CN104483412A

CN104483412A - 一种基于指纹图谱的无锡毫茶掺假的检测方法

Info

Publication number: CN104483412A
Application number: CN201410835638.7A
Authority: CN
Inventors: 李明; 曹光群; 杨成; 曾茜
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2014-12-30
Filing date: 2014-12-30
Publication date: 2015-04-01

Abstract

一种基于指纹图谱的无锡毫茶掺假的检测方法，属于无锡毫茶质量检测技术领域。本发明利用顶空-固相微萃取(HS-SPME)技术富集无锡毫茶香气，通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析，构建无锡毫茶香气GC-MS标准指纹图谱，根据其共有特征峰的相对峰面积，应用化学计量学方法（夹角余弦相似度法或聚类分析），对模拟分别掺入无锡毫茶陈茶或掺入其他品种茶叶的无锡毫茶掺假样品进行香气成分GC-MS指纹分析和掺假鉴别试验。结果表明：两种化学计量学方法对掺入10%（占样品质量的百分含量）及以上无锡毫茶陈茶或其他品种茶叶的无锡毫茶掺假样品都可以予以鉴别。方法准确、灵敏且简便，可用于掺入陈茶与其他品种茶叶的无锡毫茶伪劣样品的检测。

Description

一种基于指纹图谱的无锡毫茶掺假的检测方法

技术领域

本发明涉及一种基于指纹图谱的无锡毫茶掺假的检测方法，特别是一种通过构建无锡毫茶香气GC-MS标准指纹图谱以判定无锡毫茶是否掺假的方法。属于GC-MS用于无锡毫茶质量检测技术领域。

背景技术

中国是茶的发源地及产茶大国，茶叶不仅是人们日常生活中的健康饮品，也是旅游产业中的一个特色主题。“无锡毫茶”产于太湖之滨，是无锡特有的茶叶品种。独特的气候与地质条件赋予无锡毫茶卓越的品质，其外形多白毫、肥壮卷曲、香高、色绿、味醇厚，曾多次荣获“中茶杯”名优茶评比金奖，并于2010年被认定为无锡市非物质文化遗产。近年来，在高额利润的驱动下国内市场上充斥着大量假冒无锡毫茶，严重制约了无锡毫茶的市场化进程，也影响了正规无锡毫茶厂家的利益。但是目前尚没有无锡毫茶真伪鉴别方法的论文或专利公开。

指纹图谱技术是国际上公认的中药质量控制的最有效手段，但其在茶叶中的应用尚处于起步阶段。本发明将GC-MS分析与化学计量学数据处理方法相结合，建立无锡毫茶香气GC-MS指纹图谱用于无锡毫茶掺假检测，方法简便、灵敏且重复性好，可为地方标志茶品无锡毫茶的质量检测方法和质量标准的建立提供科学依据与参考，从而维护无锡毫茶产品的稳定，更好地规范无锡毫茶市场，维护消费者权益。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种准确、灵敏且简便，可用于无锡毫茶掺假的检测方法。

本发明的技术方案是：一种基于指纹图谱的无锡毫茶掺假的检测方法，首先，构建无锡毫茶香气GC-MS标准指纹图谱，包括无锡毫茶香气的提取、GC-MS指纹分析及其标准指纹图谱的确定；

然后，根据无锡毫茶香气GC-MS标准指纹图谱的获得方法，测定模拟掺假样品的香气组成；

最后，根据无锡毫茶样品和模拟掺假样品香气组分的相对含量组成的矩阵，应用化学计量学方法（夹角余弦相似度法或聚类分析法）进行分析，判定待测样品是否掺假。

本发明的具体步骤为：

（1）构建无锡毫茶香气GC-MS标准指纹图谱，提取若干批次不同来源的当年产正宗无锡毫茶样品香气后进行香气成分的GC-MS指纹分析，并确定共有特征峰，具体包括如下步骤：

（a）无锡毫茶香气的提取：无锡毫茶香气的提取：将无锡毫茶粉碎，过40~100目筛，称取2.0 g样品于15 mL顶空瓶中，密封瓶口，置于40℃~90℃水浴锅内预热2~8 min后，将老化好的固相微萃取头插入顶空瓶顶空部分，吸附30~50 min后抽回，立即插入GC-MS仪的GC进样口，于250℃解吸3 min，进行数据采集分析；

（b）GC-MS分析：GC条件：DB-WAX色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气He，流速为0.8 mL/min，不分流进样；进样口温度250℃；程序升温：柱温起始温度45℃，维持2 min，随后以8℃/min升温至80℃，接着以5℃/min升温至150℃，再以10℃/min升温至230℃，维持10 min；MS条件：接口温度250℃，离子源温度200℃，电离方式EI⁺，电子能量70 eV，灯丝发射电流为200 μA，扫描范围35~450 amu；

（c）标准指纹图谱的确定：通过4个不同来源的18个无锡毫茶样品中提取得到的香气成分的GC-MS分析测定，比较其色谱图，确定共有特征峰，得到由其共有特征峰构成的无锡毫茶香气GC-MS标准指纹图谱；

共有特征峰有35个，以18号峰为参照的相对保留时间RT的相对标准偏差RSD均小于1%；其中：

1号峰平均RT为0.14，RSD为0.27%；

2号峰平均RT为0.36，RSD为0.10%；

3号峰平均RT为0.48，RSD为0.10%；

4号峰平均RT为0.56，RSD为0.82%；

5号峰平均RT为0.57，RSD为0.16%；

6号峰平均RT为0.62，RSD为0.23%；

7号峰平均RT为 0.63，RSD为0.14%；

8号峰平均RT为0.69，RSD为0.25%；

9号峰平均RT为0.72，RSD为0.05%；

10号峰平均RT为0.76，RSD为0.05%；

11号峰平均RT为0.77，RSD为0.10%；

12号峰平均RT为0.78，RSD 为0.16%；

13号峰平均RT为0.85，RSD为0.30%；

14号峰平均RT为0.87，RSD为0.40%；

15号峰平均RT为0.89，RSD为0.71%；

16号峰平均RT为0.93，RSD为0.18%；

17号峰平均RT为0.96，RSD为0.04%；

18号峰平均RT为1.00，RSD为0%；

19号峰平均RT为1.02，RSD为0.60%；

20号峰平均RT为1.07，RSD为0.24%；

21号峰平均RT为1.13，RSD为0.62%；

22号峰平均RT为1.16，RSD 为0.62%；

23号峰平均RT为1.30，RSD 为0.72%；

24号峰平均RT为1.31，RSD 为0.80%；

25号峰平均RT为1.32，RSD 为0.40%；

26号峰平均RT为1.39，RSD 为0.62%；

27号峰平均RT为1.40，RSD 为0.10%；

28号峰平均RT为1.41，RSD 为0.05%；

29号峰平均RT为1.43，RSD 为0.08%；

30号峰平均RT为1.46，RSD 为0.06%；

31号峰平均RT为1.49，RSD 为0.12%；

32号峰平均RT为1.50，RSD 为0.08%；

33号峰平均RT为1.57，RSD 为0.10%；

34号峰平均RT为1.66，RSD 为0.10%；

35号峰平均RT为1.85，RSD 为0.10%；

待测样品与标准指纹图谱对比，根据其相对含量组成的矩阵，应用夹角余弦相似度法或聚类分析法进行分析，判定待测样品是否掺假；

夹角余弦相似度法分析：

根据35个共有特征峰的平均相对含量组成的矩阵进行相似度分析，若相似度高于0.80，则该待测未知茶样为无锡毫茶，否则为掺假茶；计算公式为：

/ 式（1）

式（1）中A_i为某个待测未知茶样对应香气组分的相对含量，B_i为标准指纹图谱中对应香气组分的平均相对含量；

聚类分析：

采用欧式里德距离（Euclidean）计算无锡毫茶样品间距离，根据待测未知茶样间距离远近使用Ward法对样本进行分类，均值为1作为标准化处理，进行聚类分析；18号共有峰较稳定，保留时间较居中，因此设定18号峰为参照峰；以35个共有特征峰的平均相对含量组成的矩阵进行聚类分析，其中18号峰作为参照峰，其平均RT为1.00，RSD为0 %。

本发明的有益效果：本发明建立了无锡毫茶香气GC-MS标准指纹图谱，应用无锡毫茶香气GC-MS标准指纹图谱的35个共有特征峰的平均相对含量组成的矩阵，以夹角余弦相似度法或聚类分析法对掺假无锡毫茶进行分析，掺入10%（占样品质量的百分含量）及以上无锡毫茶陈茶与其他品种茶叶的掺假无锡毫茶样品可以予以鉴别。方法准确、灵敏且简便，可用于掺入陈茶与其他品种茶叶的无锡毫茶伪劣样品的检测。

附图说明

图1为本发明的无锡毫茶香气GC-MS指纹图谱，图中共有模式中标示了35个共有峰的峰号，图中还包括8个无锡毫茶样品香气成分的总离子流重叠图。

各峰保留时间（min）分别为：1号峰—2.17；2号峰—5.75；3号峰—7.66；4号峰—8.86；5号峰—9.08；6号峰—9.88；7号峰—10.07；8号峰—10.96；9号峰—11.35；10号峰—12.08；11号峰—12.26；12号峰—12.36；13号峰—13.45；14号峰—13.83；15号峰—14.12；16号峰—14.70；17号峰—15.27；18号峰—15.86；19号峰—16.15；20号峰—17.04；21号峰—17.29；22号峰—18.37；23号峰—20.64；24号峰—20.76；25号峰—21.57；26号峰—21.98；27号峰—22.32；28号峰—22.40；29号峰—22.77；30号峰—23.33；31号峰—23.74；32号峰—23.82；33号峰—25.02；34号峰—26.56；35号峰—29.45。

图2为掺假无锡毫茶样品（19~22号）的香气成分总离子流图。图2-a为19号样品，图2-b为20号样品，图2-c为21号样品，图2-d为22号样品。

图3为掺假无锡毫茶样品聚类分析树状图，图中1~18号为无锡毫茶样品，19~21号为模拟掺入不同质量的陈茶的掺假无锡毫茶样品，22号为模拟掺入四川碧螺春的掺假无锡毫茶样品。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。

实施例1

1.样品与仪器

1.1 样品

4个不同来源的18个无锡毫茶样品均为2013年春茶，掺假无锡毫茶陈茶为2011年秋茶，所有茶样经鉴定为无锡毫茶。四川碧螺春购自无锡大润发超市。

1.2 仪器

Trace MS气相色谱-四级杆质谱联用仪(美国Finnigan公司)；手动SPME进样器(美国Supelco公司)；15 mL顶空瓶（上海安谱科学仪器有限公司）；DB-WAX色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。

2.方法与结果

2.1无锡毫茶香气的提取：将无锡毫茶粉碎，过70目筛，称取2.0 g样品于15 mL顶空瓶中，密封瓶口，置于80℃水浴锅内预热5 min后，将老化好的碳分子筛/二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷固相微萃取头插入顶空瓶顶空部分，吸附40 min后抽回，立即插入GC-MS仪的GC进样口，于250℃解吸3 min，进行数据采集分析；

2.2 GC-MS分析：将富集了无锡毫茶香气的固相微萃取头立即插入GC-MS仪的GC进样口，于250℃解吸3 min，进行数据采集分析。GC条件：DB-WAX色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气He，流速为0.8 mL/min，不分流进样；进样口温度250℃；程序升温：柱温起始温度45℃，维持2 min，随后以8℃/min升温至80℃，接着以5℃/min升温至150℃，再以10℃/min升温至230℃，维持10 min。MS条件：接口温度250℃，离子源温度200℃，电离方式EI⁺，电子能量70 eV，灯丝发射电流为200 μA，扫描范围35~450 amu。

2.3 共有峰的确定：通过18个无锡毫茶样品中提取得到的香气成分的GC-MS分析测定，比较其色谱图（如图1所示），找出其共有特征峰（共35个峰），得到无锡毫茶香气GC-MS指纹图谱，共有特征峰以18号峰为参照的相对保留时间RT的相对标准偏差RSD均小于1%；其中

1号峰平均RT为0.14，RSD为0.27%；

2号峰平均RT为0.36，RSD为0.10%；

3号峰平均RT为0.48，RSD为0.10%；

4号峰平均RT为0.56，RSD为0.82%；

5号峰平均RT为0.57，RSD为0.16%；

6号峰平均RT为0.62，RSD为0.23%；

7号峰平均RT为 0.63，RSD为0.14%；

8号峰平均RT为0.69，RSD为0.25%；

9号峰平均RT为0.72，RSD为0.05%；

10号峰平均RT为0.76，RSD为0.05%；

11号峰平均RT为0.77，RSD为0.10%；

12号峰平均RT为0.78，RSD 为0.16%；

13号峰平均RT为0.85，RSD为0.30%；

14号峰平均RT为0.87，RSD为0.40%；

15号峰平均RT为0.89，RSD为0.71%；

16号峰平均RT为0.93，RSD为0.18%；

17号峰平均RT为0.96，RSD为0.04%；

18号峰平均RT为1.00，RSD为0%；

19号峰平均RT为1.02，RSD为0.60%；

20号峰平均RT为1.07，RSD为0.24%；

21号峰平均RT为1.13，RSD为0.62%；

22号峰平均RT为1.16，RSD 为0.62%；

23号峰平均RT为1.30，RSD 为0.72%；

24号峰平均RT为1.31，RSD 为0.80%；

25号峰平均RT为1.32，RSD 为0.40%；

26号峰平均RT为1.39，RSD 为0.62%；

27号峰平均RT为1.40，RSD 为0.10%；

28号峰平均RT为1.41，RSD 为0.05%；

29号峰平均RT为1.43，RSD 为0.08%；

30号峰平均RT为1.46，RSD 为0.06%；

31号峰平均RT为1.49，RSD 为0.12%；

32号峰平均RT为1.50，RSD 为0.08%；

33号峰平均RT为1.57，RSD 为0.10%；

34号峰平均RT为1.66，RSD 为0.10%；

35号峰平均RT为1.85，RSD 为0.10%；

它们构成了无锡毫茶香气品质的指纹特征。

2.4 GC-MS方法学考察：

精密度试验：称取1号无锡毫茶样品5份，按照2.1条件下富集茶叶香气，并在2.2条件下连续进样5次，对各共有峰的相对保留时间（以18 号峰的保留时间为参照）和相对峰面积进行统计。结果表明，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差（RSD）均小于1%，表明无锡毫茶香气的色谱指纹分析精密度试验符合要求。

重复性试验：称取1号无锡毫茶样品，平行制备5份，分别按照2.1和2.2条件下富集和分析茶叶香气，对各共有峰的相对保留时间（以18 号峰的保留时间为参照）和相对峰面积进行统计。结果表明，各共有峰的相对保留时间的RSD<1%，相对峰面积的RSD＜3%。

稳定性试验：称取1号无锡毫茶样品5份，分别在0，4，8，12，24 h后分别按照2.1和2.2条件下富集和分析茶叶香气，对各共有峰的相对保留时间（以18 号峰的保留时间为参照）和相对峰面积进行统计。结果表明，各共有峰的相对保留时间的RSD<1%，相对峰面积的RSD＜5%。

以上试验显示，上述指纹图谱测定方法精密、稳定、可靠。

2.5 相似度分析

相似度的计算是评价指纹图谱中较为重要的参数，通过相似度计算可量化色谱图间的相似程度。本实验模拟制备4个掺加不同质量陈茶的无锡毫茶样品，按照2.1和2.2的方法测定掺入陈茶的无锡毫茶样品的香气组成，例如，茶样20号香气成分的总离子流图如图2所示。根据无锡毫茶样品和模拟掺假样品香气组分的相对含量组成的矩阵，应用夹角余弦相似度法进行分析，按照公式（1）计算，结果如表1所示。由表1可见，样品19号不能从纯正的无锡毫茶样品（1~18号）中区别出来，而20~22号样品的相似度仅为0.61~0.68，说明这些掺假茶样与无锡毫茶样品（1~18号）有着明显差异，可以予以鉴别，即对于掺入无锡毫茶陈茶与四川碧螺春茶叶的掺假无锡毫茶样品，当掺入10%（占样品质量的百分含量）及以上者即可予以鉴别。

表1 模拟掺入无锡毫茶陈茶与四川碧螺春的掺假无锡毫茶样品组成（质量分数）及相似度结果

掺假样品号	19	20	21	22
					无锡毫茶春茶	95	90	80	90
无锡毫茶陈茶	5	10	20	/
					四川碧螺春	/	/	/	10
相似度	0.80	0.68	0.61	0.65

2.6 聚类分析

聚类分析是常见的多元统计方法，其基本思路是用“相似度”来衡量样品间的亲疏程度，样本间越相似则彼此间的空间距离越小，而不相似的样本间的空间距离偏大，利用距离远近可达到分类的目的。本实验模拟制备4个掺加不同质量陈茶的无锡毫茶样品，按照2.1和2.2的方法测定掺入陈茶的无锡毫茶样品的香气组成，采用Ward法作为聚类方法、Euclidean距离计算各茶样间的距离，进行聚类分析。18号共有指纹峰较稳定，保留时间较居中，因此设定18号峰为参照峰。然后，根据无锡毫茶样品和模拟掺假样品香气组分的相对含量组成的矩阵进行聚类分析，得到无锡毫茶与掺伪茶的聚类分析树状图，如图3所示。由图3可见，样品19号不能从纯正的无锡毫茶样品（1~18号）中区别出来，而20~22号样品则均可区分于1~18号无锡毫茶样品，即对于掺入无锡毫茶陈茶与四川碧螺春茶叶的掺假无锡毫茶样品，当掺入10%（占样品质量的百分含量）及以上者即可予以鉴别。

Claims

1.一种基于指纹图谱的无锡毫茶掺假的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）构建无锡毫茶香气GC-MS标准指纹图谱，提取若干批次不同来源的当年产正宗无锡毫茶样品香气后进行香气成分的GC-MS指纹分析，并确定共有特征峰；

（2）采用步骤（1）中的无锡毫茶香气GC-MS标准指纹图谱的获得方法，测定无锡毫茶未知样品的香气成分的GC-MS色谱图；

（3）将步骤（2）获得的无锡毫茶未知样品的香气成分的GC-MS色谱图与步骤（1）得到的标准指纹图谱进行比较，根据它们的相对含量组成的矩阵，进行相似度分析或进行聚类分析，判定无锡毫茶未知样品是否掺假。

2.根据权利要求1所述的基于指纹图谱的无锡毫茶掺假的检测方法，其特征在于，所述步骤（3）中相似度分析，采用夹角余弦法，根据35个共有特征峰的平均相对含量组成的矩阵进行相似度分析，若相似度高于0.80，则该待测未知茶样为无锡毫茶，否则为掺假茶；计算公式为：

/ 式（1）

式（1）中A_i为某个待测未知茶样对应香气组分的相对含量，B_i为标准指纹图谱中对应香气组分的平均相对含量。

3.根据权利要求1所述的基于指纹图谱的无锡毫茶掺假的检测方法，其特征在于，所述步骤（3）中聚类分析，采用欧式里德距离Euclidean计算无锡毫茶样品间距离，根据待测未知茶样间距离远近使用Ward法对样本进行分类，均值为1作为标准化处理，进行聚类分析，设定18号峰为参照峰，以35个共有特征峰的平均相对含量组成的矩阵进行聚类分析，其中18号峰作为参照峰，其平均RT为1.00，RSD为0 %。