CN102389434A - 一种治疗缺血性脑血管病的药物组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含有机有效成分的医药配制品，具体涉及一种治疗缺血性脑血管病的药物组合物，该药物组合物由活性成分和医学上可接受的辅料组成，其特征在于，所述的活性成分由以下重量份的有机成分组成，环维黄杨星D5～10，川芎嗪30～50，冰片2～5。本发明所述的药物组合物将环维黄杨星D与川芎嗪相伍，具有明显的协同增效作用，再使以冰片改变其药动学行为，显著提高了其生物利用度，更有利于发挥药物的治疗作用。

Description

一种治疗缺血性脑血管病的药物组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种医用配置品，具体涉及一种含有机有效成分的医药配制品。

背景技术

脑血管病已成为当前严重危害人类，特别是中老年人生命和健康的重症疾病之一。我国每年患病人数为500～600万，死亡人数约为150万。存活的患病人群中约75％的病人可遗留不同程度的残疾，严重致残者高达40％，给众多的家庭以及社会、国家带来了巨大的经济和精神负担。随着我国人口老龄化，脑血管病呈逐年上升的趋势。目前，在国内的各种疾病死因的排列顺序中，脑血管病高于心脏病和癌症，居三大死因之首。

我国脑血管病的发病以缺血性脑血管病为主(包括短暂性脑缺血发作、脑梗死)。缺血性脑血管病是指局部脑组织包括神经细胞、胶质细胞及联系纤维由于供血障碍发生的变性、坏死或一过性功能丧失。引起缺血性脑血管病的根本原因是局部血液循环障碍导致所提供的氧及营养物质如葡萄糖等不能满足神经元的代谢需求。

目前对缺血性脑血管病尚缺乏十分有效的治疗方法，临床上主要应用溶栓、抗凝、降纤、抑制血小板、脑保护等几大类药物，以上治疗药物具有作用单一，用药时间受限等缺点。唯一得到FDA批准的重组组织型微纤溶酶原激活剂(rt-PA)由于价格昂贵，无法解决出血副作用等原因，不能在临床上广泛应用。

缺血性脑血管病属中医“中风”范畴，血脉瘀阻，蒙蔽清窍是其发病的重要机制，临床实践已经证明活血化瘀，芳香开窍药物疗效确切，效果明显。

环维黄杨星D(Cyclovirobuxine D，CVB-D)为《中国药典》2000年版一部收载的品种，系从黄杨科植物中国小叶黄杨及其同属植物中提取而得到的生物碱类单体化合物(结构式如下式I所示)，分子量为402.364，熔点219～222℃，为无色针状结晶，在氯仿中易溶，在甲醇或乙醇中溶解，口服日剂量在5mg以内。药理实验研究表明，环维黄杨星D对实验性脑缺血具有保护作用，如环维黄杨星D能降低局灶性脑缺血再灌注模型大鼠神经行为学评分、脑梗塞率、脑指数、脑含水量，抑制Na₂S₂O₄造成的PC12细胞缺氧样损伤，降低LDH的漏出，增加细胞存活率；环维黄杨星D可上调实验性脑缺血再灌注大鼠脑GAP-43mRNA的表达，起到保护作用等。目前已上市的环维黄杨星D制剂有胶囊、软胶囊、舌下片、缓释片、口腔速崩片、分散片、控释片(渗透泵片)、注射剂等，主要用于心脑血管系统疾病的治疗。

川芎嗪(4-甲基吡嗪，Tetramethylpyrazine，TMP，结构如下式II所示)是从伞形科植物川芎中提取的一种酰胺类生物碱单体，目前可由人工合成制备。川芎嗪分子量为136.20，无色针状结晶，熔点80～82℃，沸点190℃。具特殊异臭，有吸湿性，易升华，易溶于热水、石油醚，溶于氯仿、稀盐酸，微溶于乙醚，不溶于冷水。大量药理实验研究表明，川芎嗪对心脑血管系统具有保护作用，如能显著改善脑梗塞大鼠异常神经症状和抑制ALP活性的下降，减轻脑梗组织的重量；显著降低小鼠缺血脑组织一氧化氮和丙二醛含量；显著抑制ADP致血小板的聚集等。目前已上市的川芎嗪制剂有川芎嗪片、川芎嗪胶囊、川芎嗪注射液等，主要用于心脑血管系统疾病的治疗。

综合以上所述，环维黄杨星D和川芎嗪均具有治疗心脑血管系统疾病的作用，但是单独使用的效果尚不够理想。

发明内容

鉴于现有技术存在上述不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种用于治疗缺血性脑血管病的含有机有效成分的组合物，该组合物中有机有效成分具有明显的协同增效作用。

本发明解决上述问题的技术方案为：

一种治疗缺血性脑血管病的药物组合物，该药物组合物由活性成分和医学上可接受的辅料组成，其特征在于，所述的活性成分由以下重量份的有机成分组成：环维黄杨星D 5～10，川芎嗪30～50，冰片2～5。

上述方案中，所述的有机成分的最佳重量份配比为：环维黄杨星D 7.5，川芎嗪40，冰片3.5。

本发明所述的组合物，其中，所述的缺血性脑血管病是脑中风、短暂性脑缺血发作、脑梗死等；所述的有机成分环维黄杨星D、川芎嗪和冰片都是公知的化合物，它们可通过化学合成的方法得到，也可以按公知的方法从相应的中药原料中分离得到。

本方明所述的组合物可是常见的鼻腔喷雾剂、口服制剂、注射剂或贴剂，优选鼻腔喷雾剂。其中所述鼻腔喷雾剂的制备方法由以下步骤组成：

(1)取冰片用适量的乙醇溶解，得冰片乙醇溶液备用；按冰片∶羟丙基-β-环糊精＝4∶0.3的比例取羟丙基-β-环糊精加入3倍蒸馏水研匀，滴加所制得的冰片乙醇溶液，室温研磨包合1.5小时，溶液冷藏24小时，乙酸乙酯洗涤3次后，G5垂熔漏斗滤过，滤液真空干燥，制得冰片HP-β-环糊精包合物；

(2)将环维黄杨星D和川芎嗪溶解于蒸馏水中，然后依次加入步骤(1)所制得的冰片HP-β-环糊精包合物和助剂，充分混匀，调节pH值为5.2～5.8，补充蒸馏水，使所述活性成分的质量浓度为3.7％～6.5％，使所述助剂的质量浓度为0.01％～3.22％，灌装入鼻腔喷雾器即得；所述的助剂为防腐剂，或者是防腐剂与位凝胶基质或/和增黏剂的混合物，其中，

所述的防腐剂为尼泊金乙酯、羟基苯甲酸乙酯或山梨酸钾；

所述的原位凝胶基质为卡波姆、泊洛沙姆188或去乙酰结冷胶；

所述的增黏剂为羟丙基甲基纤维素、泊洛沙姆407或羧甲基纤维素钠。

本发明所述的药物组合物将环维黄杨星D与川芎嗪相伍具有明显的协同增效作用，再使以冰片改变其药动学行为，显著提高了其生物利用度，更有利于发挥药物的治疗作用。因此，将环维黄杨星D、川芎嗪、冰片按一定配伍比例组成中药有效成分复方，既具有有效成分制剂成分明确、质量可控的优点，又能体现传统方剂君臣佐使的配伍优势，更好地发挥药物的治疗作用。

为了便于公众更好地理解本发明的本质，下面用实验及结果来说明本发明所述药物组合物的有益效果。

一、不同活性成分的药效比较

采用大脑中动脉阻断(middle cere-bral artery occlusion，MCAO)建立大鼠急性脑缺血模型，观察不同配伍比例有效成分组方对模型大鼠鼠行为学评分、脑梗塞指数、脑重指数的影响。各有效成分组方配伍比例依据各单一成分临床用药剂量及本发明前期研究结果而设定。

1、实验动物：Wistar大鼠80只，雌雄不拘，体重(300±20)g，广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：SKXK粤2008-0020，粤监证字2008A002。

2、实验样品及制备

(1)样品

样品1：为下述实施例1所制得的鼻腔喷雾剂；

样品2：为下述实施例2所制得的鼻腔喷雾剂；

样品3：为下述实施例3所制得的鼻腔喷雾剂。

(2)对照品

对照品1：环维黄杨星D 75mg  川芎嗪400mg  尼泊金乙酯1mg  三乙醇胺适量  蒸馏水适量；

对照品2：环维黄杨星D 75mg  尼泊金乙酯适量1mg  三乙醇胺适量  蒸馏水适量；

对照品3：川芎嗪40mg  尼泊金乙酯适量1mg  三乙醇胺适量  蒸馏水适量。

对照品1-3的制备方法：将环维黄杨星D和(或)川芎嗪溶解于适量蒸馏水中，再加入尼泊金乙酯，三乙醇胺调节pH值至5.5左右，加蒸馏水至10ml即得。

3、实验方法

(1)分组与给药方法：将大鼠随机分为8组，每组10只，分别为伪手术组、模型组、样品组I-III、对照组I-III。用平头注射器伸入大鼠鼻腔5mm处滴鼻方式给予相应药物，样品组I-III对应给予样品1-3，对照组I-III对应给予对照品1-3，给药剂量为0.1ml/100g，伪手术组和模型组给予蒸馏水，连续给药5天。

(2)造模方法：参照文献法，采用线栓法制备MCAO模型。末次给药后2h，大鼠腹腔注射3％戊巴比妥钠溶液(1mg/mg^-1)麻醉，仰卧固定，颈部正中切口，分离右颈总动脉及颈内、颈外动脉。在距颈动脉分叉5mm处，双线结扎颈外动脉，颈内动脉穿线备用，结扎右颈总动脉的近心端。在靠近动脉分叉的颈总动脉壁上剪一小口，插人一直径为0.20mm的尼龙渔线(渔线头端经硅酮及多聚赖氨酸处理)，经颈内动脉进人大脑中动脉起始部，以阻断大脑中动脉的血流。插入线长约17～20mm时，有明显阻力感。结扎颈内动脉及尼龙线，防止插线脱落。假手术组除不插人尼龙线外其他手术步骤同手术组。造模成功后的大鼠按上述给药方法给予相应药物1次(将造模中死亡大鼠舍弃)。

4、指标检测方法

(1)神经功能缺损评分：大鼠清醒后，观察其行为学改变，神经症状评分标准为无神经损伤症状，0分；不能完全伸展左侧前爪，1分；向左侧转圈，2分；行走时向左侧倾倒，3分；不能自发行走或意识昏迷，4分。

(2)脑梗塞指数及脑指数测定：大鼠行为学评分后称取体重，断头处死，取脑(切除小脑、嗅球和低位脑干)称重。将大脑置于-20℃低温冰箱中冻存10min，然后平均冠状切成5片，每片约厚1～2mm，置于2％氯化三苯基四氮唑磷酸缓冲液(pH 7.4)中，37℃恒温水浴中孵育20min，取出后用甲醛固定。正常脑组织染成红色，凡未红染部分为缺血区，将其用小刀剔出，称重。按以下公式计算脑梗塞指数及脑指数：

脑梗塞指数＝梗塞灶湿重(g)/脑湿重(g)×100％

脑指数＝脑湿重(g)/体重(g)×100％

5、统计学处理

数据均以均数±标准差

表示,多样本均数的比较用方差分析，样本间的两两比较用q检验。

6、结果

(1)对大鼠神经系统损伤程度影响：结果见表1。根据评分结果可见，模型组与假手术组相比，差异具有显著性(P＜0.01)，表明急性脑缺血造模成功。各给药组大鼠神经系统损伤程度明显减轻，与模型组相比，有显著性差异(P＜0.01)。样品组I和样品组II治疗效果优于对照组II和对照组III(P＜0.05或P＜0.01)，表明全方有效成分间存在协同增效作用，样品组和三个对照组相比，亦表现出协同增效趋势，但未有明显差别(P＞0.05)。

表1对大鼠神经系统损伤程度的影响

(注：与假手术组相比，^△△P＜0.01，与模型组相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01；与对照组II相比，^★P＜0.05，^★★P＜0.01；与对照组III相比，^※P＜0.05，^※※P＜0.01。)

(2)对大鼠脑梗塞指数及脑指数的影响：结果见表2。结果表明，各给药组均能使脑梗塞指数明显减小(P＜0.05或P＜0.01)，样品组II明显优于对照组II和对照组III(P＜0.01)，样品组I明显优于对照组II(P＜0.05)，对照组I与对照组II和对照组III相比，也表现出一定增强趋势。

脑指数在一定程度上能反映脑水肿的程度。与假手术组相比，模型组脑指数显著升高(P＜0.01)，说明急性脑缺血时脑水肿明显。环维黄杨星D与川芎嗪配伍组可明显降低脑指数(P＜0.05)，其它药物治疗组具有降低趋势。样品组I和样品组II优于对照组II和对照组III。

表2对大鼠脑梗塞指数及脑指数的影响

(注：与假手术组相比，^△△P＜0.01，与模型组相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01；与对照组II组相比，^★P＜0.05，^★★P＜0.01；与对照组III相比，^※P＜0.05，^※※P＜0.01。)

二、喷雾剂鼻腔给药的大鼠脑部药动学研究

1、方法

(1)色谱条件环维黄杨星D：色谱柱Phenomenex Hyperclone BDS C18(250×4.00mm，5μm)，美国菲罗门公司；流动相：甲醇∶水＝85∶15；流速：1.0mL/min；波长：240nm；柱温：室温；进样量：10μL；理论塔板数按CVB-D峰计算不得低于3000。磷酸川芎嗪：色谱柱：Phenomenex Hyperclone BDS C18(250×4.00mm，5μm)，美国菲罗门公司；流动相：甲醇∶水＝3∶2(V/V)；流速：1mL/min；检测波长：295nm；柱温：室温；进样量：10μL。

(2)实验样品及制备：实验样品及制备同实验一中样品2、对照品2和对照品3。

(3)实验方法：大鼠麻醉后固定于脑部立体定位仪上，剪去顶部皮毛，消毒皮肤后沿中线右侧切开头皮分离骨膜显露头骨，以前囟为原点，在立体定位仪上定位纹状体区(AP：+0.2mm，ML：±3.2mm，DV：-7.0mm)，用颅钻钻一直径为1.2mm小孔，将脑探针植入脑内。脑探针植入大鼠脑内后，以1μL/min的速度灌流人工脑脊液1h，收集15min的透析液作为空白液。然后大鼠鼻腔给药，给药方法同实验一。同时定时收集透析液。川芎嗪取样间隔为前4h为10min，后1h为20min。连续取样5h后继续用灌流液灌注，直到透析液中检测不到TMPP为止(大约2h)，样品直接进行分析测定。环维黄杨星D取样间隔为10min，连续取样，直到480min后，样品按专属性实验中样品溶液制备方法处理。

2、结果

环维黄杨星D与川芎嗪均可经鼻腔给药后进入脑内；冰片能够促进二者的鼻粘膜吸收，提高药物经鼻腔吸收入脑的速度，增加脑组织中药物的浓度；本发明制剂经鼻腔给药后，5min川芎嗪即可进入脑内，10min左右即可达到峰浓度，2h基本消除，而环维黄杨星D则在近20min左右进入脑内，4h达到峰浓度并在体内滞留较长时间；冰片经羟丙基-β-环糊精包合冰片后，可以增加冰片的溶解度和稳定性，促进药物的鼻粘膜吸收，增加药液黏度，使其不易流失

三、冰片β-环糊精包合物的效果实验

1、方法

(1)采用饱和水溶液法和研磨法制备冰片β-环糊精包合物，以包合率为指标，应用正交实验设计考察了投料比、温度、时间对包合率的影响。结果表明，采用饱和溶液法制备包合物时，β-环糊精用量少，包合时间较短，且收得率和包合率均较高，故认为饱和溶液法较优。饱和溶液法制备冰片β-环糊精包合物优选方法是，取冰片∶β-环糊精(6∶1)，60℃包合时间为1.5h，溶液冷藏24h，抽滤，包结物分别用水和乙酸乙酯各洗涤3次后真空干燥，即得。

(2)采用研磨法制备冰片HPβ-环糊精包合物，单因素考察了投料比、包合时间对包合率的影响，确定了冰片HP β-环糊精包合物制备方法，投料比(冰片∶HP-β-环糊精)4∶0.3称取，环糊精加入3倍水研匀，滴加冰片乙醇溶液，室温研磨1.5h，溶液冷藏24h，乙酸乙酯洗涤3次后，G5垂熔漏斗滤过，滤液真空干燥，即得。

2、结果：按上述制备方法分别制备冰片β-环糊精包合物和冰片HPβ-环糊精包合物，采用薄层色谱法和相溶解度法对包合物进行验证。

(1)薄层色谱法：取β-CD包合物、HP-β-CD包合物各20mg，加适量乙醚分3次洗涤，合并洗涤液，离心10min(3000r·min^-1)，取上清液挥去乙醚，残渣加无水乙醇1mL使溶解，分别制成作为包合物乙醚洗涤液。取洗涤后的包合物各加无水乙醇10mL，超声处理15min，离心10min(3000r·min^-1)，取上清液为包合物提取液。另取冰片对照品加无水乙醇制成1mL·mg-1的溶液最为对照品溶液。吸取上述3种溶液各4μL，分别点于同一硅胶G板上，以正己烷∶乙酸乙酯(8∶2)为展开剂展开，取出，晾干，喷以5％香草醛浓硫酸试液，105℃加热至斑点清晰。日光下检视，冰片包合物乙醚洗涤液无斑点，冰片包合物乙醇提取液和冰片对照品溶液斑点完全一致，说明包合物确已形成，且包合前后主成分没有发生变化。

(2)相溶解度法：精密称取冰片10mg，溶于适量无水乙醇中，分别加入浓度为2.5，5，10，15，20，30，40，50g·L¹的β-环糊精、羟丙基-β-环糊精溶液各10mL，于40℃磁力搅拌条件下搅拌1.5h，冷藏静置24h，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液0.2mL至1mL量瓶中，加内标0.2mL，无水乙醇定容，按已建立的条件测定冰片含量，以冰片含量对β-环糊精、羟丙基-β-环糊精含量做图，得到相溶解度曲线。结果，A表明随着β-环糊精含量的增加，冰片在水中的溶解度也增加，但在一个固定的比时，冰片的浓度达到最大水平。B表明随着HP-β-环糊精含量的增加，冰片在水中的量也增加；但当HP-β-环糊精含量足以包合全部投入的冰片时，增加HP-β-环糊精的量，冰片的含量不增加，说明冰片包合已经达到平衡。

对制备的环糊精包合物进行了稳定性考察，结果表明β-环糊精包合物和HPβ-环糊精包合物均能明显增加冰片的稳定性。外观比较表明，冰片HP-β-环糊精包合物溶液澄明，而冰片β-环糊精包合物溶液呈白色浑浊状，表明冰片用HP-β-环糊精包合后可以明显改善其溶解度。

以上实验结果表明，冰片采用表面活性剂增溶时，虽然增溶效果较好，但所需表面活性剂量大，鼻粘膜刺激较大，故不予采用。冰片用环糊精包合时不仅能增加溶解度，还能增加稳定性。HP-β-环糊精包合时溶液外观优于β-环糊精，且鼻粘膜毒性较小，因此本方明的中药有效成分组合物中，冰片采用HP-β-环糊精包合增溶。

四、喷雾剂鼻腔给药的药效学实验

本实验选择实验一中样品2为实验药品，对主要药效学、鼻粘膜纤毛毒性进行了研究，并初步考察了量效关系。

(1)对小鼠断头耐缺氧存活时间的影响

分别选定健康昆明小鼠50只，体重20g左右，雌雄各半，随机分为5组：生理盐水组、尼莫通组(10mg/kg/d)、本发明所述鼻腔喷雾剂高剂(即下述实施例2所制得的鼻腔喷雾剂)量组(30mg/kg/d)、中剂量组(15mg/kg/d)、低剂量组(5mg/kg/d)。尼莫通组腹腔注射给药，其他各组鼻腔给药，连续给药7日，末次给药半小时后，在小鼠耳后快速断头，记录小鼠张口喘气的时间。结果见表3。

表3小鼠断头耐缺氧试验结果(

n＝10)

(注：*表中P值是与阴性对照组的比较。)

结果表明，尼莫通组与本发明鼻腔喷雾剂大、中剂量组对小鼠断头耐缺氧时间均有明显延长作用(P＜0.01)，鼻腔喷雾剂小剂量组也有改善作用(P＜0.05)。

(2)对左大脑中动脉(LMCA)线栓法致局灶性脑缺血大鼠血清中白细胞介素(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的影响

Wistar大鼠48只，体重250g左右，雌雄各半，随机分为6组：假手术组、模型组、尼莫通组(10mg/kg/d)、本发明鼻腔喷雾剂高剂量组(30mg/kg/d)、中剂量组(15mg/kg/d)、低剂量组(5mg/kg/d)。采用左大脑中动脉(LMCA)线栓法致大鼠局灶性脑缺血模型。最后一次给药1h后，用10％水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉，仰卧定位固定，在颈正中(稍偏左)纵切2cm切口。切开皮肤，分离左劲总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)，在近颅底处分离颅外段唯一分支翼腭动脉，并将其起始部结扎；结扎ECA远端并用电凝笔切断，在ECA残端的起始部剪一约0.2mm的微切口，将一长约20mm、直径0.23～0.25mm的消毒钓鱼线由ECA残端切口插入，使之由ECA经LCCA分叉沿ICA入颅，插入18mm左右可遇阻力，提示已阻断MCA血液供应；结扎ECA残端切口，缝合皮肤。整个过程保持无菌操作，术中保持肛温在37～37.5℃，动物清醒后无右侧肢体瘫痪者弃之。在缺血60min时，各组将钓鱼线抽出，分别再灌注24h。假手术组不插入钓鱼线，其他步骤同模型组，术后将2mL生理盐水一次性腹腔注射，以补充术后和术中的体液丢失，并注意保持呼吸顺畅。尼莫通组腹腔注射给药，其他各组鼻腔给药，造模前5天及再灌注24h期间给药。再灌注24h后，腹主动脉取血每只取全血3～4mL注入试管中，在4℃条件下3000r/min离心10min，分离血清用反射免疫法测定。结果见表4。

表4对线栓法大鼠脑缺血IL-1β、TNF-α的影响(n＝8)

(注：表中＊是与假手术组的比较；△是与模型组的比较。)

结果表明，与假手术组比较，模型组大鼠血清IL-1β、TNF-α表达均明显升高(P＜0.05)；与模型组比较，尼莫通组、本发明鼻腔喷雾剂高、中、低剂量能有效抑制模型大鼠血清中IL-1β、TNF-α的升高，其机制为通过抑制炎症反应达到保护脑缺血损伤的效果。

(3)对左大脑中动脉(LMCA)线栓法致局灶性脑缺血大鼠脑梗死体积的影响

选定Wistar大鼠48只，体重250g左右，雌雄各半，随机分为6组(分组、给药方法同试验2)。各组大鼠于再灌注24h后，使用10％水合氯醛将动物麻醉，经左心室灌注约150mL生理盐水，立即断头，冰盘内逐层剥离颅骨、软脑膜及血管，暴露视神经、位听神经并剪断，去除小脑和脑干，自前向后进行2mm左右的冠状切片，置1％的TTC磷酸盐缓冲液中，37℃避光孵育10～15min，观察脑梗死灶成色状况。置40g/L多聚甲醛溶液中固定，照相。血液供应正常的组织经TTC染成红色，缺血或梗死组织为白色。将TTC染色照片扫描并存储，用图像采集与分析系统(Image-Pro Plus 6.0，Media Cybernetics)测定梗死体积。结果见表5。

梗死体积(％)＝(直接梗死体积/全部脑片体积)×100％

直接梗死体积＝各个脑片前后两面梗死面积均值×片厚的总和

全部脑片体积＝各个脑片前后两面面积均值×片厚的总和

表5对线栓法致大鼠脑缺血脑梗死体积的影响(

n＝8)

TTC染色结果表明，假手术组脑组织为红色，未见苍白的梗死灶。模型组左侧半球大部分脑组织为明显苍白梗死灶，梗死区涉及额叶、顶叶、颞叶及尾壳核等结构，右侧为红色；与假手术组比较各组缺血体积比例明显增高(P＜0.01)，与模型组比较，尼莫通组、本发明高、中、低剂量组均可减少缺血体积(P＜0.05)。尼莫通组与本发明制剂组比较两者无显著性差异(P＞0.05)。本发明制剂高、中、低剂量组比较亦有差异(P＜0.05)，表现为随着剂量增大，梗死体积变小，尤以高剂量组作用最为明显。

(4)对左大脑中动脉(LMCA)线栓法致局灶性脑缺血大鼠脑细胞形态的影响

Wistar大鼠48只，体重250g左右，雌雄各半，随机分为6组(分组、给药方法同试验2)。各组大鼠于再灌注24h后，使用10％水合氯醛将动物麻醉，4％多聚甲醛经左心室灌注固定，断头取脑，在大脑中动脉供应区，取下厚约0.6cm的冠状脑片，常规石蜡包埋、切片，用HE染色，光镜下观察细胞形态。

结果表明，假手术组神经细胞数目、体积正常，排列整齐，组织结构完整，形状规则，胞浆丰富，核仁清晰；模型组可见神经细胞体积变小，胞浆嗜酸性变，神经细胞核固缩，神经细胞坏死，并见少量中性粒细胞浸润，小胶质细胞轻度增生，形状欠规则；尼莫通组与本发明制剂高、中剂量组相似，可见神经细胞体积基本正常，小胶质细胞轻度增生，形状欠规则；本发明制剂低剂量组可见部分神经细胞体积变小，小胶质细胞轻度增生，形状欠规则。

(5)鼻粘膜纤毛毒性试验

取12只蟾蜍，随机分为四组：生理盐水对照组、去氧胆酸钠对照组、本发明鼻腔喷雾剂组(即下述实施例2所制得的鼻腔喷雾剂)、本发明辅料组。用探针刺破脊髓后，仰卧固定于蛙板上，使口腔张开，用止血钳牵拉，防止其闭合和吞咽。每组于上颚粘膜处滴加试验样品0.5mL，使浸没上颚粘膜，接触0.5h，用生理盐水将药物洗净。将蟾蜍断头后，迅速用锋利的眼科手术剪取3mm×3mm的上颚粘膜，生理盐水洗净血块及杂物等，粘膜纤毛面向上平铺于载玻片上，滴加生理盐水，盖上盖玻片，立即于10×40倍光学显微镜下观察纤毛的摆动情况。观察完毕，将载玻片搁置于加有少量水的层析缸中，20～25℃密闭使水蒸气近饱和，此后每隔适当时间取出观察，如纤毛持续运动则放回层析缸中，记录从开始观察至纤毛运动停止的时间(各试验样品均已调至等渗，pH6.5)，试验结果见表6。

表6对纤毛运动的影响

试验结果表明，生理盐水组粘膜面完整，无纤毛脱落，纤毛运动非常活跃，约12h后大部分纤毛停止运动；去氧胆酸钠给药后即可观察到粘膜充血严重，显微镜观察纤毛不完整，0.5h后未见有纤毛泳动，且出现明显的纤毛脱落现象；辅料组粘膜纤毛完整，纤毛运动活跃，与生理盐水组相仿，11h后局部仍有纤毛运动；本发明制剂组黏膜纤毛完整，纤毛运动活跃，与生理盐水组相仿，10h后局部仍有纤毛运动。

具体实施方式

实施例1：(鼻腔喷雾剂)

1、活性成分：环维黄杨星D 5g，川芎嗪30g，冰片2g。

2、制备方法：

(1)取冰片用适量的乙醇溶解，得冰片乙醇溶液备用；取羟丙基-β-环糊精0.15g加入3倍蒸馏水研匀，滴加所制得的冰片乙醇溶液，室温研磨包合1.5小时，溶液冷藏24小时，乙酸乙酯洗涤3次后，G5垂熔漏斗滤过，滤液真空干燥，制得冰片HP-β-环糊精包合物；

(2)将环维黄杨星D和川芎嗪溶解于蒸馏水中，然后依次加入步骤(1)所制得的冰片HP-β-环糊精包合物和尼泊金乙酯0.1g，充分混匀，加入三乙醇胺将调节pH值为5.2，补充蒸馏水至1000ml，灌装入鼻腔喷雾器即可。

实施例2：(鼻腔喷雾剂)

1、活性成分：环维黄杨星D 7.5g，川芎嗪40g，冰片3.5g。

2、制备方法：

(1)取冰片用适量的乙醇溶解，得冰片乙醇溶液备用；取羟丙基-β-环糊精0.25g加入3倍蒸馏水研匀，滴加所制得的冰片乙醇溶液，室温研磨包合1.5小时，溶液冷藏24小时，乙酸乙酯洗涤3次后，G5垂熔漏斗滤过，滤液真空干燥，制得冰片HP-β-环糊精包合物；

(2)将环维黄杨星D和川芎嗪溶解于蒸馏水中，然后依次加入步骤(1)所制得的冰片HP-β-环糊精包合物、卡波姆5g、羟丙基甲基纤维素14g和山梨酸钾0.2g，充分混匀，加入三乙醇胺将调节pH值为5.5，补充蒸馏水至1000ml，灌装入10ml的鼻腔喷雾器即可。

实施例3：(鼻腔喷雾剂)

1、活性成分：环维黄杨星D 10g，川芎嗪50g，冰片5g。

2、制备方法：

(1)取冰片用适量的乙醇溶解，得冰片乙醇溶液备用；取羟丙基-β-环糊精0.375g加入3倍蒸馏水研匀，滴加所制得的冰片乙醇溶液，室温研磨包合1.5小时，溶液冷藏24小时，乙酸乙酯洗涤3次后，G5垂熔漏斗滤过，滤液真空干燥，制得冰片HP-β-环糊精包合物；

(2)将环维黄杨星D和川芎嗪溶解于蒸馏水中，然后依次加入步骤(1)所制得的冰片HP-β-环糊精包合物、泊洛沙姆188 14g、泊洛沙姆407 18g和羟基苯甲酸乙酯0.5g，充分混匀，加入三乙醇胺将调节pH值为5.8，补充蒸馏水至1000ml，灌装入10ml的鼻腔喷雾器即可。

实施例4：(鼻腔喷雾剂)

1、活性成分：环维黄杨星D 7.5g，川芎嗪40g，冰片3.5g。

HP-β-环糊精0.26g  去乙酰结冷胶5g  尼泊金乙酯0.1g  三乙醇胺适量  蒸馏水适量

2、制备方法：

(1)取冰片用适量的乙醇溶解，得冰片乙醇溶液备用；取羟丙基-β-环糊精0.26g加入3倍蒸馏水研匀，滴加所制得的冰片乙醇溶液，室温研磨包合1.5小时，溶液冷藏24小时，乙酸乙酯洗涤3次后，G5垂熔漏斗滤过，滤液真空干燥，制得冰片HP-β-环糊精包合物；

(2)将环维黄杨星D和川芎嗪溶解于蒸馏水中，然后依次加入步骤(1)所制得的冰片HP-β-环糊精包合物、去乙酰结冷胶5g和尼泊金乙酯0.1g，充分混匀，加入三乙醇胺将调节pH值为5.6，补充蒸馏水至1000ml，灌装入10ml的鼻腔喷雾器即可。

实施例5：(注射剂)

1、活性成分：环维黄杨星D 5g，川芎嗪30g，冰片2g。

2、制备方法：

取依地酸二钠0.05g和亚硫酸氢钠2g加水溶解制得依地酸二钠溶液和亚硫酸氢钠溶液备用。取HP-β-环糊精0.15g，加入3倍水研匀，滴加冰片乙醇溶液，室温研磨1.5h，溶液冷藏24h，乙酸乙酯洗涤3次后，G5垂熔漏斗滤过，滤液真空干燥，即得冰片HP-β-环糊精包合物。在配制容器中，加入配制量80％的注射用水，二氧化碳饱和，加入环维黄杨星D和川芎嗪并使溶解，加入所述冰片HP-β-环糊精包合物，搅拌使完全溶解。加入所配制的依地酸二钠溶液和亚硫酸氢钠溶液，搅拌均匀，调节pH值至5.8～6.2，添加二氧化碳饱和的注射用水至1000ml，用垂熔玻璃漏斗与薄膜滤器滤过，溶液中通二氧化碳，在氮气流下罐封于1ml安瓿中，100℃灭菌30min即得。

实施例6：(滴丸)

1、活性成分：环维黄杨星D10g，川芎嗪50g，冰片3g。

2、制备方法：取聚乙二醇6000 600g置不锈钢锅中，于油锅上加热至90～100℃，待全部熔融后，加入环维黄杨星D、川芎嗪和冰片搅拌至熔解，转移至贮液瓶中，密闭并保温在80～90℃，调节滴液定量阀门，滴入10～15℃的液体石蜡中，将成型的滴丸沥尽并擦除液状石蜡，置石灰缸内干燥即得滴丸。

实施例7：(贴剂)

1、活性成分：环维黄杨星D 10g，川芎嗪50g，冰片5g。

2、制备方法：取Eudragit 100 250g和琥珀酸10g，加入适量无水乙醇静置过夜，使充分交联、溶解，得交联改性的Eudragit 100胶液。加入癸二酸二丁酯120g和氮酮10g并混匀，将环维黄杨星D、川芎嗪和冰片用适量的无水乙醇溶解后与上述交联改性的Eudragit100胶液混合搅拌均匀，静置适宜时间使气泡消失，涂布于防黏纸上，置于烘箱以80℃固化10min后转移至背衬层，切割成3cm×5cm的单层经皮给药型贴剂。按单层贴剂制备方法，分别制备一定载药量的单层贴剂基质做为贮库层与释放层，按顺序涂布于防黏纸上，涂布时从保护层至背衬层载药量依次增大，即得双层经皮给药型贴剂。

Claims (4)

1.一种治疗缺血性脑血管病的药物组合物，该药物组合物由活性成分和医学上可接受的辅料组成，其特征在于，所述的活性成分由以下重量份的有机成分组成：环维黄杨星D 5～10，川芎嗪30～50，冰片2～5。

2.根据权利要求1所述的一种治疗缺血性脑血管病的药物组合物，其特征在于，所述的有机成分的重量份配比为：环维黄杨星D 7.5，川芎嗪40，冰片3.5。

3.根据权利要求1或2所述的一种治疗缺血性脑血管病的药物组合物，其特征在于，该药物组合物是鼻腔喷雾剂、口服制剂、注射剂或贴剂。

4.权利要求3所述鼻腔喷雾剂的制备方法，该方法由以下步骤组成：

(1)取冰片用适量的乙醇溶解，得冰片乙醇溶液备用；按冰片∶羟丙基-β-环糊精＝4∶0.3的比例取羟丙基-β-环糊精加入3倍蒸馏水研匀，滴加所制得的冰片乙醇溶液，室温研磨包合1.5小时，溶液冷藏24小时，乙酸乙酯洗涤3次后，G5垂熔漏斗滤过，滤液真空干燥，制得冰片HP-β-环糊精包合物；

(2)将环维黄杨星D和川芎嗪溶解于蒸馏水中，然后依次加入步骤(1)所制得的冰片HP-β-环糊精包合物和助剂，充分混匀，调节pH值为5.2～5.8，补充蒸馏水，使所述活性成分的质量浓度为3.7％～6.5％，使所述助剂的质量浓度为0.01％～3.22％，灌装入鼻腔喷雾器即可；所述的助剂是防腐剂，或者是防腐剂与位凝胶基质或/和增黏剂的混合物，其中，

所述的防腐剂为尼泊金乙酯、羟基苯甲酸乙酯或山梨酸钾；

所述的原位凝胶基质为卡波姆、泊洛沙姆188或去乙酰结冷胶；

所述的增黏剂为羟丙基甲基纤维素、泊洛沙姆407或羧甲基纤维素钠。