CN103864903A

CN103864903A - 乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103864903A
Application number: CN201210537143.7A
Authority: CN
Inventors: 才蕾; 任艳娜; 唐时幸; 王继华
Original assignee: Guangzhou Wondfo Biotech Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Wondfo Biotech Co Ltd
Priority date: 2012-12-12
Filing date: 2012-12-12
Publication date: 2014-06-18
Anticipated expiration: 2032-12-12
Also published as: CN103864903B

Abstract

本发明公开了乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白及其制备方法和应用。所述的乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白的氨基酸组成如SEQ ID NO.9所示或与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列具有90%同源性。其制备方法包括：重组质粒pET-28a-S的构建；重组质粒pET-28a-S-S1的构建；乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白的表达和纯化。所述的乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白具有较高的灵敏度和特异性，可应用于生物医药领域，特别是应用在乙肝病毒表面抗体胶体金检测试纸条中。

Description

乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白及其制备方法，及其在免疫层析分析领域中的应用。

技术背景

乙型肝炎病毒（HBV）是一种DNA病毒，它的感染是一个世界性的公共卫生问题，中国有约1.3亿慢性乙肝病毒携带者，其中乙肝表面抗原的携带率约10%，每年约有30万人最终死于乙肝有关的慢性疾病，是慢性传染病中的头号杀手。慢性HBV感染患者主要表现为肝损伤以及脂肪变性和纤维化相关的代谢紊乱，长期感染患者还可能发展成为肝硬化和肝细胞癌。乙型肝炎的治疗可分为两大类：一类是抗病毒治疗。抗病毒治疗主要是α干扰素和核苷类药物，干扰素主要刺激细胞介导的免疫反应来抑制HBV，同时通过攻击靶细胞而消除病毒；核苷类药物可以通过抑制HBV的复制控制病毒的增殖。另一类是免疫治疗。主要是宿主针对受病毒感染的干细胞的免疫反应和引起炎症的细胞因子的介导的，免疫治疗可以打破免疫耐受状态，诱导机体有效的机体免疫，抑制并清除病毒。这两种治疗均有一定的疗效，但在治疗的整个过程中要定期检测体内的病毒标志物（HBsAg、HBeAg、抗-HBe和HBV-DNA）的水平，以及时调整治疗方案。因此，乙肝有关的慢性疾病的诊断和监控是当前我国亟待解决的重大课题之一。

乙型肝炎表面抗原（HBsAg）是乙型肝炎病毒（HBV）外壳的一种结构成分，在病毒吸附至易感细胞受体中起重要作用。HBsAg存在于患者血清小球型颗粒、管型颗粒和Dane颗粒中，HBV感染后绝大多数感染者外周血中会出现HBsAg，其定性检测是判断乙型肝炎病毒感染状态的常规指示，对乙型肝炎临床早期诊断抗病毒治疗方案的选择及预后判断均具有重要意义；另外，HBsAg也是乙肝疫苗重要的免疫原之一。

早期HBsAg主要是从乙型肝炎病毒感染者血液中获得，该种血液存在着不良因素，可能混有其他病原体或其他型的肝炎病毒。近年来随着乙肝治疗水平的提高和计划免疫的推行，高效价血源HBsAg的获取越来越困难。因此，借助分子生物学和基因工程技术的迅速发展，目前国际上应用的免疫学检测技术和疫苗主要是酵母或CHO细胞表达的S蛋白，但大约有5%-10%的人群存在免疫逃避。尽管近年来许多科研工作者投身乙肝表面抗原的研究，中国预防兽医学院病毒研究所也成功研制CHO细胞中表达的含S和PreS1基因的乙肝表面抗原，但是细胞株的表达量低，导致产量低，成本居高不下，远远不能满足市场的需求。

HBsAg主要由S、前S1和前S2三个亚基组成。其中S由226个氨基酸组成，是乙肝预防性疫苗的组成成分。但含有前S1抗原的第3代预防性疫苗Hepacare,其抗体阳转率可以达到95%左右，免疫原性明显优于单纯的S蛋白。研究显示，前S1抗原的21-28位氨基酸是一个T细胞识别位点，第12-32和32-53位氨基酸是B细胞决定簇，第21-47位氨基酸是HBV结合肝细胞的主要区域，针对它的抗体可以封闭该位点并阻止HBV的再感染。因此我们将表达前S1的肝细胞结合位点aa21-47编码基因串联到HBsAg编码基因的碳端,使其与S蛋白以嵌合蛋白的形式在大肠杆菌中大量表达，以期可以得到成本低、特异性好、灵敏度高的乙肝表面抗原，为免疫学检测技术和高效廉价疫苗的开发提供生物原材料，有效降低检测成本和疫苗生产成本。

发明内容

本发明的目的之一在于制备特异性强、灵敏度高的乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白。

为解决上述技术问题，本发明提供的乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白的氨基酸组成如SEQ ID NO.9所示；或所述乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白氨基酸组成与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列具有90%同源性。

本发明的目的之二在于提供一种操作简单成本低的乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白的制备方法。

为达到以上目的，本发明提供以下技术方案：

一种乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

a.重组质粒pET-28a-S的构建：将碱基组成如SEQ ID NO.2的序列经过限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切后，克隆入经同样双酶切的质粒pET-28a中，获得重组质粒pET-28a-S；

b.重组质粒pET-28a-S-S1的构建：将碱基组成如SEQ ID NO.6的序列采用限制性内切酶HindIII和NotI双酶切后，克隆入经同样双酶切的重组质粒pET-28a-S中，获得重组质粒pET-28a-S-S1；

c.乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白的表达和纯化：将步骤b所得重组质粒pET-28a-S-S1转化到大肠杆菌BL21（DE3），用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达，超声破碎，离心弃上清，沉淀用含7.5-8.5M脲的Tris-HCl溶液溶解后离心取上清，用Ni²⁺亲和层析柱纯化，即得到乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白。

进一步，步骤a是：以SEQ ID NO.1为模板，以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为引物，进行PCR扩增，扩增产物经限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切后，克隆入经同样双酶切的质粒pET-28a中，获得重组质粒pET-28a-S。

进一步，步骤b是：以SEQ ID NO.5为模板，以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8为引物，进行PCR扩增，扩增产物经采用限制性内切酶HindIII和NotI双酶切后，克隆入经同样双酶切的重组质粒pET-28a-S中，获得重组质粒pET-28a-S-S1。

进一步，步骤c为：将步骤b所得的重组质粒pET-28a-S-S1转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，用终浓度为1mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷于温度30-37℃，诱导表达4-6小时，收集菌体，超声破碎，离心弃上清，沉淀用含7.5-8.5M脲的Tris-HCl（pH 7.8）溶液溶解后，离心取上清，用Ni²⁺亲和层析柱纯化，得到所述乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白。

本发明的目的之三在于该乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白在生物医药领域的应用，特别是乙肝检测试剂产品中的应用，从而为疾病的临床检测技术的开发提供优质的生物原材料。

为达到上述目的本发明提供以下技术方案：

乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白在HBV快速检测免疫层析技术及HBV重组嵌合疫苗中的应用。

本发明的效果在于①该嵌合蛋白SS1包括乙肝表面抗原sAg的主要抗原表位和两个亲水区（P35-52、P99-156）；②该嵌合蛋白SS1包括在病毒及亚病毒颗粒的装配中起主要成分，可以刺激机体产生中和性抗体或称为保护性抗体；并且包含免疫原性更强的前S1的肝细胞结合位点。③本发明的SS1重组嵌合蛋白为病毒样颗粒，其大小与天然病毒相近，在体内容易被树突细胞捕获，进而传递给T细胞，激活CTL反应，而且SS1在体内大部分被树突和巨噬细胞捕获，对体细胞的影响很小，不存在免疫耐受和免疫反毒问题。④本发明的SS1重组嵌合蛋白含有S1的肝细胞结合位点aa21-47，研究表明S1具有比S更强的免疫原性，可以增加蛋白的反应原性和免疫原性，解决当前乙肝表面抗原的免疫逃避问题。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案更加清楚明了、便于理解，下面将结合附图对本发明的相关内容作进一步详细阐述，其中：

图1为S编码基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中第一泳道是DNA（DL 2000）分子量标准，第二泳道为PCR扩增产物；

图2为S1编码基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中第一泳道是DNA（DL 2000）分子量标准，第二泳道为PCR扩增产物；

图3为SS1重组嵌合蛋白编码基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中第一泳道是DNA（DL 2000）分子量标准，第二泳道为PCR扩增产物；

图4为重组载体pET-28a-S-S1的PCR鉴定及酶切鉴定图，其中第一泳道为重组载体酶切产物，第二泳道为空载体pET-28a，第3泳道为酶切的阴性空白对照，第4泳道为DNA（DL 5000）分子量标准；

图5为乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中第一泳道是蛋白分子量标准图，第二泳道为阳性克隆菌株诱导后的样品；

图6为乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白的Western Blot检测结果。

具体实施方式

以下实施例是对本发明具体操作进行详尽描述，凡在实施例中未注明实验条件的均采用常规分子生物学实验条件，或按照相关产品的使用说明书操作。

实施例1重组嵌合蛋白HBsAg的设计

首先根据国内外已报道的乙肝表面抗原的序列及抗原表位信息，选择合成乙肝表面抗原S和PreS1的编码基因。

S

ATGGAGAACATCGCCAGTGGCCTGTTAGGTCCTTTACTGGTGCTGCAGGCC

GGCTTTTTCCTGCTGACCAAGATCCTGACCATCCCGCAGAGCCTGGACAGC

TGGTGGACCAGCCTGAACTTCTTAGGCGGCACCCCTGTTTGTCTGGGCCA

GAACAGCCAGAGCCAGATCAGCAGCCACAGTCCGACCTGTTGCCCTCCGA

TTTGTCCTGGCTATCGCTGGATGTGCCTGCGCCGCTTCATCATCTTCCTGTG

CATCCTGCTGCTGTGCCTGATTTTCCTGCTGGTTCTGCTGGACTACCAGGGT

ATGCTGCCTGTGTGCCCTCTGATCCCGGGCAGTAGCACCACCAGTACCGGT

CCGTGCAAGACCTGCACCACACCTGCCCAGGGCACCAGCATGTTCCCGAG

CTGCTGCTGCACCAAGCCGACAGACGGCAACTGCACCTGCATTCCGATCC

CGAGTAGCTGGGCCTTCGCCAAGTACCTGTGGGAATGGGCCAGCGTGCGC

TTCAGCTGGCTGAGTCTGCTGGCCCCGTTCGTGCAGTGGTTCGTGGGCTTA

AGCCCGACCGTGTGGCTGAGCGTGATCTGGATGATGTGGTTCTGGGGCCCT

AGCCTGTATAACATCCTGAGCCCGTTCATGCCGCTGCTGCCTCTGTTCTTCT

GCCTGTGGGTGTATATC （SEQ ID NO.1）

以S为模板扩增的产物序列：

CTAGGATCCATCCTGACCATCCCGCAGAGCCTGGACAGCTGGTGGACCAG

CCTGAACTTCTTAGGCGGCACCCCTGTTTGTCTGGGCCAGAACAGCCAGA

GCCAGATCAGCAGCCACAGTCCGACCTGTTGCCCTCCGATTTGTCCTGGCT

ATCGCTGGATGTGCCTGCGCCGCTTCATCATCTTCCTGTGCATCCTGCTGCT

GTGCCTGATTTTCCTGCTGGTTCTGCTGGACTACCAGGGTATGCTGCCTGT

GTGCCCTCTGATCCCGGGCAGTAGCACCACCAGTACCGGTCCGTGCAAGA

CCTGCACCACACCTGCCCAGGGCACCAGCATGTTCCCGAGCTGCTGCTGC

ACCAAGCCGACAGACGGCAACTGCACCTGCATTCCGATCCCGAGTAGCTG

GGCCTTCGCCAAGTACCTGTGGGAATGGGCCAGCGTGCGCTTCAGCTGGC

TGAGTCTGCTGGCCCCGTTCGTGCAGTGGTTCAAGCTTGGG（SEQ ID NO.2）

PreS1

ATGGGAGGTTGGTCTTCCAAACCTCGACAAGGCATGGGGACGAATCTTTC

TGTTCCCAATCCTCTGGGATTCTTTCCCGATCACCAGTTGGACCCTGCGTTC

GGAGCCAACTCAAACAATCCAGATTGGGACTTCAACCCCAACAAGGATCA

CTGGCCAGAGGCAAATCAGGTAGGAGCGGGAGCATTTGGTCCAGGGTTCA

CCCCACCACACGGAGGCCTTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGGCATA

TTGACAACACTGCCAGCAGCACCTCCTCCTGCCTCCACCAATCGGCAGTC

AGGAAGACAGCCTACTCCCATCTCTCCACCTCTAAGAGACAGTCATCCTCA

GGCC（SEQ ID NO.5）

以PreS1为模板扩增的产物序列：

CCCAAGCTTCCAGTTGGACCCTGCGTTCG

GAGCCAACTCAAACAATCCAGATTGGGACTTCAACCCCAA

CAAGGATCACTGGCCAGAGGCGCGGCCGCATT（SEQ ID NO.6）。

其次，根据国内外乙肝表面抗原的相关报道，选择可以引起机体免疫反应且能与机体产生的抗体反应的抗原表位，以合成序列为模板分别扩增S和S1主要抗原表位。为了保持各抗原表位的天然构象，尽可能少的插入外源序列，本发明将两个片段通过酶切位点HindIII直接串连后，克隆入表达载体进行表达。

实施例2重组嵌合蛋白的制备

一、HBsAg的制备

首先为了便于融合肽的原核表达，根据上述蛋白的氨基酸序列，对上述氨基酸序列进行优化，并委托苏州金唯智生物科技有限公司进行合成。

（1）以合成的S（SEQ ID NO.1）为模板，上游引物SP15'-CTAGGATCCATCCTGACCATCCCGCAG-3'（SEQ ID NO.3）、下游引物SP25'-CCCAAGCTTGAACCACTGCACGAACGG-3'（SEQ ID NO.4）进行PCR扩增，扩增条件为：预变性94℃5min，变性94℃40s，退火56℃40s，延伸72℃50s，34个循环，最后延伸72℃10min。PCR产物（碱基组成如SEQ ID NO.2）经过琼脂糖凝胶电泳检测后（参见图1）用BamHI和HindIIII双酶切，再与经过相同酶切的质粒pET-28a，在T4连接酶的作用下得到重组质粒pET-28a-S。

（2）其次以S1（SEQ ID NO.5）为模板，采用以下引物：上游引物S1P15'-CCCAAGCTTCCAGTTGGACCC-3'（SEQ ID NO.7），下游引物S1P25'-AATGCGGCCGCGCCTCTGGCCA-3'（SEQ ID NO.8），进行PCR扩增，扩增条件为：预变性94℃5min，变性94℃40s，退火58℃40s，延伸72℃40s,34个循环，最后延伸72℃10min。PCR产物（碱基组成如SEQ ID NO.6）经过琼脂糖凝胶电泳检测后（参见图2）用HindIIII和NotI双酶切后，与经过相同酶切的重组质粒pET-28a-S，在T4连接酶的作用下得到重组质粒pET-28a-S-S1，（重组嵌合蛋白编码基因PCR扩增产物参见图3，重组载体pET-28a-S-S1的PCR鉴定及酶切鉴定参见图4）。

二、重组嵌合蛋白SS1的原核表达、纯化与复性

（3）将测序正确的阳性质粒pET-28a-S-S1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，37℃培养16h。挑取单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5mL LB液体培养基中，37℃，200r/min培养过夜。次日，以1：100比例转接于200mL新鲜LB培养基中，37℃，200r/min培养至OD₆₀₀值约为0.6时，加入IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）至终浓度分别为0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.5mM、1mM，分别37℃诱导培养2h、4h、5h、6h、过夜。

（4）细菌诱导表达后，将各诱导菌株各取1ml，4℃8000rpm离心3min，将菌体重悬后，与上样缓冲液混合，煮沸10min；样品经SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况结果显示，IPTG终浓度1mM、诱导时间为5h时，重组蛋白的表达量达到最高（参见图5）。

（5）将表达量较高的样品重新进行进行SDS-PAGE电泳后，将胶条割至合适大小，用电转缓冲液平衡，5min×3次；预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min；转膜装置从下至上依次按阳极碳板、3层滤纸、NC膜、凝胶、3层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源，恒压30V，转移3h。转移结束后，断开电源将膜取出；TBST洗膜，5min×3次；加入包被液，平稳摇动，室温2h；弃包被液，用TBST洗膜，5min×3次；加入一抗，平稳摇动，室温1h；弃一抗，用TBST洗膜，5min×4次；加入辣根过氧化物酶偶联的二抗，平稳摇动，室温0.5－1h；弃二抗，用TBST洗膜，5min×3次；再将膜转入TBS中洗2遍，每次5min-10min；加入显色液，避光显色至出现条带时立即放入双蒸水中终止反应；用凝胶成像系统拍下实验结果（参见图6）。

（6）取冻存的pET-28a-S-S1转化菌液10μl，加入5ml新鲜的LB普通营养肉汤37℃、200rpm过夜培养，再取新鲜菌液4ml加入到400ml的新鲜的LB普通营养肉汤37℃、200rpm培养至OD₆₀₀=0.6，加入IPTG终浓度1mM，37℃诱导培养5h时，4℃8000rpm离心10min收集菌体。将获得菌体以超声裂解液悬溶，超声条件为：工作时间5S，间歇时间12S，工作时长15min，功率400w。4℃12000转，离心10min，弃上清。将沉淀以2M Urea，20mM Tris-HCl（pH7.8），2%triton x-100，pH8.5洗涤一次，再以8M Urea，20mM Tris-HCl，pH7.8溶解，4℃12000转，离心20min取上清。

包涵体纯化：介质：NI sepharose 6ff；Buffer A：20mM Tris-HCl，pH8.0；Buffer B：20mM Tris-HCl，pH8.0，0.5M咪唑；平衡体系：2%B；洗脱体系：10%B、20%B、30%B、50%B、100%B。

（7）包涵体透析复性：①用50mM Tris-HCl（pH7.8），20mM NaCl，0.02%SDS稀释一倍（稀释复性液往样品中慢慢添加，边添加边搅拌，4℃搅拌4h）。②将上述①中得到的稀释样品装入处理好的透析袋中，并放入1L含50mM Tris-HCl（pH7.8），50mM NaCl，2M Urea，0.02%SDS的透析液中，透析过夜。③将上述②中的透析袋转放入1L含50mM Tris-HCl（pH7.8），50mM NaCl,1M Urea，0.02%SDS的透析液中，透析4小时。④将上述③中的透析袋转放入1L含50mMTris-HCl（pH7.8），20mM NaCl，0.02%SDS的透析液中，透析4小时。⑤将上述④中的透析袋转放入1L含50mM Tris-HCl（pH7.8），0.02%SDS，1mM EDTA，0.02%NaN₃透析液中，透析过夜。⑥将上述⑤中透析好的样品转入干净的50mL离心管中，12000rpm 4℃离心20min，取上清。

经测序分析，乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白基因编码序列对应的氨基酸组成为：

ILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTPVCLGQNSQSQISSHSPTCCPPICPGYRWMCLR

RFIIFLCILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGS STTSTGPCKTCTTPAQGTSMF

PSCCCTKPTDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSWLSLLAPFVQWFKLPL

GFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNP（SEQ ID NO.9）

实施例4SS1胶体金免疫层析试纸条的特异性实验

为探讨本发明研制的乙肝病毒表面重组嵌合蛋白的特异性，我们将本发明所述的氨基酸组成如SEQ ID NO.9的重组嵌合蛋白溶液按照约1.0mg/ml标金，风干后按常规方法制成试纸条（暂时称“SS1胶体金试纸条”），与外购ELISA试剂盒和乙肝胶体金检测卡同时检测1050例临床样本，结果显示，SS1胶体金试纸条、外购ELISA试剂盒、乙肝胶体金检测卡A、乙肝胶体金检测卡B分别检测出阳性77例、77例、73例、74例。经多家公司的检测卡复检证明本研究中心研制的乙肝病毒表面重组嵌合蛋白胶体金试纸条检测的1050例样品中，准确率为100%，其特异性明显高于市面上已有产品。

表1：SS1胶体金试纸条特异性检测报告

	阴性	阳性	合计
				SS1胶体金试纸条	973	77	1050
ELISA试剂盒	973	77	1050
				乙肝胶体金检测卡A	977	73	1050
乙肝胶体金检测卡B	976	74	1050

实施例5SS1胶体金免疫层析试纸条的灵敏度实验

为探讨本发明的灵敏度，现将本发明所述氨基酸组成如SEQ ID NO.9的重组嵌合蛋白代替广州万孚生物技术股份有限公司现有产品中的外购蛋白，按照本领域的常规技术，做成乙肝金标检测试纸条（暂时称“SS1胶体金试纸条”），通过对广州万孚生物技术股份有限公司乙肝表面抗原胶体金检测试纸条质控品的检测，对其灵敏度进行评价（结果见下表）。其中表2中的对照方案为广州万孚生物技术股份有限公司已上市产品乙肝表面抗原检测试纸条各辅料的匹配方案，待检方案为SS1胶体金试纸条的辅料匹配方案；表3中的检测项为广州万孚生物技术股份有限公司已上市产品乙肝表面抗原检测试纸条的内控标准，对照是广州万孚生物技术股份有限公司已上市产品乙肝表面抗原检测试纸条对标准品的检测结果，待检方案为本发明所述的SS1胶体金试纸条对标准品的检测结果。

表2：胶体金试纸条辅料匹配方案

	膜	金子垫	辅料
				对照方案	SAb膜120704	SAB喷金121011	Sab-2玻纤110525
待检方案	SAb膜120704	SAB喷金121011	Sab-2玻纤110525

表3：SS1胶体金试纸条标准品检测结果

该结果表明，本发明蛋白的灵敏度明显优于外购蛋白，能很好的适用于公司的乙肝表面抗原检测试纸条。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.氨基酸组成如SEQ ID NO.9所示的乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白或与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列具有90%同源性的乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白。

2.一种乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

b.重组质粒pET-28a-S-S1的构建：将碱基组成如SEQ IDNO.6的序列采用限制性内切酶HindIII和NotI双酶切后，克隆入经同样双酶切的重组质粒pET-28a-S中，获得重组质粒pET-28a-S-S1；

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，所述步骤a是：以SEQ IDNO.1为模板，以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为引物，进行PCR扩增，扩增产物经限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切后，克隆入经同样双酶切的质粒pET-28a中，获得重组质粒pET-28a-S。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，所述步骤b是：以SEQ IDNO.5为模板，以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8为引物，进行PCR扩增，扩增产物经采用限制性内切酶HindIII和NotI双酶切后，克隆入经同样双酶切的重组质粒pET-28a-S中，获得重组质粒pET-28a-S-S1。

5.根据权利要求2-4任一项所述的制备方法，其特征是，所述步骤c为：将步骤b所得的重组质粒pET-28a-S-S1转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，用终浓度为0.5-1.0mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷于温度30-37℃，诱导表达4-6小时，收集菌体，超声破碎，离心弃上清，沉淀用含7.5-8.5M脲的Tris-HCl（pH 7.8）溶液溶解后，离心取上清，用Ni²⁺亲和层析柱纯化，得到所述乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白。

6.权利要求1所述的乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白在乙肝病毒表面抗体检测中的应用。

7.权利要求1所述的乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白在乙肝病毒表面抗体胶体金检测试纸条中的应用。

8.权利要求1所述的乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白在HBV重组嵌合疫苗中的应用。