CN103860694A - 一种鼻腔用离子敏感型原位凝胶剂及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种鼻腔用离子敏感型原位凝胶剂，它含有栀子环烯醚萜提取物0.03～0.06g/ml、离子敏感型凝胶材料0.002～0.01g/ml、防腐剂0.002～0.01g/ml、渗透压调节剂0.03～0.05g/ml、pH调节剂，余量为水；pH调节剂调节凝胶剂pH至5～9。本发明还提供了鼻腔用离子敏感型原位凝胶剂的制备方法和用途。本发明提供的鼻腔用离子敏感型原位凝胶剂，有效成分含量高，凝胶材料使用较少，能顺利到达鼻腔的嗅区，不易被鼻纤毛清除，延长药物在鼻黏膜停留时间，显著提高了栀子环烯醚萜提取物跨嗅黏膜转运，增加了药物的生物利用度，可有效保护缺血脑组织，改善学习记忆能，并且，该凝胶剂对鼻粘膜无明显毒副作用，使用安全。

Description

一种鼻腔用离子敏感型原位凝胶剂及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种鼻腔用离子敏感型原位凝胶剂及其制备方法和用途。 

背景技术

栀子为常用中药，在我国应用历史悠久，《史记》货殖传云：“卮，茜千石，亦比千乘之家。”《神农本草经》列为中品，以后历代主要本草著作都有收载。栀子具有清热、泻火、凉血、解毒的功效。现代研究发现，以栀子苷为代表的栀子总环烯醚萜苷是栀子的主要有效成分之一。 

朱晓磊等对于栀子苷及栀子总环烯醚萜苷的药理作用方面做了比较全面深入的研究，表明其在脑缺血级联反应病例过程多个环节的主要靶点，发挥清热泻火，凉血解读之功，使邪去络通二收醒神之效，对脑缺血损伤具有较好的防治作用（朱晓磊，等，栀子苷组抑脑缺血损伤级联反应的作用环节探讨，中国中药杂志，2004,29（11））。栀子苷或栀子总环烯醚萜苷要发挥上述对脑部疾病的治疗作用，必须使损伤脑区获得有效的药物浓度。由于人体血脑屏障的存在，使药物无法通过普通给药途径在脑组织中达到有效的治疗浓度。 

人体鼻腔与颅腔在解剖生理上有着独特的联系，目前鼻腔已成为向脑内非侵袭性疏松药物的有效途径。专利申请号：201010202229.5中，公开了一种治疗脑部疾病的鼻腔给药凝胶制剂，该制剂是以栀子苷或栀子总环烯醚萜苷、泊洛沙姆、水制备的温敏型原位凝胶，可以提高栀子苷的生物利用度，减少给药次数。该专利申请中，栀子提取物的制备方法为:取栀子粗粉，水煎后，经两次醇沉精制，最终得到总环烯醚萜苷含量为55%左右，栀子苷含量为26.8%的栀子提取物，其出膏率为13%，该提取物中有效成分环烯醚萜苷含量较低，这将增大制剂的使用量；同时，其凝胶制剂中，温敏型凝胶材料泊洛沙姆含量占16-23%，该凝胶剂中凝胶材料使用量较高，约为主药的3-23倍，不利于产品成本的节省。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种总环烯醚萜苷高含量的栀子提取物的鼻腔用原位凝胶剂，且其中凝胶材料使用量较小。 

原位凝胶主要有温度敏感、pH敏感和离子敏感三种类型。温度敏感型原位凝胶在冷藏条件下呈液态,在室温或体温时形成凝胶。泊洛沙姆407是研究较多的温敏型成胶材料,不仅有良好的生物相容性,而且能增加难溶性药物的溶解度。缺点是浓度需高达20%～40%才能形成凝胶,对黏膜有安全性问题,且必须冷藏,使用不便。pH敏感型原位凝胶是利用体液的缓冲容量改变高分子溶液的pH值而诱发胶凝。卡波姆是pH敏感型成胶材料的代表,它在酸性条件下溶于水呈低黏度液体,当pH近中性时黏度急剧增大形成凝胶。但卡波姆溶液酸性较强,对黏膜有刺激性,且不易被体液中和而发生相变。 

鉴于上述原位凝胶存在的缺陷，本发明具体提供一种鼻腔用离子敏感型原位凝胶剂及 其制备方法和用途。 

本发明提供了一种鼻腔用离子敏感型原位凝胶剂，它含有栀子环烯醚萜提取物0.03～0.06g/ml、离子敏感型凝胶材料0.002～0.01g/ml、防腐剂0.002～0.01g/ml、渗透压调节剂0.03～0.05g/ml、pH调节剂，余量为水；pH调节剂调节凝胶剂pH至5～9。 

进一步地，栀子环烯醚萜提取物含量为0.04g/ml、离子敏感型凝胶材料含量为0.002～0.003g/ml，pH调节剂调节凝胶剂pH至7.0±0.2。 

优选地，离子敏感型凝胶材料含量为0.002g/ml。 

进一步地，防腐剂含量为0.002g/ml、渗透压调节剂含量为0.03g/ml。 

其中，所述离子敏感型凝胶材料选自结冷胶、去乙酰结冷胶或海藻酸盐；所述防腐剂选自尼泊金酯、苯甲醇、苯酚、间甲酚、苯扎溴铵或苯扎氯铵；所述渗透压调节剂选自甘露醇、山梨醇或葡萄糖；所述pH调节剂选自三羟甲基氨基甲烷。 

进一步地，所述离子敏感型凝胶材料选自结冷胶；所述防腐剂选自尼泊金酯，例如尼泊金甲酯或尼泊金乙酯。 

进一步地，所述栀子环烯醚萜提取物中，以干燥品计算，栀子总环烯醚萜苷含量为70%～80%，栀子苷含量为25～35%。例如，采用本发明最佳工艺制备的提取物干膏中，栀子总环烯醚萜苷含量为74.13%，栀子苷含量为29.83%。 

目前已有多数报道研究了栀子中环烯醚萜苷的提取纯化方法，本发明栀子环烯醚萜提取物可以采用现有方法进行制备，如专利申请200910217553.1中，提供了一种栀子提取物的制备方法，它是将栀子药材水煎提取2～4次，每次加6～30倍水，浓缩，加乙醇使含醇量达50～80%，醇沉，滤液回收乙醇，加水稀释后，活性炭吸附，洗脱后，再用大孔树脂吸附，洗脱，即得到纯化后的栀子环烯醚萜提取物，其浸膏中栀子苷含量可高达65%。 

本发明实施例中采用的制备方法如下： 

所述栀子环烯醚萜提取物由如下方法制备： 

取栀子药材，粉碎，加水煎煮，合并煎煮液，浓缩；加入乙醇至含醇量50%以上，静置醇沉，滤过，滤液回收乙醇，浓缩，经D101大孔吸附树脂柱吸附，先用水洗至无色，再用50～70%v/v乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩液干燥，即得。 

优选地，所述栀子环烯醚萜提取物由如下方法制备： 

取栀子药材，粉碎，加8倍量水，煎煮3次，每次0.5小时，合并煎煮液，浓缩成清膏（每1ml相当药材0.5g），加入乙醇至含醇量50%以上，边加边搅拌，放置12小时以上，滤过，滤液回收乙醇，浓缩成清膏（每1ml相当药材1g），以2.5:1(药材g/树脂g)的处理量经D101大孔吸附树脂柱（径高比为1:3）吸附，吸附速度为2BV/h，先用纯水洗至无色，再用50～70%乙醇溶液洗脱，洗脱速度为2BV/h，收集3BV的乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩液干燥，即得。 

进一步地，所述制剂为喷雾剂。 

本发明还提供了上述鼻用离子敏感型原位凝胶剂的制备方法，它包括如下操作步骤： 

（1）取栀子环烯醚萜提取物，以总加水量30～50%的水溶解，例如可以使用总加水量40%的水溶解； 

（2）取离子敏感型凝胶材料、渗透压调节剂和防腐剂，加入余量水，加热溶解，搅拌下，与步骤（1）所得溶液混匀，加入pH调节剂调节凝胶剂pH至5～9，过滤，灌装，即得。 

步骤（2）中，加热温度以满足充分溶解为指标。 

本发明还提供了上述鼻用离子敏感型原位凝胶剂在制备抗脑缺血损伤、保护脑神经或改善学习记忆能力的药物中的用途。 

进一步地，所述药物是用于治疗急性或慢性脑缺血导致的缺血级联损伤所致诸症症见神经功能降低，神昏，中风等。 

本发明离子敏感型原位凝胶剂的有益效果如下： 

（1）本发明离子敏感型原位凝胶剂中，栀子环烯醚萜提取物中的总环烯醚萜苷含量较高，可以降低制剂的总使用量；离子敏感型凝胶材料使用量极低，为产品成本的节省提供了可能。 

（2）本品能够降低局灶性脑缺血再灌注损伤模型大鼠的脑组织含水量，可以明显改善大鼠缺血区脑梗死面积，同时能够降低神经功能评分，具有一定的神经保护作用。行为学检测发现其能够降低永久结扎双侧颈总动脉实验大鼠的逃避潜伏期，并能够改善给药组大鼠在Morris水迷宫空间探索试验中的游泳轨迹，提示其有较好的改善模型大鼠学习记忆的功效。生化指标在SOD、MDA、NOS、以及TNF-α等指标方面，具有一定的改善作用。 

（3）急性毒性试验 

半数致死量实验中，给药量为1g/kg、3g/kg和5g/kg，小鼠均未出现死亡。因为最大给药剂量为5g/kg，根据目前国内有关中药毒性和安全试验方法介绍（陈奇中药药理研究方法学北京:人民卫生出版社,1996.118）,在此给药剂量5g/kg下未出现死亡，说明栀子提取物毒性较低，应改做测定其最大耐受量。 

最大耐受量实验中，给药量为5g/kg、10g/kg和15g/kg，各组均未出现死亡。本实验中给药剂量15g/kg为在给于最大给药体积的情况下可以给予的最大剂量，药典规定栀子生药材人平均日用量为7.5g（中华人民共和国药典），本实验给药量折合生药材的量为1666.7g生药／kg，其剂量为药典规定成人一天可食用剂量的222倍，根据目前国内有关中药毒性和安全试验方法介绍（陈奇中药药理研究方法学北京:人民卫生出版社,1996.118）,中药的安全性以小鼠能耐受人用量100倍以上为比较安全，因此可认为本样品非常安全。 

（4）长期毒性试验 

长期毒性实验中，各组给药量分别为(300，200和100mg/kg)，已连续给药一个月，各组大鼠均较正常。 

（5）采用粘膜刺激性试验考察药物对大鼠鼻粘膜刺激性，常规体外试管法考察药物 的溶血作用，初步评价药物的粘膜刺激性和溶血性。结果显示栀子凝胶制剂组刺激反应总平均分值均小于0.5，属于无刺激性；同空白对照组对比观察，阳性物对照组致白兔鼻粘膜呈现中度红斑和重度水肿，纯水对照组与栀子凝胶制剂组未见明显红斑和水肿，表明对免疫系统影响很小。 

综上，本发明提供的鼻腔用离子敏感型原位凝胶剂，有效成分含量高，凝胶材料使用较少，能顺利到达鼻腔的嗅区，不易被鼻纤毛清除，延长药物在鼻黏膜停留时间，显著提高了栀子环烯醚萜提取物跨嗅黏膜转运，增加了药物的生物利用度，可有效保护缺血脑组织，改善学习记忆能，并且，该凝胶剂对鼻粘膜无明显毒副作用，使用安全。 

附图说明

图1Franz渗透扩散装置 

图2-1累计透过量曲线图 

图2-2累计透过率曲线图 

图3黏度变化曲线图 

图4假手术组脑梗死面积染色 

图5模型组脑梗死面积染色 

图6鼻腔给药组脑梗死面积染色 

图7假手术组大脑病理切片（HE×100） 

图8模型组大脑病理切片（HE×200） 

图9凝胶制剂组脑病理切片（HE×100） 

图10大鼠海马CAl区病理改变染色图 

具体实施方式

实施例1本发明离子敏感型原位凝胶剂的制备方法 

处方： 

栀子环烯醚萜提取物：40g 

结冷胶：2g 

葡萄糖：30g 

尼泊金甲酯：适量 

三羟甲基氨基甲烷：适量 

纯净水1000ml 

以上原、辅料共制成1000ml，即得。 

制备方法： 

取上述原料药与辅料，栀子环烯醚萜提取物加水400ml使溶解；结冷胶、渗透压调节剂及防腐剂加水600ml，90℃加热使溶解；在搅拌条件下将两种溶液混匀，调节pH值至7.0±0.2，过滤，灌装，即得喷雾剂。 

用前摇匀即成溶液状，揿压喷头阀门即有相当量药物微粒喷出。用时将装在喷雾剂上的鼻腔专用喷头对准鼻腔孔倒喷，在吸气时揿喷一次，喷时须将另一鼻孔用手堵住。一次1～2揿，一日2～3次。 

本发明所使用的栀子环烯醚萜提取物，可以采用现有技术制备得到，如专利申请号:200910217553.1等，本发明采用如下方法制备： 

取栀子药材，粉碎成粗粉，加8倍量水，煎煮3次，每次0.5小时，合并煎煮液，浓缩成清膏（每1ml相当药材0.5g），加入乙醇至含醇量50%以上，边加边搅拌，放置12小时以上，滤过，滤液回收乙醇，浓缩成清膏（每1ml相当药材1g），以2.5:1(药材g/树脂g)的处理量经D101大孔吸附树脂柱（径高比为1:3）吸附，吸附速度为2BV/h，先用纯水洗至无色，再用50～70%乙醇溶液洗脱，洗脱速度为2BV/h，收集3BV的乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩液喷雾干燥，即得。经检测，干膏中栀子总环烯醚萜苷含量为74.13%；栀子苷含量为29.83%。 

实施例2本发明离子敏感型原位凝胶制剂的研究 

一、鼻用制剂的剂型研究 

理想的经鼻给药治疗脑部疾病（脑靶向）制剂的要求：①能顺利到达鼻腔的嗅区；②能跨嗅黏膜转运（增加药物吸收）③不易被鼻纤毛清除（延长药物在鼻黏膜停留时间）④对纤毛毒性低。 

根据上述要求、药物的性质（水溶性）及目前大生产的可行性，拟研制成鼻用喷雾剂。比较研究鼻用溶液剂、凝胶剂、鼻用脂质体、鼻用纳米粒四种剂型。以累积透离体猪嗅黏膜扩散量、纤毛毒性实验、溶血实验结果为评价指标，进行剂型筛选。 

1四种制剂的制备 

（1）溶液剂：取栀子环烯醚萜提取物适量，加水溶解，即得。 

（2）凝胶剂：为延长制剂再鼻腔的滞留时间，制备栀子环烯醚萜提取物的原位凝胶剂。方法：取栀子环烯醚萜提取物适量，加水溶解；取辅料（结冷胶）适量，加水加热使溶解；将两种溶液混匀，即得。 

（3）脂质体：取栀子环烯醚萜提取物适量，加入适量磷酸缓冲液（PBS，pH=7.0）使溶解；另取大豆磷脂、胆固醇适量，加入适量有机相（氯仿-异丙醇=14:1）使溶解；将两种溶液混匀，水浴超声8分钟（20℃），得黄色乳剂，旋转蒸发除去有机溶剂，再滴加少量磷酸缓冲液水化，再旋转蒸发一段时间使成黄色脂质体混悬液，加水至适量，即得。 

（4）纳米粒：取栀子环烯醚萜提取物适量，加适量水使溶解，以水溶液为内水相，将PLGA溶于二氯甲烷作为有机相，两相混合，在冰浴中超声形成初乳；将初乳立即注入到含有壳聚糖（CS）的一定浓度PVA水溶液中，在冰浴中超声制成复乳；将复乳在磁力搅拌（10000r·min^-1）下注入到大量0.5%PVA（w/v）水溶液中，继续搅拌4h使二氯甲烷完全 挥发，离心（10000r·min^-1，10min，4℃），蒸馏水洗涤三次，收集沉淀，加适量水分散，即得。 

2药物鼻腔黏膜吸收 

2.1动物鼻黏膜的剥离 

将新宰杀猪的鼻子取下，切开鼻腔，暴露出鼻中隔及两侧鼻甲骨，用一个圆头的细玻璃棒及镊子将覆盖在其上的鼻腔薄膜非常小心地慢慢剥离。用生理盐水洗净薄膜上残留的血迹，滤纸吸干，平铺于两层铝箔之间，-20℃冰箱冷藏备用。 

2.2实验装置 

采用Franz渗透扩散装置(图1)，包括供给药池和接受池。有效扩散面积为0.64cm²，接收室体为6.0ml。接受室内加人电磁搅拌子和生理盐水溶液，将新鲜离体猪的嗅黏膜黏膜层向上固定在扩散室和供给室之间。 

2.3实验操作 

Franz扩散池安装完毕后,置于32±0.5℃,200r/min的恒温恒速透皮扩散实验仪中,平衡20min。接收室加入4ml生理盐水，用定量加液器加入400μl样品均匀覆盖嗅黏膜,分别于5，15，30，45，60，90，120，180，240min定量取样1ml,每次取样后补加生理盐水溶液1ml，使接收室中液体体积保持恒定。 

2.4样品测定与数据处理 

取出的样品适当稀释后离心处理(10000r/min，10min),再0.45μm滤过，用HPLC仪测定栀子苷的峰面积A，代入标准曲线方程中，换算出相应药物浓度C(μg/ml)，计算药物透过鼻黏膜的累积渗透量Q、表观渗透系数P_app、药物稳态流量J_ss等。对各剂型累积渗透量进行t检验，绘制累计释药曲线，考察药物透膜的动力学方程。 

按下式计算累积渗透量Q： 

$Q=V_0\×C_n+V_i\underset{i=1}{\overset{n-1}{\mathrm{\Σ}}}{C}_i$

上述公式中，Q：累积渗透量(μg)；V₀：接收液体积(ml)；C_n：第n次（即最后一次）取样时测得的接受液中药物浓度((μg/ml)；V_i:每次的取样体积（ml）；C_i：第n-1次测得的接受液中药物浓度(μg/ml)； 

以离体鼻黏膜累积渗透量Q与渗透时间t拟合方程，以下列公式计算药物的表观渗透系数(P_app，cm^-2.s^-1)和稳态流量(J_ss，μg·cm^-2.s^-1)： 

$P_{\mathrm{app}}=\frac{\mathrm{dQ}/\mathrm{dt}}{C_0\×A\×60}$

$J_{\mathrm{ss}}=\frac{\mathrm{dQ}}{\mathrm{dt}}\×\frac{1}{A\×60}$

C₀为供药池初始药物浓度；A为有效透过面积；DQ/dt可由累积透过量-时间曲线稳态部分的斜率求得。 

2.5实验结果 

取用离体猪鼻黏膜，按上述实验方法操作，测得各个载药体系各时间点单位面积的药物累计渗透量，结果见表1。通过Excel绘制累计透过曲线图，结果见图2。 

表1不同制剂栀子苷累计透过量测定结果 

上表中，A:累计透过量(mg)；B:累计透过率(%) 

对数据分别用零级动力学方程、Higuchi方程和一级动力学方程等数学模型拟合,结果以一级动力学方程拟合度最佳,表明原位凝胶中药物的透猪嗅黏膜扩散属于以膜两侧浓度差为动力的被动扩散。 

F(t)_溶液=0.0062t+0.0643R²=0.9807 

F(t)_脂质体=0.0034t-0.0021R²=0.9751 

F(t)_凝胶剂=0.0046t+0.0144R²=0.9723 

F(t)_纳米粒=0.0035t+0.0083R²=0.9483 

分别计算表观渗透系数P_app、药物稳态流量J_ss等参数,结果见表2。 

表2不同载药体系体外渗透系数(栀子苷，n=3，

结果表明，四种载药体系的累计渗透量对时间呈良好的线性关系，符合一级动力学方程。四种载药系统中，以溶液剂的渗透速率及表观渗透系数最大，然后依次为凝胶剂、脂质体和纳米粒。但溶液剂在鼻腔的滞留时间短，易被清除。而凝胶载药体系可延长药物在 鼻腔的滞留时间，且制备方法简单易行，不使用有机溶剂，优于其他载药体系。 

结果表明，渗透速率大小顺序为：溶液>凝胶剂>脂质体>纳米粒 

3鼻纤毛毒性试验： 

采用离体蟾蜍上腭纤毛试验法：将蟾蜍仰卧固定在蛙板上，使口腔张开，用止血钳牵拉，手术剪分离上腭黏膜，生理盐水洗净血块及杂物，平分为2块（每块面积约3mm²），黏膜面向上平铺于载玻片上，一块于黏膜表面滴加0.5m1药液，充分浸没黏膜，另一块于黏膜表面滴加0.5m1生理盐水，分别轻轻盖上盖玻片，于4O×10倍光学显微镜下观察黏膜纤毛的运动情况，随后搁置于加有少量蒸馏水的层析缸中，密闭，使水蒸气近饱和状态，环境温度为2O～25℃。此后每隔适当时间取出标本，显微镜观察，如纤毛继续运动，放回层析缸中，直至纤毛运动停止后，记录从给药开始至纤毛运动停止所持续的时间。再用生理盐水洗净黏膜上药液，继续观察纤毛运动是否恢复，记录恢复后的持续运动时间。 

实验结果见表3。 

表3不同制剂对纤毛持续运动时间的影响结果

以给药组的纤毛持续运动时间除以对照组时间得纤毛持续运动时间的相对百分率。百分率越高，表示药物对纤毛运动的影响越小。一般以纤毛持续运动时间相对百分数大于85%为制剂安全性的阈值。结果表明，四种制剂对纤毛影响均较小。 

4溶血实验： 

取新西兰成年兔1只，心脏取血约10mL，置三角瓶中（预先用l％肝素钠荡洗）。用竹签搅拌去除纤维蛋白，然后将血移人刻度离心管内，加入生理盐水10mL，混匀后离心，1500r/min，15min，去除上清液。再加生理盐水，混匀离心，反复3次，至上清液无色透明为止。用移液枪吸取2ml该红细胞，加生理盐水定容至100ml，即得2%(v/v)的红细胞混悬液。 

取试管6支，编号排列于试管架上，按表4加入各种溶液，其中：1为溶液剂、2为凝胶剂、3为脂质体、4为纳米粒、5为阳性对照、6为阴性对照。将各管轻轻摇匀，37℃水浴2h，3000r/min离心5min，取上清液，备用。 

表4溶血实验安排表 

以生理盐水为空白对照，阳性对照在200～700nm范围内进行光谱扫描，结果供试品在可见光区577nm处有一吸收峰。 

采用分光光度法，在577nm波长处测定各溶液的吸光度，按下列公式计算溶血率，考察各溶液的溶血情况，结果见表5。 

表5溶血率测定结果表(n=3) 

结果表明，四种制剂的溶血率均小于5%，可以认为它们对鼻黏膜的细胞膜基本无毒性作用。 

综上所述，考虑制剂工艺的难易程度和大生产的可行性，四种制剂中，选择原位凝胶剂作为栀子环烯醚萜提取物鼻用喷雾剂。 

原位凝胶主要有温度敏感、pH敏感和离子敏感三种类型。温度敏感型原位凝胶在冷藏条件下呈液态,在室温或体温时形成凝胶。泊洛沙姆407是研究较多的温敏型成胶材料,不仅有良好的生物相容性,而且能增加难溶性药物的溶解度。缺点是浓度需高达20%～40%才能形成凝胶,对黏膜有安全性问题,且必须冷藏,使用不便。pH敏感型原位凝胶是利用体液的缓冲容量改变高分子溶液的pH值而诱发胶凝。卡波姆是pH敏感型成胶材料的代表,它在酸性条件下溶于水呈低黏度液体,当pH近中性时黏度急剧增大形成凝胶。但卡波姆溶液酸性较强,对黏膜有刺激性,且不易被体液中和而发生相变。离子敏感型原位凝胶与温度或pH敏感型原位凝胶相比明显的优势为：①用量低（0.5%以下）,鼻黏膜和纤毛毒性 小；②无须冷藏,使用方便。同时其制备工艺简便,制剂稳定。 

所以拟选用离子敏感型原位凝胶进行研究。 

二、离子敏感型原位凝胶制备工艺研究 

1辅料种类与用量的选择 

1.1辅料用量的考察 

配制不同浓度的结冷胶溶液，通过考察其操作难易程度、外观性状、溶液-凝胶相变离子浓度、相变时间、黏度变化等指标，确定结冷胶的用量。 

取一定量的结冷胶（上海众伟生化有限公司），加入适量水，90℃加热使溶解，分别配制成0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、0.7%、1.0%的溶液。分别察其操作难易程度、外观性状、溶液-凝胶相变离子浓度、相变时间、黏度变化等指标，结果见表6、7、8及图3。 

表6辅料用量的考察结果 

结果表明，浓度越大，操作越困难，时间越长。 

表7相变离子浓度及相变时间测定结果 

结果表明，浓度越大，消耗离子溶液体积(ml)越少，相变时间越短，0.1%在测定时间内不发生相变。表明辅料的用量必须达到0.2%及以上。 

表8粘度测定结果（CP） 

结果可知，0.1%浓度无明显的黏度“突跃”过程，溶液没有发生相转变； 

0.2%及以上浓度有一个明显的黏度“突跃”过程，发生了相转变，且黏度越大，发生相转变所需要的离子溶液体积（人工鼻液）越少，0.2%浓度发生相转变的离子溶液体积为8ml，即相当于人工鼻液离子强度的1/6时即发生相转变。 

综上所述，结冷胶用量为0.2%即可。 

2喷雾剂PH调节剂的考察 

由于鼻腔给药制剂直接作用于鼻粘膜表面，必须考虑PH值及粘膜刺激性问题。人体鼻腔的pH环境为4.5～6.5之间，为避免刺激鼻粘膜，鼻用制剂的PH一般为5～9之间即可。通过测定，栀子环烯醚萜提取物溶液的pH值为4.0左右，需加入一定量的碱液调节pH值，由于本制剂为离子敏感型原位凝胶制剂，直接用氢氧化钠等含K+、Ca2+、Na+离子的溶液调节pH值会破坏制剂，选用30%三羟甲基氨基甲烷调节进行调整即可。 

制备样品溶液：取结冷胶0.2g，加水60ml加热使溶解；另取栀子环烯醚萜提取物2g，加水40ml使溶解，在搅拌条件下将两种溶液混匀，即得原位凝胶剂。 

测定原位凝胶剂的pH值约为4.2，逐步滴加30%三羟甲基氨基甲烷溶液调节pH值，边加边搅拌。当pH值为7.0左右时（实测值为7.1），消耗30%三羟甲基氨基甲烷溶液的体积约为2ml。 

原位凝胶制剂的pH调节剂选择为30%三羟甲基氨基甲烷，用量约为2%。 

3载药量的考察 

根据药效研究预试结果，确定载药量为4%即可。 

4渗透压调节剂的考察 

正常人体血浆渗透压值为0.28～0.32OSMOL/Kg，选用常用的渗透压调节剂葡萄糖或甘露醇进行研究。 

制备样品溶液：取结冷胶0.2g，加水60ml加热使溶解；另取栀子环烯醚萜提取物4g，加水40ml使溶解，在搅拌条件下将两种溶液混匀，即得原位凝胶剂。在制剂中加入不同量的葡萄糖，测定渗透压。结果见表9。 

表9渗透压调节剂的考察结果 

结果表明，渗透压调节剂选用葡萄糖，用量为3%即可。 

5防腐剂的选择 

鼻用制剂可加入适量防腐剂，考虑到本喷雾剂为水溶液制剂，为保证质量的稳定性，需加入一定的防腐剂。预试表明，苯甲酸钠、苯甲醇等防腐剂可能影响制剂稳定性。选用制药及食品工业中广泛应用的防腐剂尼泊金甲酯或乙酯可以满足要求，用量为常规用量0.2%即可。 

6.制剂处方及制备方法 

6.1制剂处方 

根据上述研究结果，确定制剂的处方为：栀子环烯醚萜提取物4g，结冷胶0.2g，葡萄糖3g，30%三羟甲基氨基甲烷溶液2ml，尼泊金甲酯0.2g。按SFDA《中药新药质量标准研究的技术要求》，应将处方调整为1000个制剂单位的成品量为准，所以本方制成1000ml的处方如下： 

栀子环烯醚萜提取物：40g 

结冷胶：2g 

葡萄糖：30g 

30%三羟甲基氨基甲烷溶液：20ml 

尼泊金甲酯：2g 

以上原、辅料共制成1000ml，即得。 

制备方法 

取上述原料药与辅料，栀子环烯醚萜提取物加水400ml使溶解；结冷胶、渗透压调节剂及防腐剂加水600ml，90℃加热使溶解；在搅拌条件下将两种溶液混匀，调节pH值至7.0±0.2，过滤，灌装，即得。 

7.中试研究 

根据上述工艺条件，中试三批栀子环烯醚萜提取物及离子敏感型原位凝胶制剂。中试数据见表10。 

表10栀子环烯醚萜提取物中试研究结果 

对栀子环烯醚萜提取物进行质量检查。结果见表11。 

表11栀子环烯醚萜提取物检查结果 

取中试的三批栀子环烯醚萜提取物各400g，按制剂成型工艺制备三批离子敏感型原位凝胶制剂10000ml。中试数据见表12。 

表12制剂中试研究结果 

对栀子环烯醚萜提取物原位凝胶制剂进行质量检查。结果见表13。 

表13制剂检查结果 

结果表明，该工艺基本稳定、可靠。 

实施例3本发明离子敏感型原位凝胶剂的检测 

1、pH值测定 

随机抽取10瓶制剂，测定pH值。结果如下表14。 

表14pH值测定结果表 

由于鼻腔给药制剂直接作用于鼻粘膜表面，必须考虑pH值及粘膜刺激性问题。人体鼻腔的pH环境为4.5～6.5之间，为避免刺激鼻粘膜，鼻用制剂的pH值一般为5～9之间即可。根据上述测定，本发明制备的凝胶剂pH为7.0±0.2。 

2、喷射速率试验： 

照中国药典2010年版一部附录IZ喷雾剂项下非定量喷雾剂检查法，随机抽取本品4瓶，除去帽盖，分别揿压试喷数次后擦净，精密称定，再揿压喷射5次，擦净，精密称定。重复操作3次。计算每瓶每揿平均喷射量。结果如下表15。 

表15喷射速率试验结果表 

平均喷射量为0.1024g，考虑到制剂制备过程引起的差异，暂定本品每瓶每揿平均喷射量不得低于0.09g。 

以下通过试验例具体说明本发明的有益效果。 

试验例1栀子环烯醚萜苷对局灶性脑缺血实验大鼠的脑缺血面积及神经功能损伤保护作用及相关机制分析 

1.目的 

栀子文献报道具有抗氧自由基、抗炎以及保护神经功能作用，现提取其有效组分栀子环烯醚萜总提物，为试验其作用，故采用急性脑损伤模型以及慢性低灌注脑缺血模型等试验方法以确定其药理作用及有效剂量，为进一步研制成五类中药新药奠定基础，并完成临床前申报资料。 

2试验材料 

2.1药物栀子有效部位凝胶制剂（以下简称凝胶剂），实施例1制备，每g干浸膏含生药16.7g。临床用栀子原药材，口服日用量6～9g。本品为水溶性，试验前若发现凝胶剂发生胶凝作用，则轻轻摇即散即可，剂量按生药g数计算。盐酸多奈派齐片，卫材（中国）药业有限公司制造，5mg/片，产品批号091028A。 

2.2动物雄性SD大鼠成都中医药大学实验动物中心供应，生产许可证号：2005-0001。 

2.3试验室条件室温16～29℃，相对湿度50～80% 

2.4统计学处理用SPSS15.0软件包进行数据处理，数据用均数±标准差（），组间用t检验或F检验。 

3.试验方法和结果 

3.1对大鼠脑缺血再灌注损伤模型的抗炎作用研究 

3.1.1分组及给药 

动物随机分为6组，即假手术组、模型组、凝胶制剂低剂量组、凝胶制剂中剂量组、凝胶高剂量组、空白凝胶组。每组大鼠给三次药，每次双鼻共给药0.1ml/200g，分别是手术前给药一次、术后灌注两小时后给第二次、第二天术后23小时给第三次，第三次给药后1小时处死大鼠，取脑，称湿重。 

3.2大鼠局灶性脑缺血模型的建立 

采用改良线栓法制成大鼠右侧大脑中动脉阻塞(1eft middle cerebral artery occlusion,LMCAO)模型。实验鼠用10%水合氯醛(0.35ml/l00g)麻醉后仰卧位固定于手术台上，经颈正中切口，分离暴露颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)，结扎CCA近心端及ECA根部，顺CCA经ICA将栓线送至颅内，稍遇阻力而止，栓线插入深度为(18.5±0.5)mm，此时栓线头端正好位于MC起始部，阻断了MCA的血流，2小时后缓慢抽动栓线进行再灌注。假手术组只分离、暴露血管，不结扎颈总动脉及颈外动脉，不插入尼龙鱼线。术后伤口用青霉素消毒，依次缝合肌肉、皮肤。手术过程中监测大鼠直肠温度，并用红外照射灯和实验保温板保持直肠温度在36.5～37.5℃。 

4.1神经功能评分 

大鼠脑缺血2小时、再灌注22小时后，参照Longa方法采用双盲发对大鼠进行5分制神经行为学评分：肢体活动正常为0分；不能完全伸展右前肢为1分；身体向右侧旋转为2分；行走时向右侧倾倒为3分；无自主行走并伴有意识抑制为4分，结果见表16。 

表16鼻用原位凝胶对大鼠脑缺血损伤后神经功能评分的影响

注：与模型组比较^**P<0.01，^*P<0.05。 

由上表结果可见，模型组大鼠的神经功能评分为2.87±0.25，与假手术组比较有极显著性差异，说明造模后大鼠表现出明显的神经功能损伤现象，造模成功。经给药治疗后，可见，凝胶制剂鼻腔给药组神经功能评分为2.58±0.29分，与模型组神经功能有所改善，说明栀子环烯醚萜苷鼻用原位凝胶经鼻腔给药后对线栓法造成的大鼠脑缺血损伤致神经功能损伤具有一定的防治作用。 

4.2脑组织含水量 

术后24小时神经行为学评分后处死大鼠，取大脑组织称湿重，105℃烤箱中烘烤至恒重后称取干脑，脑组织含水量(%)=(湿重-干重)÷湿重×100%。结果见表17。 

表17凝胶剂经鼻给药对脑缺血损伤大鼠脑组织含水量的影响

注：*p<0.05给药组与模型组之间存在着差异；**P<0.01给药组与模型组之间存在着显著性差异；△P<0.05各组与假手术组之间存在着显著性差异，△△P<0.01各组与假手术组之间存在着极显著性差异。 

模型组含水量增加了12.96%，说明造模成功；与模型组比较，栀子凝胶制剂鼻腔给药组明显降低，说明栀子有效部位制成鼻用原位凝胶后经鼻腔给药对脑缺血损伤具有保护作用。鼻腔给药组中，鼻腔高剂量给药脑组织含水量与模型组有显著性差异（P<0.05），但是凝胶低剂量组仅只有趋势，无显著性差异（P>0.05）。 

4.3脑梗死面积的测定 

缺血24h后，立即断头处死大鼠，剪开颅骨取出大脑用4E的生理盐水冲洗后，置于-20℃低温冰箱中快速冷冻15分钟后。由前向后每隔2mm切取组织片若干片，置于2％的TTC生理盐水溶液中保持37℃孵育约30分钟，TTC被线粒体内过氧化氢酶还原，可见脑片中皮质梗死区不染色而呈现白色，所有未受损脑组织呈红色。先用photoshop软件处理图片，再用osiris4软件算面积。染色效果如图4-6。 

由图5可以看出模型组缺血后脑部缺血部位明显显白色，与假手术组之间存在着显著的差异。鼻腔给药组梗死面积发生明显改变，梗死区与非缺血区轮廓模糊，显示鼻腔给药后对梗死面积发生显著改变。 

表18各实验动物组的脑梗死面积测定结果 

注：*p<0.05给药组与模型组之间存在着差异；**P<0.01给药组与模型组之间存在着显著性差 

鼻腔低剂量组脑梗死面积与模型组无显著性差异（P>0.05），但是鼻腔中剂量组、鼻腔高剂量组脑梗死面积相比模型组有所减小，且差异明显（P<0.05），显示鼻腔给药对大鼠脑梗死有改善作用。 

4.4HE染色 

动物深度麻醉后，生理盐水和40g/L的多聚甲醛固定液灌注固定，200g/L蔗糖保存沉底过夜，视交叉后2mm始冰冻切片机作10-15μm柳切片。切片先贴于已挂有100g/L明胶的玻片上，自然干燥后，常规HE染色。步骤如下:二甲苯3min×2→无水乙醇lmin→95%乙醇lmin→85%乙醇lmin→75%乙醇lmin→自来水洗2min→Harris苏木素液5min→自来水洗lmin→75%盐酸乙醇分化30S，自来水洗→蒸馏水lmin→95%乙醇lmin→酸化伊红乙醇液l-2min→→常规脱水、透明和封片。 

结果可看出，脑组织形态学观察光镜下假手术组神经细胞、血管等未见损害性改变；模型组缺血中心区可见神经细胞坏死征象，表现为细胞呈三角形或多角形，细胞固缩深染，核仁消失，细胞胞质浓缩、深染，呈嗜酸性改变，并呈现明显水肿样；凝胶制剂组细胞形态较模型组有所改善，但局部有点散在毛细血管外渗血，体现凝胶制剂组对缺血区神经元细胞具有保护作用。 

试验例2栀子环烯醚萜苷对永久性结扎双侧颈动脉实验大鼠的学习记忆能力的影响及相关机制分析 

采用双侧颈总动脉永久结扎模拟血管性痴呆（vascular dementia，VD）大鼠模型。通过Morris水迷宫、生化指标检测SOD、MDA、NOS、AchE、TNF-α、GPT、GOT含量以及脑皮层及海马相关部位HE染色形态学检测的实验方法，观察栀子有效部位对VD的作用。从 而分析栀子凝胶制剂对血管性痴呆大鼠学习记忆障碍的保护作用并分析其可能其作用机制。 

1实验材料 

1.1实验动物选用2月龄雄性清洁级SD大鼠60只，体重为250±20g，由成都中医药大学实验动物中心提供（生产许可证号：2005-0001）。 

1.2药品与试剂栀子环烯醚萜苷提取物（又称为栀子有效部位，实施例1中方法制备）；10％水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司，批号：20100108，使用时按重量比10%用注射用水配制）。SOD试剂盒，MDA试剂盒，NOS试剂盒，谷氨酸试剂盒，乙酰胆碱酯酶试剂盒，GPT试剂盒，GOT试剂盒均由南京建成生物制品有限公司提供，批号为20100629。双抗体夹心酶联吸附反应TNF-α试剂盒（批号：20100521）由武汉优尔森科试剂公司提供。苏木精和伊红染料，由成都中医药大学病理实验室提供。 

1.3仪器Morris水迷宫，由成都中医药大学药理学科组行为学室提供；Morris图象采集分析器(中国医科院药物所研制)：SIGMA3-18K型高速冷冻离心机（厦门精艺兴业科技有限公司）；722可见分光光度计（上海欣茂仪器有限公司）；恒温水浴箱（常州国华电器有限公司）。 

2试验室条件室温16～29℃，相对湿度50%～80% 

3统计学处理用SPSS11.5软件包进行数据处理，数据用均数±标准差

，组间用t检验或F检验。 

4.方法 

4.1模型建立 

4.1.1动物筛选在实验前采用Morris水迷宫实验法对动物进行筛选。选择逃避潜伏期约在120s大鼠作为实验对象，弃用灵活性过差，或逃避潜伏期过低（<40s），视力障碍的大鼠。 

4.1.2血管性痴呆模型建立依据文献采用双侧颈总动脉(CCA)永久性结扎模拟血管性痴呆。大鼠术前禁食12h、禁水4h。用10％水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉。待麻醉充分后，仰卧位固定，颈前部稍微减去毛发、消毒后，沿颈正中切开皮肤、肌肉，分离出CCA，套以0号丝线，此时不急于结扎，待分别分离出双侧颈总动脉并套好丝线后，同时结扎双侧颈总动脉的远近端，并从中间剪断，确保阻断动脉血流。术中大鼠体温保持在36.5+0.5℃，以防止低温对脑缺血保护作用。控制麻醉深度、体温是模型建立成功的关键。手术后，动物送至有通风和空调设各动物房饲养，保持室温在20℃左右。术后用肌注青霉素注射液，连续3d。 

4.1.3动物行为指标评分：于术后24h进行行为评分。标准如下：提尾离开地面约30cm，左前肢表现为腕弯曲、肘屈曲、肩内旋或兼而有之者，计1～4分；将动物置于光滑平面上，轻推肩部使其向对侧移动，检查阻力情况，降低者根据程度不同计1—3分；根据左前肢肌张力下降程度差异，计1～3分；动物有向一侧不停转圈现象计1分。满分为11 分，分数越高，动物的行为障碍越严重。大鼠行双侧颈总动脉结扎2wk后，大部分动物自发活动减少，由于手术初期大脑短时间供血不足，体内代偿功能还未启动，前三天死亡率最高。随着缺血时间延长，死亡率有所下降，总体死亡率为36％，假手术组(对照组)大鼠术后无异常表现，死亡率为0。 

4.2动物分组及给药选择模型建立成功的动物，假手术组实验操作与模型组大体同，但仅分离双侧CCA但不结扎。随机选择实验大鼠，每组14只，设凝胶鼻腔给药组（凝胶剂由本发明实施例1制备）、阳性药（盐酸多奈派齐）组、假手术组、模型组，手术过程中若出现死亡则补足数量。各给药组连续给药30d，为使给药剂量尽量准确，给药前用乙醚将大鼠浅麻，在短暂麻醉间期滴鼻给药。其中模型组给药前也用乙醚浅麻每次给等体积生理盐水。 

4.3行为学测试采用Morris水迷宫实验方法测试大鼠的学习记忆能力。Morris水迷宫的装置由一不锈钢圆形水池通过摄像机与电脑连接所组成。圆形不锈钢直径为120cm、深60cm，实验时水深约40cm，池壁与池底用黑色涂料涂成完全黑色，连接处也要完全涂黑不留下任何其他颜色的痕迹。水池分为四个象限，在其中一象限处放一平台，平台也完全涂成黑色，平台低于水面1.5cm，动物可以爬上平台休息。每次将大鼠面向池壁放入水中，依次选择从东、南、西、北4个象限其中的一个作为入水点，摄像机记录大鼠游泳的轨迹，并通过图象处理软件进行数据采集和分析，进行定位航行实验和空间探索实验，共历时6天。 

4.3.1定位航行实验(place navigation)历时5天，前4天为训练时间，每天训练4次，每次120S，第5天，正式实验。将大鼠寻找并爬上平台所需时间作为逃避潜伏期(escape latency)。如果动物在120s内未找到平台，实验者将其引到平台，逃避潜伏期定为120S。每次实验中大鼠在平台上停留20S。在第5天，选取离平台最远象限作为入水点，此时大鼠的逃避潜伏期作为评价大鼠学习记忆能力的指标。 

2.3.2空间探索实验(spatial probe)第6天撤除平台，选择离原平台最远的象限为大鼠入水点。记录60s内大鼠在池中的游泳轨迹，分析各组大鼠在平台象限的游泳路径，并将各组大鼠的游泳轨迹作为评价大鼠学习记忆能力的指标。 

4.4组织形态学实验 

Morris水迷宫实验结束后，每组随机选取2只大鼠，10％水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉。用0.9％的生理盐水和4％多聚甲醛的磷酸盐缓冲液，灌注固定，逐级酒精脱水、透明、浸蜡、包埋，进行常规石蜡包埋切片，厚3μm，苏木精和伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色，低倍镜(10×10)确定海马区位置，高倍镜(10×40)观察海马CA1区锥体层细胞的形态，在连有电子拍照工具的显微镜下拍照。 

4.5标本采集 

4.5.1血清采集：大鼠10％水合氯醛麻醉（350mg/kg）后，心脏取血，将血液保存于1.5mlEP管中，直立放置于4℃冰箱内2小时，待血液完全凝固后，3000rpm，4℃离心15min， 分离得到血清，将血清分成4份转移到0.5mL有盖EP管中，-80℃冰箱保存待测。 

2.5.2脑组织：心脏取血后，用灌注针（已经连接好生理盐水）在原采血处的针孔处进入心脏，深入至主动脉弓，用止血钳夹住灌注针和心尖处，防止灌注针脱落。用生理盐水灌注至右心耳充盈时，剪开右心耳，继续用生理盐水灌注至右心耳留出的液体呈无色为止。迅速取脑，除去小脑和嗅球以及低位脑干，立即称重，并以l：9的比例加入冰生理盐水，用微型匀浆器充分研磨制成10％匀浆，离心取上清。每组留3只大鼠在生理盐水灌注后改用40g/L的多聚甲醛固定液灌注固定，待灌注200-300ml至四肢僵直抽搐，迅速取脑。在冰盘上迅速剥离小脑与嗅区部位和低位脑干。取出的脑组织保存在40g/L的多聚甲醛溶液中，写好标签4℃保存。 

4.6试剂盒测定严格按照说明书步骤进行 

4.7统计分析各组数据以均值土标准差

表示，采用SPSS11.5软件包进行方差分析的单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。 

5.结果 

5.1栀子有效部位增强VD大鼠学习记忆能力 

5.1.1Morris水迷宫实验如表19所示，假手术组大鼠逃避潜伏期为65.14±45.53(n=14)，模型组大鼠逃避潜伏期为94.19±37.16(n=16)。栀子有效部位组大鼠逃避潜伏期则较模型组明显缩短，为89.93±41.99(n=11，P>0.05)无显著性差异，说明其对脑缺血导致的行为学改善作用不甚明显。 

表19.各动物实验组的行为学结果

注：与模型组比，*P<0.05**P<0.01 

5.1.2空间探索实验撤除平台后，模型组大鼠的游泳轨迹均匀的分散在四个象限，相反假手术组和栀子有效部位组的大鼠运动轨迹主要集中在原平台象限，显示出良好的记忆改善趋势。 

5.2栀子有效部位改善VD大鼠海马CAl区病理改变 

如图10所示，HE染色观察到模型组大鼠海马CAI区表现出明显的缺血性病理改变，锥体层细胞出现细胞水肿、核固缩和细胞呈无秩序排列。如下图10所示，假手术组和鼻腔给药组大鼠海马CAl区组织结构完整，神经元排列整齐、规则。 

病理形态学检测显示与模型组相比，凝胶制剂鼻腔给药治疗组大鼠皮层及海马神经元的凋亡坏死明显减轻。由此可以推测凝胶制剂鼻腔给药对双侧颈总动脉结扎所致的慢性低 灌注脑缺血模型大鼠的脑神经元有保护作用。 

表20各区坏死细胞占总细胞数比例比较

注：与模型组比，*P<0.05**P<0.01 

各组每张切片分别选取CA1区、大脑皮质外颗粒层、内锥体层以及扣带回区4个部位，分别在同一区域中，随机选取5个视野在40倍物镜下拍摄照片，读取细胞总数和病态细胞数。各组分别采集6组数据取其细胞总数和病态细胞数平均值，最后得出各组病态细胞百分比，数据以均值±标准差表示，使用SPSS13.0统计软件，采用单因素方差分析。统计结果显示：与模型组比较，各组间有极显著性差异（P<0.01）。各区病态细胞百分比口服溶液治疗组<安理申治疗组<凝胶制剂组<模型组（P<0.01）。5.3栀子有效部位对VD大鼠脑组织相关生化指标的含量的影响 

表21.各动物实验组的乙酰胆碱酯酶含量测定结果

注：与模型组比，*P<0.05**P<0.01 

表22.各动物实验组的NOS含量测定结果

注：与模型组比，*P<0.05**P<0.01 

表23.各动物实验组的肿瘤坏死因子（TNF-α）含量测定结果

注：与模型组比，*P<0.05**P<0.01 

表24.各动物实验组的MDA、SOD的含量测定结果

注：与模型组比，*P<0.05**P<0.01 

5.3.1与假手术相比，模型组在乙酰胆碱酯酶含量，一氧化氮合酶以及肿瘤坏死因子等指标方面具有明显差异（P<0.05），SOD,MDA含量也有较明显差异趋势。说明采用久性结扎大鼠双侧颈总动脉法制备慢性低灌注血管性痴呆动物模型的方法是成功的，可以用于评价血管性痴呆的相关指标。 

与模型组相比，口服中剂量组与安理申组具有极显著性差异（P<0.01），说明栀子有效部位口服给药能够显著降低乙酰胆碱酯酶活性，从而间接提高神经元突触之间的乙酰胆碱含量，从而可改善大鼠的学习及记忆能力。口服中剂量组的乙酰胆碱酯酶活性较安理申组略高，但大体效果与安理申相似。然而鼻腔给药组的AchE含量则与模型组等同，说明鼻腔给药对模型大鼠脑内的乙酰胆碱酯酶含量无影响。 

Claims (10)

1.一种鼻腔用离子敏感型原位凝胶剂，其特征在于：它含有栀子环烯醚萜提取物0.03～0.06g/ml、离子敏感型凝胶材料0.002～0.01g/ml、防腐剂0.002～0.01g/ml、渗透压调节剂0.03～0.05g/ml、pH调节剂，余量为水；pH调节剂调节凝胶剂pH至5～9。

2.根据权利要求1所述的鼻用离子敏感型原位凝胶剂，其特征在于：栀子环烯醚萜提取物含量为0.04g/ml、离子敏感型凝胶材料含量为0.002～0.003g/ml，pH调节剂调节凝胶剂pH至7.0±0.2。

3.根据权利要求1或2所述的鼻用离子敏感型原位凝胶剂，其特征在于：防腐剂含量为0.002g/ml、渗透压调节剂含量为0.03g/ml。

4.根据权利要求1所述的鼻用离子敏感型原位凝胶剂，其特征在于：所述离子敏感型凝胶材料选自结冷胶、去乙酰结冷胶或海藻酸盐；所述防腐剂选自尼泊金酯、苯甲醇、苯酚、间甲酚、苯扎溴铵或苯扎氯铵；所述渗透压调节剂选自甘露醇、山梨醇或葡萄糖；所述pH调节剂选自三羟甲基氨基甲烷。

5.根据权利要求4所述的鼻用离子敏感型原位凝胶剂，其特征在于：所述尼泊金酯为尼泊金甲酯或尼泊金乙酯。

6.根据权利要求1所述的鼻用离子敏感型原位凝胶剂，其特征在于：所述栀子环烯醚萜提取物中，以干燥品计算，栀子总环烯醚萜苷含量为70%～80%，栀子苷含量为25～35%。

7.根据权利要求1或6所述的鼻用离子敏感型原位凝胶剂，其特征在于：所述栀子环烯醚萜提取物由如下方法制备：

取栀子药材，粉碎，加水煎煮，合并煎煮液，浓缩；加入乙醇至含醇量50%以上，静置醇沉，滤过，滤液回收乙醇，浓缩，经D101大孔吸附树脂柱吸附，先用水洗至无色，再用50～70%v/v乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩液干燥，即得。

8.根据权利要求1所述的鼻用离子敏感型原位凝胶剂，其特征在于：所述制剂为喷雾剂。

9.权利要求1～8任意一项所述鼻用离子敏感型原位凝胶剂的制备方法，其特征在于:它包括如下操作步骤：

（1）取栀子环烯醚萜提取物，以总加水量30～50%的水溶解；

（2）取离子敏感型凝胶材料、渗透压调节剂和防腐剂，加入余量水，加热溶解，搅拌下，与步骤（1）所得溶液混匀，加入pH调节剂调节凝胶剂pH至5～9，过滤，灌装，即得。

10.权利要求1～8任意一项所述鼻用离子敏感型原位凝胶剂在制备抗脑缺血损伤、保护脑神经或改善学习记忆能力的药物中的用途。

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