CN103822964A - 中性解吸-电喷雾萃取电离质谱直接检测蜂蜜中的氯霉素 - Google Patents

Abstract

本发明属于分析测试领域，公开中性解吸-电喷雾萃取电离质谱直接检测蜂蜜中的氯霉素方法，包括（1）加标蜂蜜的制备；（2）样品准备；（3）中性解吸-电喷雾萃取电离质谱检测；（4）选择m/z321的二级特征碎片离子m/z257进行定量分析得出氯霉素的量。本发明无需对待测样品进行预处理和色谱分离，即可对蜂蜜中的氯霉素进行快速检测和鉴别，改善了现有技术中检测操作步骤繁琐、费时等缺陷。

Description

中性解吸-电喷雾萃取电离质谱直接检测蜂蜜中的氯霉素

技术领域

本发明属于检测技术领域，特别涉及蜂蜜中氯霉素的检测方法。

背景技术

中国是世界第一养蜂大国，也是蜂产品生产和出口大国。在生产过程中，由于蜂农在蜂群消毒治病时使用了含氯霉素的药物，以及蜜蜂在采集花粉时携带了环境中的氯霉素，导致蜂蜜中氯霉素的残留。氯霉素(Chloramphenicol, CAP)是一种高效广谱性抗生素，已有多年的使用历史。食品中残留的氯霉素会对人骨髓造血功能造成严重损害，从而引起人的粒细胞缺乏病、再生障碍性贫血和溶血性贫血，严重者可致死，因此，氯霉素成为第一个被禁止用于食品动物的抗生素。随着人民生活水平的提高以及进出口贸易的快速发展，蜂蜜中的氯霉素残留已经成为影响我国蜂蜜出口的首要因素，严重危害国民食品安全及经济的发展。

目前，常用的氯霉素检测方法有酶联免疫分析法、高效液相色谱法、液质联用法、气质联用法等。这些方法一般都需要复杂的样品预处理过程，具有操作步骤繁琐、费时等缺陷，给蜂蜜中氯霉素的检测带来许多不便。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的对蜂蜜中氯霉素残留直接检测的方法。本发明首次提出了以喷雾试剂对样品进行中性解吸的方式，在无需样品预处理的条件下，对蜂蜜中的氯霉素进行快速检测。

本发明所述的检测方法是借助常规的LTQ-XL型线性离子阱质谱仪和中性解吸-电喷雾萃取电离(neutral desorption-extractive electrospray ionization mass spectrometry, ND-EESI)源进行含氯霉素蜂蜜样品的检测。

一种中性解吸-电喷雾萃取电离质谱ND-EESI-MS直接检测蜂蜜中氯霉素的方法，包含下列步骤：

（1）加标蜂蜜的制备：将1.0 mg/mL的氯霉素标准品溶液用甲醇配制成1.0μg /mL氯霉素标准溶液备用；精确量取1 mL蜂蜜样品，加入氯霉素标准溶液后用体积比1:1的甲醇：水稀释液20 mL进行稀释，配成浓度梯度为100～8000 ng/mL的氯霉素蜂蜜液，加入搅拌子在搅拌器上常温搅拌3 min，量取7 mL加标蜂蜜稀释液至10 mL锥形瓶中进行实验；

（2）样品准备：取待测蜂蜜1mL，加入20mL体积比为1:1甲醇：水稀释液稀释，取7mL至10 mL锥形瓶中； 

（3）中性解吸-电喷雾萃取电离质谱检测：设置ND-EESI离子源为负离子模式，质量范围为50-500 Da，中性解吸喷雾试剂喷雾流速为14 μL/min；电离电压为2.5 kV，离子传输管温度为150 ℃，雾化气为氮气，纯度为99.999%，压力为1.0 MPa；

萃取剂为甲醇：水：氨水，体积比为98:1:1，流速为0.008 mL/min，两喷雾通道夹角α为60°，样品通道口与质谱口水平夹角β为150°，两喷雾通道口与质谱口距离为0.5 cm；碰撞诱导解离CID实验时，母离子隔离宽度为1.2 Da，碰撞能量为18 %，其他条件为系统自动优化；

（4）选择m/z 321的二级特征碎片离子m/z 257进行定量分析，同时扣除相应的空白背景，以其m/z 257的绝对信号强度平均值与对应的加标蜂蜜浓度绘制标准曲线，利用实验得到的加标蜂蜜曲线计算待测蜂蜜样品中氯霉素的含量。

为达到更好的技术效果，中性解吸喷雾试剂为甲醇。

本发明的有益效果是：（1）检出限更低，对蜂蜜中氯霉素的检出限为15.567 ng/mL。（2）本发明方法首次采用甲醇喷雾进行中性解吸，解吸效率高，提高了目标信号的强度。（3）加标蜂蜜无需进行传统检测方法中过柱等复杂的预处理过程。（4）使实现直接快速的蜂蜜污染物检测技术的应用成为可能，为蜂蜜产业的可持续发展奠定基础。

附图说明

图1为本发明方法的ND-EESI实验装置图。

图2为本发明氯霉素标准溶液(100 ng/mL)的MSⁿ谱图，图中，(a)为氯霉素标准溶液一级质谱图，(b)为氯霉素标准溶液m/z 321二级质谱图。

图3为本发明中性解吸喷雾试剂优化实验中m/z 321 CID信号强度随中性解吸喷雾试剂的变化趋势图。

图4为本发明中性解吸喷雾试剂优化实验中不同中性解吸喷雾试剂下的m/z 321 二级质谱信号强度图。

图5为本发明中影响氯霉素质谱行为条件的优化图，图中，(a)为萃取剂流速的优化图，(b)为电喷雾电压的优化图，(c)为雾化气压力的优化图，(d)为离子传输管温度的优化图，(e)为甲醇喷雾剂流速的优化图。

图6为加标蜂蜜样品中氯霉素的MSⁿ谱图，图中，(a)为实际加标蜂蜜的一级质谱图，(b)为加标蜂蜜中氯霉素(m/z 321)二级质谱图。

图7为不同浓度加标蜂蜜的工作曲线。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明。

本发明所述的实例使用的质谱仪为美国Finnigan公司的LTQ-XL型线性离子阱质谱仪，数据处理系统为美国Finnigan公司的Xcalibur数据处理系统。

中性解吸装置和EESI离子源，由江西省质谱科学与仪器重点实验室自行研制；精密电子天平（METTLER TOLEDO）。甲醇（色谱纯，SK CHEMICALS）；氯霉素标准品（纯度为99%，阿拉丁试剂公司）；

本实验使用图1所示的ND-EESI-MS方法对氯霉素甲醇标准溶液(100 ng/mL)进行实验，结果如图2所示。氯霉素在EESI负离子模式下形成[M-H]^-分子负离子而获得较强的m/z 321信号峰（图2a），选择m/z 321分子离子峰进行二级质谱研究(图2b)，母离子m/z 321的主要特征离子为m/z 257、194、152和176。为确保实验的可靠性，采用EESI-MS对100 ng/mL氯霉素标准溶液进行了MS/MS质谱对照分析，结果表明，氯霉素ND-EESI-MSⁿ谱图与其EESI-MSⁿ谱图完全吻合。因此，如果在实际样品中能检测到信号峰m/z 321，并在MS/MS谱图中观察到主要特征离子m/z 257和m/z 194，则可以判断该样品中含有氯霉素。

为了提高目标离子峰的信号强度，本实验首次提出了采用喷雾试剂通入样品进行中性解吸的方法(如图1所示)，进行了喷雾试剂的优化，并在实验中验证了这一方法的可行性。实验以100 ng/mL的氯霉素标准溶液为实验对象，以m/z 321的二级质谱信号响应强度为标准，进行甲醇、乙醇、丙酮、丁醇、乙酸乙酯及正己烷的优化实验。由图3可知，m/z 321的二级响应信号强度随着中性解吸喷雾试剂的变化而变化，当喷雾试剂为甲醇时，质谱信号最强，这可能是由于氯霉素极易溶于甲醇，且甲醇的极性是这几种有机溶剂中最强的；而当喷雾试剂为正己烷时，质谱信号最弱，这可能是由于氯霉素不溶于正己烷，且正己烷是非极性有机溶剂。如图4所示，当中性解吸喷雾试剂为甲醇时，m/z 321二级质谱信号强度最大；而当中性解吸喷雾试剂为正己烷时，m/z 321二级质谱信号强度最小。值得一提的是，当中性解吸喷雾试剂为正己烷时，与传统方法中只通入氮气进行中性解吸时的m/z 321二级质谱信号强度相当，说明在进行中性解吸时，加入的有机喷雾试剂能帮助氯霉素更好的解吸。实验结果表明，用甲醇喷雾对氯霉素溶液进行中性解吸时，解吸效率最高。

本实验进行了离子源条件的优化，根据氯霉素标准溶液的质谱行为，在负离子模式下，优化实验均选择m/z 321的质谱响应信号强度来表示对氯霉素分子的检测效率。如图5a所示，电喷雾溶剂流速在8 μL/min时的萃取效率最大；如图5b所示，电压太小(小于1.5 kV)时，信号强度较低，随着电压的增高，目标信号强度迅速升高，当电压太大(大于2.5 kV)时，信号强度反而有所降低，在2.5 kV时达到最佳；如图5c所示，实验表明，随着雾化气体压力的增大，目标信号强度也随之增大，当气压超过一定值(大于1.0 MPa)时，大部分离子会湮灭在质谱口边缘，目标信号强度也会大幅度下降，在1 MPa时达到最佳；如图5d所示，温度从100 ℃～150 ℃，目标信号强度迅速升高，但是温度大于150 ℃后，信号强度逐渐降低，因此，实验选择离子传输管温度为150 ℃；如图5e所示，当甲醇流速超过一定值(大于14 μL/min)时，由于在甲醇喷雾解吸时带入了过量的甲醇，从而在一定程度上稀释了氯霉素样品，导致目标信号下降，甲醇喷雾流速以14 μL/min为最佳。

在优化的实验条件下，对加标蜂蜜溶液(8 μg/mL)进行ND-EESI-MS扫描。由图6a可知，实际加标蜂蜜样品的一级谱图中获得了母离子峰m/z 321，即为中性解吸出的目标氯霉素分子丢失了一个氢的信号；进一步对母离子m/z 321 进行二级质谱鉴定，得到了特征碎片m/z 257、194、152和176 (图6b），与标准品中的特征碎片一致。

设置ND-EESI离子源为负离子模式，质量范围为50-500 Da，中性解吸喷雾试剂为甲醇，电离电压为2.5 kV，离子传输管温度为150 ℃，雾化气(氮气，纯度为99.999%)，压力为1.0 MPa；

萃取剂为甲醇：水：氨水(98:1:1)，流速为0.008 mL/min，两喷雾通道夹角α为60°，样品通道口与质谱口水平夹角β为150°，两喷雾通道口与质谱口距离为0.5 cm；

按照上述实验方法进行加标蜂蜜实验，以确定本方法的线性范围和检出限。为了排除信号的假阳性，实验选择m/z 321的二级特征碎片离子m/z 257进行定量分析，同时扣除相应的空白背景。每个浓度的标准样品测定7次，以m/z 257的绝对信号强度平均值与对应的氯霉素浓度绘制曲线，如图7所示。实验表明，在氯霉素浓度100～8000 ng/mL范围内，离子强度与浓度具有较好的线性关系，线性回归方程为y=0.031x-3.49，R = 0.998。对100 ng/mL加标蜂蜜样品进行测定，获得净相应信号强度为4.85，平行测定10次，精密度(RSD)为5.19%，3倍标准偏差为0.755(S/N=3)，根据LOD=c3σ/S(c为标准品的浓度，σ为标准偏差，S为净相应信号强度平均值)，计算得本方法对加标蜂蜜的检出限为15.567 ng/mL。在相同的实验条件下，采用直接通入N₂的方式进行样品的中性解吸，得到的蜂蜜中氯霉素的检出限为73.3 ng/mL，说明本发明采用的实验方法比传统方法降低了检出限。

实施例2

1、加标氯霉素蜂蜜处理：将1.0 mg/mL的氯霉素标准品溶液用甲醇配制成1.0 mg/mL氯霉素标准溶液备用；精确量取1 mL蜂蜜样品，加入氯霉素标准溶液后用甲醇：水（1:1）20 mL进行稀释，配成浓度梯度为100～8000 ng/mL的氯霉素蜂蜜液，加入搅拌子在搅拌器上常温搅拌3 min，量取7 mL加标蜂蜜稀释液至10 mL锥形瓶中进行实验。

2、样品准备：取待测蜂蜜1 mL，加入20mL体积比为1:1甲醇：水稀释液稀释，取7mL至10 mL锥形瓶中。

3、中性解吸-电喷雾萃取电离质谱（ND-EESI-MS）：

(1)设置ND-EESI离子源为负离子模式，质量范围为50-500 Da，中性解吸喷雾试剂为甲醇，甲醇喷雾流速为14 μL/min，电离电压为2.5 kV，离子传输管温度为150 ℃，雾化气(氮气，纯度为99.999%)，压力为1.0 MPa；

(2)萃取剂为甲醇：水：氨水(98:1:1)，流速为0.008 mL/min，两喷雾通道夹角α为60°，样品通道口与质谱口水平夹角β为150°，两喷雾通道口与质谱口距离为0.5 cm；

(3)碰撞诱导解离(collision induced dissociation，CID)实验时，母离子隔离宽度为1.2 Da，碰撞能量为18 %，其他条件为系统自动优化；

为了排除信号的假阳性，实验选择m/z 321的二级特征碎片离子m/z 257进行定量分析，同时扣除相应的空白背景。每个浓度的标准样品测定7次，以其m/z 257的绝对信号强度平均值与对应的氯霉素浓度绘制曲线，如图7所示。实验表明，在氯霉素浓度100～8000 ng/mL范围内，离子强度与浓度具有较好的线性关系，线性回归方程为y=0.031x-3.49，R = 0.998。

对100 ng/mL加标蜂蜜样品进行测定，获得净相应信号强度为4.85，平行测定10次，精密度（RSD）为5.19%，3倍标准偏差为0.755（S/N=3），根据LOD=c3σ/S（c为标准品的浓度，σ为标准偏差，S为净响应信号强度平均值），计算得本方法对加标蜂蜜的检出限为15.567 ng/mL。

在相同的实验条件下，采用直接通入N₂的方式进行样品的中性解吸，得到的蜂蜜中氯霉素的检出限为73.3 ng/mL，说明本发明采用的实验方法比传统方法降低了检出限。

根据所得加标氯霉素的标准曲线，计算出待测样品中氯霉素的浓度。

为了验证此工作曲线的可信性，进行回收率实验。对加标蜂蜜浓度为400 ng/mL和3000 ng/mL的蜂蜜样品液进行实验，回收率分别为92.9%（RSD为3.5%）和83%（RSD为5.8%）。

Claims (2)

1.一种中性解吸-电喷雾萃取电离质谱ND-EESI-MS直接检测蜂蜜中氯霉素的方法，其特征是包含下列步骤：

（1）加标蜂蜜的制备：将1.0 mg/mL的氯霉素标准品溶液用甲醇配制成1.0μg /mL氯霉素标准溶液备用；精确量取1 mL蜂蜜样品，加入氯霉素标准溶液后用体积比1:1的甲醇：水稀释液20 mL进行稀释，配成浓度梯度为100～8000 ng/mL的氯霉素蜂蜜液，加入搅拌子在搅拌器上常温搅拌3 min，量取7 mL加标蜂蜜稀释液至10 mL锥形瓶中进行实验；

（2）样品准备：取待测蜂蜜1mL，加入20mL体积比为1:1甲醇：水稀释液稀释，取7mL至10 mL锥形瓶中； 

（3）中性解吸-电喷雾萃取电离质谱检测：设置ND-EESI离子源为负离子模式，质量范围为50-500 Da，中性解吸喷雾试剂喷雾流速为14 μL/min；电离电压为2.5 kV，离子传输管温度为150 ℃，雾化气为氮气，纯度为99.999%，压力为1.0 MPa；萃取剂为甲醇：水：氨水，体积比为98:1:1，流速为0.008 mL/min，两喷雾通道夹角α为60°，样品通道口与质谱口水平夹角β为150°，两喷雾通道口与质谱口距离为0.5 cm；碰撞诱导解离CID实验时，母离子隔离宽度为1.2 Da，碰撞能量为18 %，其他条件为系统自动优化；

（4）选择m/z 321的二级特征碎片离子m/z 257进行定量分析，同时扣除相应的空白背景，以其m/z 257的绝对信号强度平均值与对应的加标蜂蜜浓度绘制标准曲线，利用实验得到的加标蜂蜜曲线计算待测蜂蜜样品中氯霉素的含量。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）中中性解吸喷雾试剂为甲醇。

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