CN111122691A - 一种采用nd-eesi-ms方法检测盐胁迫下拟南芥代谢产物的方法 - Google Patents

一种采用nd-eesi-ms方法检测盐胁迫下拟南芥代谢产物的方法 Download PDF

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郝影宾
崔萌
黄学勇
薛阿辉
宁方建
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Abstract

本发明属于检测领域，具体涉及一种采用ND‑EESI‑MS方法检测盐胁迫下拟南芥代谢产物的方法。以哥伦比亚生态型拟南芥为研究对象，分别对其施加50、100、200和300 mM NaCl溶液，盐胁迫处理1、4、7 d，比较不同盐胁迫条件下拟南芥的生长状况。在正离子模式下采用ND‑EESI‑MS技术，对盐胁迫下拟南芥叶进行原位活体无损分析，快速获取盐胁迫下叶中组份的变化信息，为植物应答非生物胁迫研究提供理论和技术支撑。

Description

一种采用ND-EESI-MS方法检测盐胁迫下拟南芥代谢产物的 方法
技术领域
本发明属于检测领域，具体涉及一种采用ND-EESI-MS方法检测盐胁迫下拟南芥代谢产物的方法。
背景技术
植物应答盐胁迫代谢组学研究，是解析植物对盐胁迫耐受性和敏感性复杂生命过程的关键。为了深入全面地认识盐胁迫对植物的影响以及植物的抗逆性，需要发展实时、高效的分析植物代谢组份的检测技术。已有的代谢组学分析手段如GC-MS需要对样品进行提取、分离或衍生化等预处理，且更偏向于检测植物挥发性代谢产物；
HPLC-MS需要样品预处理，仪器操作条件需要反复优化，需依赖纯的标准物对物质定性定量分析。
因此，建立一种快速准确、不需要样品预处理，且能实时在线监测植物随环境变化而变化的代谢过程的研究方法，对掌握植物代谢产物的种类和数量具有积极意义。这样不仅能对代谢物进行全方面的分析，更有助于了解生物的代谢途径、生物体中各种复杂的相互作用及生物系统对环境和基因变化的响应。直接质谱技术指无需进行样品预处理，可直接对复杂样品进行快速分析的质谱技术，在代谢组学研究中应用越来越广泛。ND-EESI-MS是由EESI电离源加以改进得到，适用范围更加广泛，可直接对样品中的物质进行解吸化学电离，并进行质谱分析，具有原位、快速、灵敏、实时在线、能够承受复杂基体样品等优点。
在医学领域，Zhang等采用ND-EESI-MS可实现对健康和肺癌患者的痰样快速有效区分。在食品领域方面，于腾辉等采用ND-EESI-MS技术实现了蜂蜜中敌敌畏的快速、直接质谱检测，然而ND-EESI-MS技术在植物代谢组学方面应有较少。ND-EESI-MS在分析样品表面时不会造成明显损伤，在取样过程中可以根据分析对象的需要采用氮气或氩气等惰性气体，对样品尤其是生物体没有任何化学污染，对植物生理或病理状态没有明显干扰，特别适合进行植物活体表面原位无损分析。
发明内容
基于背景技术中提到的问题，本发明拟提供一种采ND-EESI-MS方法检测盐胁迫下拟南芥代谢产物的方法
本发明以哥伦比亚生态型拟南芥为研究对象，分别对其施加50、100、200和300mMNaCl溶液，盐胁迫处理1、4、7d，比较不同盐胁迫条件下拟南芥的生长状况。在正离子模式下采用ND-EESI-MS技术，对盐胁迫下拟南芥叶进行原位活体无损分析，快速获取盐胁迫下叶中组份的变化信息，为植物应答非生物胁迫研究提供理论和技术支撑。
本发明是采用以下技术方案实现的：
一种采用ND-EESI-MS方法检测盐胁迫下拟南芥代谢产物的方法,包括以下步骤：
(1)种子前处理：将种子置于1.5mL离心管中浸水处理，置于4℃低温下处理3d，然后将已春化的种子用牙签蘸取置于培养基质表面，用保鲜膜封盖，保鲜膜表面戳5-15个小洞，覆膜4d，放入光照培养室内，垂直培养，其培养条件为温度为22℃，相对湿度为60％，光照条件为16h光照培养，8h黑暗培养，光照强度为120μml.m-2s-1；
(2)盐胁迫处理：分别用50、100、200和300mM浓度的NaCl溶液替代蒸馏水浇灌拟南芥植株，浇灌15mL至浇透，用NaCl分别处理1、4、7d，每个处理设三个重复，以浇蒸馏水的植株作为实验对照组；
(5)植物样品采集：拟南芥培养至28d时，莲座叶用于直接质谱分析；
(6)ND-EESI-MS分析：选取拟南芥植株上大小均一的莲座叶叶片，将加工的采样装置置于叶片表面，由阀门控制的氮气直接用作解吸气，原位分析拟南芥叶子样品表面组分，分析物在EESI环境中进行离子化，样品出口和电喷雾束形成一个60°的角度(β)，样品出口和电喷雾口为2mm，电喷雾和LTQ仪器离子传输管之间角度(α)和样品出口和LTQ仪器离子传输管之间角度(γ)都为150°，整个EESI装置和LTQ仪器离子传输管相平行，和LTQ仪器离子入口的距离(b)为5mm，EESI离子源以甲醇：水＝1：1(v/v)为萃取剂，萃取溶剂以2mL/min的流速通过石英毛细管，在微量进样针的钢针部位施加3.5kV正高压，这些微小带电液滴去溶剂化后得到气态待测物离子，引入到质谱仪中进行检测，质谱仪的扫描范围为m/z 50-800；检测得到数据进行数据处理。
作为优选，所述的一种采用ND-EESI-MS方法检测盐胁迫下拟南芥代谢产物的方法：步骤(1)中所述的培养基质为营养土：蛭石＝3:1(体积比)。
作为优选，所述的一种采用ND-EESI-MS方法检测盐胁迫下拟南芥代谢产物的方法：数据处理过程为：
(1)进样质谱数据在Xcalibur数据处理系统中扣除背景之后直接导入至Excel，以m/z为自变量，质谱峰的相对强度为因变量；
(2)采用Matlab R2016a软件对质谱数据进行归一化处理并进行PCA分析，利用Simca软件进行PLS-DA分析，通过计算VIP值来衡量各代谢物的表达模式对各组样本分类判别的影响强度和解释能力，辅助标志代谢物的筛选，采用Cluster软件对已检测到的物质质谱峰信号强度进行热图分析。
本发明的有益效果
(1)本质谱检测方法无需任何样品预处理，实现对样品原位活体检测。并且不会对植物样品叶片造成很大伤害，检出的样品可以继续生长，可实现对同一株植物的定位持续观察。
(2)采用此技术每个样品检测时间仅仅为30s，本方法可以真正实现高通量快速检测。
附图说明
图1为本发明检测流程示意图；
图2为本发明盐胁迫处理组和实验对照组拟南芥生长情况；
图3为盐胁迫7d下拟南芥莲座叶叶片ND-EESI-MS指纹图谱：(a)对照组指纹图谱；(b)50mM盐浓度下指纹图谱；(c)100mM盐浓度下指纹图谱；(d)200mM盐浓度下指纹图谱；(e)300mM盐浓度下指纹图谱。
具体实施方式
实施例1
将种子置于1.5mL离心管中浸水处理，置于4℃低温下处理3d，然后将已春化的种子用牙签蘸取置于培养基质表面(营养土：蛭石＝3:1，v/v)，用保鲜膜封盖，保鲜膜表面戳10个小洞，覆膜4d，放入光照培养室内，垂直培养，其培养条件为温度为22℃，相对湿度为60％，光照条件为16h光照培养，8h黑暗培养，光照强度为120μml.m-2s-1。
盐胁迫处理如下：分别用50、100、200和300mM浓度的NaCl溶液替代蒸馏水浇灌拟南芥植株，浇灌15mL至浇透，NaCl分别处理1、4、7d(即分别于取样前7、4、1d用相应浓度的NaCl溶液进行盐胁迫)，每个处理设三个重复。另外，以浇蒸馏水的植株作为实验对照组。植物样品采集：拟南芥培养至28d时，莲座叶用于直接质谱分析。
选取拟南芥植株上大小均一的莲座叶叶片，将加工的采样装置置于叶片表面，由阀门控制的氮气直接用作解吸气，原位分析拟南芥叶子样品表面组分。实验各个参数经过优化之后进行，分析物在EESI环境中进行离子化，出样品口和电喷雾束形成一个60°的角度(β)，两者之间的距离(a)为2mm。电喷雾和LTQ仪器离子传输管之间角度(α)和样品出口和LTQ仪器离子传输管之间角度(γ)都150°。整个EESI装置和LTQ仪器离子传输管相平行，和LTQ仪器离子入口的距离(b)为5mm。EESI离子源以甲醇：水＝1：1(v/v)为萃取剂，萃取溶剂以2mL/min的流速通过石英毛细管。在微量进样针的钢针部位施加3.5kV正高压，在电场的作用下，样品前端产生大量承载待测物的微小带电液滴，这些微小带电液滴去溶剂化后得到气态待测物离子，引入到质谱仪中进行检测，质谱仪的扫描范围为m/z50-800。
进样质谱数据在Xcalibur数据处理系统(美国Thermo Scientific公司)中扣除背景之后直接导入至Excel，以m/z为自变量，质谱峰的相对强度为因变量，采用MatlabR2016a(9.0版本，美国Mathworks公司)软件对质谱数据进行归一化处理并进行PCA分析。利用Simca软件(14.0版本，瑞典Umetrics公司)进行PLS-DA分析，这是一种有监督的判别分析统计方法，该方法运用偏最小二乘回归建立代谢物表达量与样品类别之间的关系模型，来实现对样品类别的预测。另外，同时通过计算VIP值(Variable importance for theprojection，VIP)来衡量各代谢物的表达模式对各组样本分类判别的影响强度和解释能力，从而辅助标志代谢物的筛选(通常以VIP值>1.0作为筛选标准)。利用Cluster(3.0版本)软件对已检测到的物质质谱峰信号强度进行热图分析。
通过获得的一级指纹图谱信息，再结合通过碰撞诱导解离(Collision induceddissociation，CID)实验获得的二级指纹图谱信息，根据不同的二级碎片以及参考标准品和有关质谱数据库，最终确定了盐胁迫下拟南芥叶中的12种化合物，见表1。
表1利用ND-EESI-MS技术鉴定出拟南芥叶中的12种化合物
Figure BDA0002361813140000081

Claims (3)

1.一种采用ND-EESI-MS方法检测盐胁迫下拟南芥代谢产物的方法，其特征在于,包括以下步骤：
(1)种子前处理：将种子置于1.5mL离心管中浸水处理，置于4℃低温下处理3d，然后将已春化的种子用牙签蘸取置于培养基质表面，用保鲜膜封盖，保鲜膜表面戳5-15个小洞，覆膜4d，放入光照培养室内，垂直培养，其培养条件为温度为22℃，相对湿度为60％，光照条件为16h光照培养，8h黑暗培养，光照强度为120μml.m-2s-1；
(2)盐胁迫处理：分别用50、100、200和300mM浓度的NaCl溶液替代蒸馏水浇灌拟南芥植株，浇灌15mL至浇透，用NaCl分别处理1、4、7d，每个处理设三个重复，以浇蒸馏水的植株作为实验对照组；
(3)植物样品采集：拟南芥培养至28d时，莲座叶用于直接质谱分析；
(4)ND-EESI-MS分析：选取拟南芥植株上大小均一的莲座叶叶片，将加工的采样装置置于叶片表面，由阀门控制的氮气直接用作解吸气，原位分析拟南芥叶子样品表面组分，分析物在EESI环境中进行离子化，出样品口和电喷雾束形成一个60°的角度β，样品出口和电喷雾口之间的距离为2mm，电喷雾和LTQ仪器离子传输管之间角度α和样品出口和LTQ仪器离子传输管之间角度γ都为150°，整个EESI装置和LTQ仪器离子传输管相平行，和LTQ仪器离子入口的距离b为5mm，EESI离子源以甲醇：水＝1：1(v/v)为萃取剂，萃取溶剂以2mL/min的流速通过石英毛细管，在微量进样针的钢针部位施加3.5kV正高压，这些微小带电液滴去溶剂化后得到气态待测物离子，引入到质谱仪中进行检测，质谱仪的扫描范围为m/z 50-800；检测得到数据进行数据处理。
2.根据权利要求1所述的一种采用ND-EESI-MS方法检测盐胁迫下拟南芥代谢产物的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的培养基质体积比为营养土：蛭石＝3:1。
3.根据权利要求1所述的一种采用ND-EESI-MS方法检测盐胁迫下拟南芥代谢产物的方法，其特征在于：所述数据处理过程为：
(1)进样质谱数据在Xcalibur数据处理系统中扣除背景之后直接导入至Excel，以m/z为自变量，质谱峰的相对强度为因变量；
(2)采用Matlab R2016a软件对质谱数据进行归一化处理并进行PCA分析，利用Simca软件进行PLS-DA分析，通过计算VIP值来衡量各代谢物的表达模式对各组样本分类判别的影响强度和解释能力，辅助标志代谢物的筛选，采用Cluster软件对已检测到的物质质谱峰信号强度进行热图分析。
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