面积或比例的限定,能有效控制样品的质量,确保药品质量的相对稳定。对非单一成分药物的质量控制而言,指纹图谱能全面、综合地反应和控制中药或天然药物质量。

本发明运用中药指纹图谱的研究平台，建立了贵州凤冈锌硒茶的HPLC指纹图谱，可以实现对贵州凤冈锌硒茶的真伪鉴别及产品地理保护，并且同时实现对凤冈锌硒茶质量的更好控制。

发明内容

本发明要解决的技术问题：针对凤冈锌硒茶没有一种好的质量控制方法，本发明提供了一种凤冈锌硒茶的HPLC指纹图谱的建立方法及其标准谱图，实现了贵州凤冈锌硒茶的真伪鉴别及产品地理保护，并且同时实现对凤冈锌硒茶质量的更好控制。

本发明采用的技术方案：凤冈锌硒茶的HPLC指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：

（1）供试品溶液的制备：取样品粉碎，过40目筛，准确称取样品粉末0.25g，置25mL具塞比色管中，加入70%甲醇20mL超声萃取30min，过滤，滤液过0.45μm微孔滤膜；

（2）指纹图谱的制作：HPLC的色谱条件：C18色谱柱，4.6×250mm，5μm；柱温：30℃；流动相A为乙腈，流动相B为0.3%冰乙酸，梯度洗脱：0min5％乙腈，4min14%乙腈，21min14%乙腈，26min15%乙腈，34min15%乙腈，40min17%乙腈，45min25%乙腈，55min25%乙腈；流速：0.3～0.8mL·min^-1；进样量10μL；检测波长365nm，记录谱图得到凤冈锌硒茶的HPLC指纹图谱；

（3）标准指纹谱图的确认：按照上述提供的方法，对多批次凤冈锌硒茶建立了HPLC指纹图谱，通过分析比较确定了15个共有特征峰，其保留时间分别为：16.5min、19.6min、20.3min、21.0min、22.0min、23.4min、24.4min、27.5min、31.9min、32.5min、35.5min、37.3min、38.6min、46.2min、50.0min，这些共有峰构成了凤冈锌硒茶的指纹特征，作为凤冈锌硒茶的标准指纹图谱。

乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

本发明达到的技术效果：本发明运用中药指纹图谱的研究平台，建立了贵州凤冈锌硒茶的HPLC指纹图谱，可以实现对贵州凤冈锌硒茶的真伪鉴别及产品地理保护，并且同时实现对凤冈锌硒茶质量的更好控制，主要技术效果体现在一下几个方面：

（1）精密度高，稳定性好：本发明方法的精密度和稳定性试验显示共有峰的相对保留时间、相对峰面积的RSD均小于3%，精密度和稳定性试验相关系数R均大于0.9，具有良好的精密度和稳定性，符合指纹图谱的要求。

（2）本发明建立的贵州凤冈锌硒茶的HPLC指纹图谱可靠有效：抽取29批凤冈锌硒茶样品中的前20批、采集于贵州六盘水的4批茶叶样品、都匀的5批茶叶样品、铜仁的9批茶叶样品及湄潭的14批茶叶样品，对建立的凤冈锌硒茶HPLC指纹图谱模型进行评价，结果显示所建凤冈锌硒茶指纹图谱能有效应用与凤冈锌硒茶的真伪鉴别及产地确认，所建指纹图谱模型能更好的应用于凤冈锌硒茶的地理产品保护及其更全面的质量控制。

附图说明

图1：本发明的凤冈锌硒茶的标准指纹图谱；

图2：精密度试验的指纹图谱的叠加图；

图3：稳定性试验指纹图谱的叠加图；

图4：重复性试验指纹图谱的叠加图；

图5：29批凤冈锌硒茶样品HPLC指纹图谱；

图6：本发明凤冈锌硒茶HPLC对照指纹图谱；

图7：本发明52批贵州茶叶样品HPLC指纹图谱系统聚类分析图。

具体实施方式

实施例1

精密度试验：

本发明凤冈锌硒茶的HPLC指纹图谱的建立方法按照以下步骤进行：

（1）供试品溶液的制备：取样品粉碎，过40目筛，准确称取样品粉末0.25g，置25mL具塞比色管中，加入70%甲醇20mL超声萃取30min，过滤，滤液过0.45μm微孔滤膜。

（2）指纹图谱的制作：HPLC的色谱条件：色谱柱：AgilentZORBAXEclipsePlusC₁₈，4.6×250mm，5μm；柱温：30℃；流动相A为乙腈，流动相B为0.3%冰乙酸，梯度洗脱：0min5％乙腈，4min14%乙腈，21min14%乙腈，26min15%乙腈，34min15%乙腈，40min17%乙腈，45min25%乙腈，55min25%乙腈；流速：0.5mL·min^-1；进样量10μL；检测波长365nm，记录谱图得到凤冈锌硒茶的HPLC指纹图谱，见附图1；

（3）准确吸取上述供试品溶液，按照上述的色谱条件进样测定，连续进样6次，记录HPLC指纹图谱，通过分析比较确定了15个共有特征峰，其保留时间分别为：16.5min、19.6min、20.3min、21.0min、22.0min、23.4min、24.4min、27.5min、31.9min、32.5min、35.5min、37.3min、38.6min、46.2min、50.0min，以13号峰为参照峰S，分别计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积，考察色谱峰的相对保留时间、相对峰面积的一致性，结果见表1和表2，共有峰的相对保留时间、相对峰面积的RSD均小于3%，运用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004A版，采用中位数法计算相似度，精密度试验的指纹图谱的叠加图见附图2，精密度试验相关系数R均大于0.9，相似度结果见表3。上述试验结果表明仪器稳定，精密度良好，符合指纹图谱要求。

表1：相对保留时间精密度试验结果

表2：相对峰面积精密度试验结果

表3：精密度试验相似度结果(中位数)

实施例2

稳定性试验：

取实施例1同一供试品溶液，按照实施例1相同的色谱条件分别在0、4、8、12、16、24小时6个不同的时间点进样，记录HPLC指纹图谱。以13号峰为参照峰S，分别计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积，考察色谱峰的相对保留时间、相对峰面积的稳定性，结果见表4和表5，共有峰的相对保留时间、相对峰面积RSD均小于3%。运用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004A版，采用中位数法计算相似度，稳定性试验匹配图见附图3，稳定性试验相关系数R均大于0.9，相似度结果见表6。上述试验结果表明供试品溶液在24小时内稳定性良好，符合指纹图谱要求。

表4：相对保留时间稳定性试验结果

表5：相对峰面积稳定性试验结果

表6：稳定性试验相似度结果(中位数)

实施例3

重复性试验

按照供试品溶液的制备方法平行制备六份供试品溶液，具体方法：取六份平行样品粉碎，过40目筛，准确称取样品粉末0.25g，置25mL具塞比色管中，加入70%甲醇20mL超声萃取30min，过滤，滤液过0.45μm微孔滤膜。

按照HPLC的色谱条件：色谱柱：AgilentZORBAXEclipsePlusC₁₈，4.6×250mm，5μm；柱温：30℃；流动相A为乙腈，流动相B为0.3%冰乙酸，梯度洗脱：0min5％乙腈，4min14%乙腈，21min14%乙腈，26min15%乙腈，34min15%乙腈，40min17%乙腈，45min25%乙腈，55min25%乙腈；流速：0.5mL·min^-1；进样量10μL；检测波长365nm，记录谱图得到凤冈锌硒茶的HPLC指纹图谱；以13号峰为参照峰S，分别计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积，考察色谱峰的相对保留时间、相对峰面积的重现性，结果见表7和表8，共有峰的相对保留时间、相对峰面积RSD均小于3%。运用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004A版，采用中位数法计算相似度，重复性试验指纹图谱的叠加图见图4，重复性试验相关系数R均大于0.9，相似度结果见表9。上述试验结果表明试验的重复性良好，符合指纹图谱要求。

表7：相对保留时间重复性试验结果

表8：相对峰面积重复性试验结果

表9：重复性试验相似度结果

实施例4

样品的测试试验

根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》，考察了运行时间为120分钟的高效液相色谱图，确定55分钟后未有峰出现，因此色谱图记录时间确定为55min。取凤冈锌硒茶样品共29批，顺序如表10所示，得到29批凤冈锌硒茶样品的HPLC指纹图谱，见附图5。经比较样品的色谱图，其中55min之内29批凤冈锌硒茶样品中在相同的相对保留时间处共有15个色谱峰出现，并标定此15个峰为共有指纹峰。运用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004A版，采用中位数法进行相似度分析，生成共有模式作为凤冈锌硒茶HPLC对照指纹图谱R，见附图6。

表10：贵州不同产地茶叶样品信息表

结合29批凤冈锌硒茶样品HPLC指纹图谱得出各峰保留时间及峰面积，其中15个峰是各批供试品共有峰，以13号峰为参照峰S，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积并进行统计，结果见表11、表12。

表11：29批凤冈锌硒茶HPLC指纹图谱共有峰相对保留时间

表12：29批凤冈锌硒茶HPLC指纹图谱共有峰相对峰面积

结果显示，29批凤冈锌硒茶样品HPLC指纹图谱共有峰相对保留时间的RSD较小，而相对峰面积的RSD较大，说明凤冈锌硒茶样品指纹图谱中主要峰群的整体图貌基本一致，但各成分含量差别较大。

运用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004A版，将29批凤冈锌硒茶样品测定数据导入中药指纹图谱相似度计算软件，经选峰，多点校正，设定匹配模板，将峰自动匹配，然后设定标准模板，进行谱峰差异性评价和整体相似性评价。通过中药指纹图谱相似度计算软件得出贵州凤冈锌硒茶HPLC指纹图谱共有模式。与共有模式比较，采用中位数法进行相似度分析，29批凤冈锌硒茶的相似度。相似度评价结果可知，29批凤冈锌硒茶指纹图谱的相似性较好，相似度均在0.9之上，表明样品之间相似度较高，共有模式图具有代表性，可反映凤冈锌硒茶的指纹特征。

实施例5

样品的测试试验

抽取29批凤冈锌硒茶样品中的前20批、采集于贵州六盘水的4批茶叶样品、都匀的5批茶叶样品、铜仁的9批茶叶样品及湄潭的14批茶叶样品，顺序如表11，采用实施例4的样品处理方法和仪器分析方法，对建立的凤冈锌硒茶HPLC指纹图谱模型进行评价。

利用SPSS21.0统计分析软件，采用夹角余弦法及相关系数法将52批茶叶样品测定HPLC指纹图谱色谱峰峰面积与凤冈锌硒茶HPLC指纹图谱共有模式进行比较，进行相似度分析，52批贵州茶叶样品HPLC指纹图谱与凤冈锌硒茶HPLC指纹图谱共有模式的相似度结果见表13：

表13：贵州茶叶样品HPLC指纹图谱与凤冈锌硒茶HPLC对照指纹图谱相似度评价结果

相似度评价结果可知，20批凤冈锌硒茶HPLC指纹图谱与凤冈锌硒茶HPLC对照指纹图谱的相似度良好好，相似度均在0.9之上，其余样品(除湄潭1～9号样品)HPLC指纹图谱与凤冈锌硒茶对照指纹图谱相似度不达0.9，相似性相对较低，说明凤冈锌硒茶与贵州其他地区样品之间化学成分差异较大。湄潭1～9号样品与凤冈锌硒茶对照指纹图谱相似度高的原因可能是样品采集地与凤冈相隔较近，样品间地域差异不明显所造成的。

对52批贵州茶叶指纹图谱16个化合物峰面积为指标，利用SPSS21.0统计分析软件，采用组间联接法、平方欧式距离测量技术对52批贵州茶叶样品进行聚类分析，结果见附图7。系统聚类分析的结果显示：52批贵州茶叶样品可以分为两类，A类：湄潭10～14、铜仁1～9、都匀1～5，B类：凤冈1～20、湄潭1～9；B类：六盘水1～4，凤冈1～20。

A类可分为两类：其中铜仁1～9，都匀2、4、5，湄潭10～13的样品比较相似归为A1类；都匀1、3，湄潭14比较相似归为A2类。

B类可分为两类：其中六盘水3、4相似度接近，归为B1类，六盘水1～2，凤冈1～20，湄潭1～9归为B2类。

A1类又可划分为两类：铜仁1～9、湄潭10～12可归为A1-1类；都匀2、4、5、湄潭13可归为A1-2类。

A2类又可分为两类：都匀1、3可归为A2-1类，湄潭14可归为A2-2类。

B2类可分为两类：六盘水1、2归为B2-1类，凤冈1～20、湄潭1～9归为B2-2类。

以上样品聚类结果与其和凤冈锌硒茶对照指纹图谱相似度值密切相关，所得结果与表13的数值吻合。

Claims (2)

1.一种凤冈锌硒茶的HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）供试品溶液的制备：取样品粉碎，过40目筛，准确称取样品粉末0.25g，置25mL具塞比色管中，加入70%甲醇20mL超声萃取30min，过滤，滤液过0.45μm微孔滤膜；

（2）指纹图谱的制作：HPLC的色谱条件：C18色谱柱，4.6×250mm，5μm；柱温：30℃；流动相A为乙腈，流动相B为0.3%冰乙酸，梯度洗脱：0min5％乙腈，4min14%乙腈，21min14%乙腈，26min15%乙腈，34min15%乙腈，40min17%乙腈，45min25%乙腈，55min25%乙腈；流速：0.3～0.8mL·min^-1；进样量10μL；检测波长365nm，记录谱图得到凤冈锌硒茶的HPLC指纹图谱；

（3）标准指纹谱图的确认：按照上述提供的方法，对多批次凤冈锌硒茶建立了HPLC指纹图谱，通过分析比较确定了15个共有特征峰，其保留时间分别为：16.5min、19.6min、20.3min、21.0min、22.0min、23.4min、24.4min、27.5min、31.9min、32.5min、35.5min、37.3min、38.6min、46.2min、50.0min，这些共有峰构成了凤冈锌硒茶的指纹特征，作为凤冈锌硒茶的标准指纹图谱。

2.根据权利要求1所述的一种凤冈锌硒茶的HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

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