CN103784664B - 一种防治慢性盆腔炎的双相胶囊及其制备方法和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种防治慢性盆腔炎的双相胶囊及其制备方法和检测方法，所述防治慢性盆腔炎的双相胶囊是以白头翁20g、香附20g、怀牛膝12g、苍术12g、黄柏8g、蛇床子8g为原料药，提取后加入适量微粉硅胶和低取代羟丙基纤维素，并以80%乙醇为润湿剂制成的。本发明针对现有技术的不足，对防治慢性盆腔炎的双相胶囊的制备工艺进行了优化，使其对慢性盆腔炎的疗效更为显著，并建立了系统的、完整的、有效的成分鉴别和含量测定方法，可有效控制该药品的质量，从而确保其临床疗效。
Description
技术领域
本发明涉及一种防治慢性盆腔炎的双相胶囊及其制备方法和检测方法，属于中药技术领域。
背景技术
双相胶囊是指将中药复方中挥发性成分制成小型滴丸（或软胶囊），浸出物制成颗粒（或微丸），再把小型滴丸（或软胶囊）和颗粒（或微丸）等定量装入硬胶囊中。该剂型充分发挥滴丸、颗粒、硬胶囊的优点，该双相胶囊优点在于利用一种液体成份与固体成份分装的方法，使液体成分固体化，减少挥发油的挥发，减少这些成份之间混合所导致的化学及物理变化，是一种安全、有效、可控、携带方便的中药新剂型。
申请号为“200910169558.1”的专利申请公开了一种防治慢性盆腔炎的中药组合物，其以白头翁、香附、怀牛膝、苍术、黄柏、蛇床子为原料药，制成双相胶囊。但其说明书中并未对制备工艺方法及参数进行细化、筛选，很难根据所述公开内容制备得到治疗慢性盆腔炎效果优良、产品稳定性高的中药组合物。
此外，目前对该防治慢性盆腔炎的制剂还没有一套严格可靠的质量检测标准。如果没有严格的质量标准，得到的产品不能确保其质量，结果必将影响该药物的临床疗效；所以为提高益肝排毒药物的治疗作用，确保用药的安全、有效及产品质量的稳定，制定一个严格可靠的质量标准成为保证药品质量的基本要求。随着现代仪器分析技术的发展，高效液相色谱法、薄层色谱鉴别法等分析方法在药品的质量控制中得到了越来越广泛的应用。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种防治慢性盆腔炎的双相胶囊及其制备方法和检测方法。本发明针对现有技术的不足，对防治慢性盆腔炎的双相胶囊的制备工艺进行了优化，使其对慢性盆腔炎的疗效更为显著，并建立了系统的、完整的、有效的成分鉴别和含量测定方法，可有效控制该药品的质量，从而确保其临床疗效。
本发明的技术方案：一种防治慢性盆腔炎的双相胶囊，其特征在于：它是以白头翁20g、香附20g、怀牛膝12g、苍术12g、黄柏8g、蛇床子8g为原料药，提取后加入适量微粉硅胶和低取代羟丙基纤维素，并以80%乙醇为润湿剂制成的。
前述的防治慢性盆腔炎的双相胶囊的制备方法为：将香附、苍术两味药材粉碎成粗粉后采用超临界CO2流体萃取，收集挥发油制成小型滴丸，残渣与黄柏、怀牛膝、白头翁和蛇床子素粗粉混合后采用乙醇渗漉提取，提取物与辅料混合制成颗粒，再把小滴丸和颗粒等定量装入同一硬胶囊中。
前述的防治慢性盆腔炎的双相胶囊的制备方法中，滴丸制备工艺具体如下：混合基质PEG10000：PEG20000=3:1，载药量60%，待基质75℃水浴熔融后加入挥发油药物，药液温度75℃，采用冷凝剂二甲基硅油，制冷温度15℃、管口温度20℃，滴头口径2.0/2.5mm·mm-1，滴距8cm，滴速20d·min-1，滴丸收集后用吸水纸擦干。
前述的防治慢性盆腔炎的双相胶囊的制备方法中，颗粒制备工艺具体如下：微粉硅胶和低取代羟丙基纤维素用量各占投药量的5%，与提取物粉末混合均匀，加入1.5%体积的80%乙醇制软材，用14目筛网制成湿颗粒，于40℃干燥，并收集通过14目筛而不能通过60目筛的颗粒。
前述的防治慢性盆腔炎的双相胶囊的检测方法包括鉴别和含量测定项目；其中鉴别是对胶囊制剂中的白头翁、香附、苍术、牛膝、黄柏、蛇床子的薄层色谱鉴别；含量测定是用高效液相色谱法分别测定制剂中α-香附酮、苍术素、白头翁皂苷B4、盐酸小檗碱的含量。
前述的防治慢性盆腔炎的双相胶囊的检测方法中，具体鉴别方法为：
（1）白头翁的薄层色谱鉴别：取本制剂内容物颗粒0.72g，加甲醇20mL，超声使溶解，滤过，滤液置水浴上蒸干，残渣加水30mL使溶解，用水饱和的正丁醇萃取三次，每次30mL，合并正丁醇液，用氨试液洗正丁醇萃取液两次，弃去洗液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇10mL溶解，作为供试品溶液；另取白头翁对照药材1.0g，同法制成对照药材溶液；再取白头翁皂苷B4对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述三种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-醋酸-水=4:1:2的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
（2）香附的薄层色谱鉴别：取本制剂内容物滴丸0.72g，加乙醚5mL，放置1h，时时振摇，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯0.5mL使溶解，作为供试品溶液；取香附对照药材1.0g，同供试品溶液制备法制成对照药材溶液；另取α-香附酮对照品，加乙酸乙酯制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述三种溶液各2μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸=80:1:1为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的深蓝色斑点；
（3）苍术的薄层色谱鉴别：取本制剂内容物滴丸0.96g，加甲醇10mL，超声处理15分钟，滤过，取滤液作为供试品溶液；取苍术对照药材0.8g，同法制成对照药材溶液；另取苍术素对照品，加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液，作为对照品溶液；吸取供试品溶液、对照药材溶液各6μL，对照品溶液2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以60～90℃的石油醚-丙酮=9:2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
（4）牛膝的薄层色谱鉴别：取本制剂内容物颗粒4.8g，加80%甲醇50mL，加热回流3h，滤过，滤液蒸干，残渣加水15mL，微热使溶解，加在内径为1.5cm、柱高15cm的D101大孔吸附树脂柱上，用水100mL洗脱，弃去水液，再用20%乙醇100mL洗脱，弃去洗脱液，继用80%乙醇100mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加80%甲醇1mL使溶解，即为供试品溶液；取牛膝对照药材4.0g，同法制成对照药材溶液；再取β-蜕皮甾酮、人参皂苷Ro对照品，加甲醇分别制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；吸取供试品溶液4～8μL，对照品和对照药材溶液各4μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水-甲酸=7:3:0.5:0.05为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸试液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
（5）黄柏的薄层色谱鉴别：
①黄柏碱：取本制剂内容物颗粒0.24g，加1%醋酸甲醇溶液40mL，于60℃超声处理20分钟，滤过，滤液浓缩至2mL，作为供试品溶液；再取黄柏对照药材0.1g，加1%醋酸甲醇溶液40mL，同法制成对照药材溶液；另取黄柏碱对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述三种溶液各3～5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水=30:15:4的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
②小檗碱：取本制剂内容物颗粒0.12g，研细，加甲醇10mL，加热回流30分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取黄柏对照药材0.05g，加甲醇5mL，同法制成对照药材溶液；再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典附录VIB的薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各1μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-水=6:3:2:1.5:0.3为展开剂，置氨蒸气预饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材和对照色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
（6）蛇床子的薄层色谱鉴别：取本制剂内容物颗粒0.54g，加无水乙醇5mL，超声处理5分钟，放置，取上清液作为供试品溶液；取蛇床子对照药材0.3g，同法制成对照药材溶液；另取蛇床子素对照品，加无水乙醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述三种溶液各2μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-正己烷=3:1:4为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
前述的防治慢性盆腔炎的双相胶囊的检测方法中，具体的含量测定方法为：
（1）白头翁皂苷B4含量测定：参照2010版《中国药典》一部附录ⅥD高效液相色谱法测定：
色谱条件与系统适用性试验：
色谱柱：15×4.6mm，5μm的diamonsilTMC18柱；
流动相：乙腈-水=A:B，0～15min，B体积分数为74%，15～17min，B体积分数为74%～5%，17～35min，B体积分数为5%；
柱温为35℃；流速为1.0mL·min-1；检测波长为201nm；进样量为20μL；理论塔板数N按白头翁皂苷B4峰计算不低于3000；
对照品溶液的制备：精密称取白头翁皂苷B4对照品5.55mg，置于10mL容量瓶中，甲醇稀释并定容至刻度，即得浓度为555.00μg·mL-1的贮备液；精密吸取储备液6mL，置于10mL容量瓶中，甲醇稀释并定容至刻度，即得浓度为333.00μg·mL-1的对照品溶液；
供试品溶液的制备：精密称取胶囊内容物颗粒20mg，置10mL容量瓶中，加甲醇至刻度的2/3处，采用功率150W、频率40KHz的超声10min，冷却至室温，再用甲醇定容至刻度，过0.45μm微孔滤膜，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得；
（2）盐酸小檗碱的含量测定：
色谱条件与系统适用性试验：色谱柱：15×4.6mm，5μm的diamonsilTMC18柱；流动相为乙腈:0.1%磷酸=50:50；柱温为35℃；流速为1.0mL·min-1；检测波长为265nm；进样量为20μL；理论塔板数N按盐酸小檗碱峰计算不小于4000；
对照品溶液的制备：精密称取盐酸小檗碱对照品21.84mg，置于100mL容量瓶中，流动相稀释并定容至刻度，即得浓度为218.40μg·mL-1的贮备液；精密吸取该贮备液1mL，置于10mL容量瓶中，流动相稀释并定容至刻度，摇匀，即得浓度为21.84μg·mL-1对照品溶液；
供试品溶液的制备：精密称取胶囊内容物颗粒10mg，置10mL容量瓶中，加流动相至刻度的2/3处，采用功率150W、频率40KHz的超声10min，冷却至室温，再用流动相定容至刻度，过0.45μm微孔滤膜，即得；
测定法：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得；
（3）苍术素的含量测定：
色谱条件与系统适用性试验：色谱柱：15×4.6mm，5μm的diamonsilTM C18柱；流动相为甲醇-水=74:26；流速为1.0mL·min-1；检测波长为340nm；柱温为25℃；进样量为20μL；理论塔板数N按苍术素峰计算不低于3000；
对照品溶液的制备：精密称取苍术素对照品9.90mg，置于10mL容量瓶中，甲醇稀释并定容至刻度，即得浓度为990.00μg·mL-1的苍术素贮备液；精密吸取该贮备液1.0mL，置于10mL容量瓶中，甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，即得浓度为99.00μg·mL-1对照品溶液；
供试品溶液的制备：取滴丸样品5粒研磨均匀，从中精密称取20mg于10mL容量瓶中，加甲醇至刻度的2/3处，超声至溶解，甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，即得；
测定法：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20μL，测定，即得；
（4）α-香附酮的含量测定：
色谱条件与系统适用性试验：色谱柱：15×4.6mm，5μm的diamonsilTM C18柱；流动相为甲醇-水=74:26；流速为1.0mL·min-1；检测波长为252nm；柱温为25℃；进样量为20μL；理论塔板数N按α-香附酮峰计算不低于3000；
对照品溶液的制备：精密称取α-香附酮对照品79.80mg，置于25mL容量瓶中，乙酸乙酯稀释并定容至刻度，即得浓度为3192.00μg·mL-1的α-香附酮贮备液；精密吸取该贮备液0.05mL，置于10mL容量瓶中，乙酸乙酯稀释并定容至刻度，摇匀，即得浓度为15.96μg·mL-1对照品溶液；
供试品溶液的制备：取滴丸样品5粒研磨均匀，从中精密称取20mg于10mL容量瓶中，加甲醇至刻度的2/3处，超声至溶解，甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，即得；
测定法：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20μL，测定，即得。
本发明所述的检测方法包括：
（一）鉴别：
（1）白头翁的薄层色谱鉴别：取本制剂内容物颗粒0.72g，加甲醇20mL，超声使溶解，滤过，滤液置水浴上蒸干，残渣加水30mL使溶解，用水饱和的正丁醇萃取三次，每次30mL，合并正丁醇液，用氨试液洗正丁醇萃取液两次，弃去洗液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇10mL溶解，作为供试品溶液；另取白头翁对照药材1.0g，同法制成对照药材溶液；再取白头翁皂苷B4对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述三种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-醋酸-水=4:1:2的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
（2）香附的薄层色谱鉴别：取本制剂内容物滴丸0.72g，加乙醚5mL，放置1h，时时振摇，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯0.5mL使溶解，作为供试品溶液；取香附对照药材1.0g，同供试品溶液制备法制成对照药材溶液；另取α-香附酮对照品，加乙酸乙酯制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述三种溶液各2μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸=80:1:1为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的深蓝色斑点；
（3）苍术的薄层色谱鉴别：取本制剂内容物滴丸0.96g，加甲醇10mL，超声处理15分钟，滤过，取滤液作为供试品溶液；取苍术对照药材0.8g，同法制成对照药材溶液；另取苍术素对照品，加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液，作为对照品溶液；吸取供试品溶液、对照药材溶液各6μL，对照品溶液2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以60～90℃的石油醚-丙酮=9:2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
（4）牛膝的薄层色谱鉴别：取本制剂内容物颗粒4.8g，加80%甲醇50mL，加热回流3h，滤过，滤液蒸干，残渣加水15mL，微热使溶解，加在内径为1.5cm、柱高15cm的D101大孔吸附树脂柱上，用水100mL洗脱，弃去水液，再用20%乙醇100mL洗脱，弃去洗脱液，继用80%乙醇100mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加80%甲醇1mL使溶解，即为供试品溶液；取牛膝对照药材4.0g，同法制成对照药材溶液；再取β-蜕皮甾酮、人参皂苷Ro对照品，加甲醇分别制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；吸取供试品溶液4～8μL，对照品和对照药材溶液各4μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水-甲酸=7:3:0.5:0.05为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸试液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
（5）黄柏的薄层色谱鉴别：
①黄柏碱：取本制剂内容物颗粒0.24g，加1%醋酸甲醇溶液40mL，于60℃超声处理20分钟，滤过，滤液浓缩至2mL，作为供试品溶液；再取黄柏对照药材0.1g，加1%醋酸甲醇溶液40mL，同法制成对照药材溶液；另取黄柏碱对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述三种溶液各3～5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水=30:15:4的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
②小檗碱：取本制剂内容物颗粒0.12g，研细，加甲醇10mL，加热回流30分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取黄柏对照药材0.05g，加甲醇5mL，同法制成对照药材溶液；再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典附录VIB的薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各1μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-水=6:3:2:1.5:0.3为展开剂，置氨蒸气预饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材和对照色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
（6）蛇床子的薄层色谱鉴别：取本制剂内容物颗粒0.54g，加无水乙醇5mL，超声处理5分钟，放置，取上清液作为供试品溶液；取蛇床子对照药材0.3g，同法制成对照药材溶液；另取蛇床子素对照品，加无水乙醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述三种溶液各2μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-正己烷=3:1:4为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
（二）含量测定：
（1）白头翁皂苷B4含量测定：参照2010版《中国药典》一部附录ⅥD高效液相色谱法测定：
色谱条件与系统适用性试验：
色谱柱：15×4.6mm，5μm的diamonsilTMC18柱；
流动相：乙腈-水=A:B，0～15min，B体积分数为74%，15～17min，B体积分数为74%～5%，17～35min，B体积分数为5%；
柱温为35℃；流速为1.0mL·min-1；检测波长为201nm；进样量为20μL；理论塔板数N按白头翁皂苷B4峰计算不低于3000；
对照品溶液的制备：精密称取白头翁皂苷B4对照品5.55mg，置于10mL容量瓶中，甲醇稀释并定容至刻度，即得浓度为555.00μg·mL-1的贮备液；精密吸取储备液6mL，置于10mL容量瓶中，甲醇稀释并定容至刻度，即得浓度为333.00μg·mL-1的对照品溶液；
供试品溶液的制备：精密称取胶囊内容物颗粒20mg，置10mL容量瓶中，加甲醇至刻度的2/3处，采用功率150W、频率40KHz的超声10min，冷却至室温，再用甲醇定容至刻度，过0.45μm微孔滤膜，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得；
（2）盐酸小檗碱的含量测定：
色谱条件与系统适用性试验：色谱柱：15×4.6mm，5μm的diamonsilTMC18柱；流动相为乙腈:0.1%磷酸=50:50；柱温为35℃；流速为1.0mL·min-1；检测波长为265nm；进样量为20μL；理论塔板数N按盐酸小檗碱峰计算不小于4000；
对照品溶液的制备：精密称取盐酸小檗碱对照品21.84mg，置于100mL容量瓶中，流动相稀释并定容至刻度，即得浓度为218.40μg·mL-1的贮备液；精密吸取该贮备液1mL，置于10mL容量瓶中，流动相稀释并定容至刻度，摇匀，即得浓度为21.84μg·mL-1对照品溶液；
供试品溶液的制备：精密称取胶囊内容物颗粒10mg，置10mL容量瓶中，加流动相至刻度的2/3处，采用功率150W、频率40KHz的超声10min，冷却至室温，再用流动相定容至刻度，过0.45μm微孔滤膜，即得；
测定法：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得；
（3）苍术素的含量测定：
色谱条件与系统适用性试验：色谱柱：15×4.6mm，5μm的diamonsilTM C18柱；流动相为甲醇-水=74:26；流速为1.0mL·min-1；检测波长为340nm；柱温为25℃；进样量为20μL；理论塔板数N按苍术素峰计算不低于3000；
对照品溶液的制备：精密称取苍术素对照品9.90mg，置于10mL容量瓶中，甲醇稀释并定容至刻度，即得浓度为990.00μg·mL-1的苍术素贮备液；精密吸取该贮备液1.0mL，置于10mL容量瓶中，甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，即得浓度为99.00μg·mL-1对照品溶液；
供试品溶液的制备：取滴丸样品5粒研磨均匀，从中精密称取20mg于10mL容量瓶中，加甲醇至刻度的2/3处，超声至溶解，甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，即得；
测定法：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20μL，测定，即得；
（4）α-香附酮的含量测定：
色谱条件与系统适用性试验：色谱柱：15×4.6mm，5μm的diamonsilTM C18柱；流动相为甲醇-水=74:26；流速为1.0mL·min-1；检测波长为252nm；柱温为25℃；进样量为20μL；理论塔板数N按α-香附酮峰计算不低于3000；
对照品溶液的制备：精密称取α-香附酮对照品79.80mg，置于25mL容量瓶中，乙酸乙酯稀释并定容至刻度，即得浓度为3192.00μg·mL-1的α-香附酮贮备液；精密吸取该贮备液0.05mL，置于10mL容量瓶中，乙酸乙酯稀释并定容至刻度，摇匀，即得浓度为15.96μg·mL-1对照品溶液；
供试品溶液的制备：取滴丸样品5粒研磨均匀，从中精密称取20mg于10mL容量瓶中，加甲醇至刻度的2/3处，超声至溶解，甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，即得；
测定法：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20μL，测定，即得。
为确保本发明制备方法科学、合理、可行，申请人对挥发油滴丸和提取物颗粒的处方及成型工艺进行筛选与优化。
（一）试药与仪器
1、试药：对照品：白头翁皂苷B4（批号111766-200601）、盐酸小檗碱（批号110713-200910）、苍术素（批号111924-201001）购自中国药品生物制品检定所；α-香附酮（批号：1004-090618）购自中药固体制剂制造技术国家工程研究中心。PEG4000、PEG6000、PEG10000、PEG20000（化学纯，国药集团化学试剂有限公司）；十二烷基硫酸钠（SDS，化学纯，国药集团化学试剂有限公司）；微晶纤维素（MCC）、微粉硅胶、淀粉、乳糖、低取代羟丙基纤维素（L-HPC）均购自湖州展望药业化学有限公司。乙腈、甲醇（色谱纯，美国天地化学试剂有限公司），其他试剂均为分析纯。
2、仪器：高效液相色谱仪（配备SPD-M20A型二极管阵列检测器，LC-20AT型泵，CTO-10AS vp型温控柱温箱，LC solution型色谱工作站，日本岛津仪器公司）；电子分析天平（starorious）；水浴锅（巩义市英裕予华仪器厂）；滴丸机（烟台康达尔有限公司）。
（二）滴丸的制备
1、滴丸的评价指标
（1）硬度
随机抽取6粒滴丸，分别用下法记录其硬度，6粒滴丸测得的硬度均值，记为该组硬度得分，采用4级计分法（最高得分以市售天津天士力制药股份有限公司的藿香正气滴丸为标准）：
1分：差，揉捏即碎；
2分：中等，揉捏数下变软，破碎；
3分：较硬，反复揉捏才碎；
4分：硬，反复揉捏不碎。
（2）圆整度
随机抽取6粒滴丸，每粒滴丸测量三个方向的径向长度，用最短径/最长径即得，取圆整度均值，圆整度公式如下：圆整度（%）=最短径/最长径×100%。
（3）光泽度
随机抽取6粒滴丸，分别用下法记录其光泽度，6粒滴丸测得的光泽度均值，记为该组光泽度得分，采用4级计分法（最高得分以市售天津天士力制药股份有限公司的藿香正气滴丸为标准）：
1分：滴丸颜色极度深浅不一；
2分：滴丸颜色深浅不一；
3分：滴丸颜色基本均一；
4分：滴丸颜色非常均一。
（4）丸重差异系数
按照2010版《中国药典》一部附录滴丸检查项下方法测定。
（5）溶散时限
按照2010版《中国药典》一部附录崩解时限检查项下方法测定。综合评分=硬度/最高值×0.3+圆整度/最高值×0.1+光泽度/最高值×0.1+最低值/丸重差异系数×0.25+最低值/溶散时限×0.25。
2、滴丸制备工艺初步考察
初步制定滴制条件如下：基质置水浴上熔融后再加药物，药液温度70℃，滴距8cm，滴速20d·min-1，冷凝剂二甲基硅油制冷温度15℃，滴头口径2.0/2.5mm·mm-1，进行挥发油滴丸的单因素考察。
（1）基质的选择
滴丸的基质可分为水溶性和脂溶性两大类，聚乙二醇(PEG)是目前较为理想的一类水溶性基质，其溶解性能好，化学性质稳定，无生理活性，可用于释放水溶性及油溶性药物，同时能容纳部分液体药物，且熔点低，具有良好分散力和较大内聚力，以PEG作为基质，能够更好地满足药效成分性质和临床治疗的要求，因此选择PEG作为滴丸基质。
分别考察了PEG4000、PEG6000、PEG10000、PEG20000等基质，在试验过程中，发现PEG4000、PEG6000作基质所得滴丸硬度较小，一捏即碎，故重点考察PEG10000和PEG20000基质，结果见表1。
表1基质对滴丸成型的影响
上表结果可以看出，随着基质中PEG20000比例增大，滴丸硬度变大，但是滴丸的圆整度、光泽度变差，而且溶散时限变长，综合考虑以PEG10000：PEG20000（3:1）为宜。
（2）载药量考察
载药量越小，基质用量越多，滴丸成型性越好，且滴制越容易。但是滴丸载药量小，日服剂量也大，且成本高，不利于大生产。为了尽量减少患者的服用量，必定要尽量增加滴丸的载药量。在预实验的基础上，我们选择了载药量分别为30%、40%、50%、60%、70%来考察滴丸成型情况，结果见表2。
表2载药量对滴丸成型的影响
上表结果可以看出，载药量对滴丸圆整度影响不大。载药量越小，滴丸的硬度越好，丸重差异系数、溶散时限越小，综合评分结果越好。但为了减少患者的服用剂量，综合考虑，载药量定为60%。
（3）冷凝剂选择
水溶性基质常用冷凝剂为二甲基硅油、液体石蜡等。液体石蜡表面张力较大，粘度较小；二甲基硅油表面张力较小，粘度较大（25℃条件下，液体石蜡密度0.860～0.905g·mL-1；二甲基硅油0.960～0.970g·mL-1）。
通过预试可知，以液体石蜡作为冷凝剂时，由于密度较小，滴丸在液体石蜡中下沉速度过快，造成过多链珠状和扁球状滴丸；以二甲基硅油为冷却剂时，滴丸下降速度比较合适，滴丸形状较为规则，成型性好，能够满足滴制的要求，且与挥发油药物无相互作用。综合考虑，故选择二甲基硅油作为冷凝剂。
（4）制冷温度和管口温度考察
滴丸冷凝剂的最低温度为3～5℃，最高温度为室温，一般在10℃左右。我们在此分别考察了制冷温度5、10、15、20℃四个水平滴丸成型情况，结果见表3。
表3制冷温度对滴丸成型影响
试验中发现，制冷温度偏低时，滴丸下降速度减慢易成扁平状；且滴丸骤然变冷，表面粗糙不圆整，或者表面吸附的气泡尚未溢出以致产生空洞。制冷温度15～20℃时，滴丸有逐步收缩成型和释放空气的机会，其中以制冷温度15℃效果最好。
据文献报道，滴丸冷却采用梯度冷却效果好。细究其原因，冷凝剂上部温度略高，滴丸有逐渐收缩成型和释放空气的机会，然后在下部低温冷凝剂中充分冷凝成型。
故在制冷温度15℃的基础上，我们分别考察了管口温度20、25、30三个水平对滴丸成型影响，结果见表4。
表4管口温度对滴丸成型影响
上表结果可以看出，管口温度20℃时，所得滴丸各评价指标均较好，综合评分结果最高。
根据上述试验结果，选择制冷温度15℃、管口温度20℃的梯度冷却方式。
（5）药液温度考察
药液温度偏低，滴入冷却液中时冷凝快，易出现拖尾，圆整度差，且滴制困难；药液温度偏高，挥发性成分易挥发，且药温过高易使滴丸成型不够充分，表面褶皱严重，圆整度降低。故考察药液温度65℃～75℃条件下对滴丸成型情况选择，结果见表5。
表5药液温度对滴丸成型的影响
上表结果可以看出，药液温度70℃时，滴丸各评价指标均较好，且综合评分结果较高，故选择药液温度70℃。
（6）滴距考察
滴距(滴管口与冷却液面之间的距离)对滴丸成型有一定影响，如果滴距过大，会使液滴扁平，或液滴因重力作用被跌散而产生细粒影响滴丸的圆整度；反之，会使液滴来不及成型而影响滴制效果。滴距最小为6cm，在此基础上考察滴距6、8、10cm对滴丸成型情况影响，结果见表6。
表6滴距对滴丸成型的影响
上表结果可以看出，滴距6cm时滴丸成型状况良好，综合评分结果较高，故选择滴距6cm。
（7）滴速考察
滴速对滴丸成型有一定影响。滴速越快，滴丸下降速度越快，获得的初始动能越大，撞击冷凝剂表面的力量越大，滴丸易呈扁平状；且滴速越快，大量的滴丸来不及冷却即聚结到冷凝液底部，滴丸易粘连；反之滴速小，则液滴在滴口处逗留时间较长再下落，易拖尾，而且影响生产效率，不符合实际生产需要。综合考虑，分别考察滴速10、20、30d·min-1时滴丸成型情况，结果见表7。
表7滴速对滴丸成型的影响
上表结果可以看出，滴速20d·min-1时滴丸丸重差异系数较小，且综合评分结果较高（30d·min-1时滴丸丸重差异系数较大，且有少许粘连现象），故选择滴速为20d·min-1。
（8）滴头口径考察
丸重、圆整度与滴头口径有关。在一定范围内，滴头口径越小，丸重越小，滴丸的表面积越大，在冷凝剂中收缩成球体的力量较强，圆整度较好。现有三种不同口径的滴头，分别进行考察，结果见表8。
表8滴头口径对滴丸的影响
上表结果可以看出，滴头口径较小时，滴丸大小均匀，丸重差异系数较小，且综合评分结果较高，故选择滴头口径2.0/2.5mm·mm-1。
（9）滴丸干燥方式考察
滴制完成后，滴丸表面残留有少量冷凝剂，需要进行干燥处理。滴丸的干燥主要有以下方式：自然晾干、低温烘干、石油醚清洗挥干、吸水纸擦干等。我们分别进行了试验，发现自然晾干方式因冷凝剂难以挥发，干燥效果不好；低温烘干，滴丸容易受热变形；石油醚清洗：因石油醚为脂溶性试剂，虽然清洗后滴丸表面光滑，丸型较好，但容易造成溶剂残留；吸水纸擦干，对滴丸外观质量没有影响，且干燥效果好。综合考虑，选择吸水纸擦干的干燥方式。
3、滴丸制备正交试验优化
（1）正交试验安排及结果
经过单因素试验，以滴丸的硬度、圆整度、光泽度、溶散时限及丸重差异系数为指标，确定了主要辅料的类型、用量范围，以及一些成型因素的考查范围。在此基础上选择药液温度、滴距、滴速3个因素，每个因素3个水平，选用L9(34)正交表进行试验，因素水平见表9，正交试验结果及方差分析见表10、11。（其他因素固定：混合基质PEG10000：PEG20000=3:1，载药量60%，待基质水浴熔融后再加入挥发油药物，冷凝剂二甲基硅油制冷温度15℃、管口温度20℃，滴头口径2.0/2.5mm·mm-1，滴丸收集后用吸水纸擦干）。
表9正交试验因素水平表
表10正交试验安排及结果
表11方差分析结果
注：F0.01（2，2）=99.0，F0.05（2，2）=19.0。
由表43直观分析可知，影响因素顺序为B>C>A，即滴距>滴速>药液温度；由表44方差分析结果知，A、B、C因素对综合评分结果均无显著性影响。综合考虑，最佳工艺为A3B2C2，即以药液温度75℃、滴距8cm、滴速20d·min-1进行滴丸滴制（其他因素固定：混合基质PEG10000：PEG20000=3:1，载药量60%，待基质75℃水浴熔融后再加入挥发油药物，冷凝剂二甲基硅油制冷温度15℃、管口温度20℃，滴头口径2.0/2.5mm·mm-1，滴丸收集后用吸水纸擦干）。
（2）滴丸验证试验
选用上述最优处方及滴制工艺制备三批滴丸样品，按《中国药典》2010年版“滴丸”项下的有关规定对滴丸硬度、圆整度、光泽度、溶散时限、丸重差异系数等指标进行测定和考察，结果见表12。
表12滴丸验证试验
最佳工艺验证实验表明，根据优选处方和滴制工艺所滴制得的滴丸质量稳定，重现性好。
4、滴丸中挥发油的含量测定
由于滴丸中挥发油含量丰富，为了保证制剂工艺、稳定性的质量要求，故在此按照挥发油测定法(《中国药典》2010年版一部附录X D甲法)测定滴丸中挥发油得率，收集挥发油，用甲醇稀释一定倍数，进样测定样品中α-香附酮、苍术素的含量，结果见表13。
表13滴丸中挥发油的含量测定（n=3）
5、滴丸体外溶出度试验
（1）平衡溶解度测定
取过量的滴丸粉末数份，分别置于25mL的具塞锥型瓶中，加入0.1moL·L-1HCL、水、pH6.8磷酸缓冲液、0.1%SDS溶液、0.2%SDS溶液、0.5%SDS溶液、0.7%SDS溶液、1.0%SDS溶液，于37℃恒温振荡器中振荡，定时取样，样品经处理后进行HPLC分析，根据标准曲线方程，计算滴丸样品中α-香附酮、苍术素的浓度，直至数值不再增加时的药物浓度即为滴丸的平衡溶解度。结果见表14。
表14α-香附酮和苍术素在不同介质中的平衡溶解度（n=3）
由上表可见，SDS溶液对α-香附酮和苍术素有一定的增溶作用，综合考虑，选择0.5%SDS溶液作为溶出介质即可满足漏槽条件。
（2）溶出测定方法
按中国药典2010年版（二部）小杯法测定，溶出介质：200mL0.5%SDS水溶液，温度：37±0.5℃，转速：100r·min-1。每个溶出杯内放入6粒滴丸（约120mg，相当于一次服药量），分别于5、10、20、30、45、60min取溶出液2mL（取出后迅速补加等量的新鲜介质），经0.45μm微孔滤膜滤过，弃初滤液，取续滤液，进行HPLC分析，根据标准曲线方程，计算溶出样品中α-香附酮、苍术素的浓度并计算其累积溶出百分率。
（3）溶出试验结果
按照（2）项溶出测定方法进行滴丸样品的溶出试验，并计算累积溶出百分率，结果见表15及图8。
表15滴丸的溶出度结果(n=6)
由图8可以看出，取样30min时，滴丸样品中α-香附酮、苍术素成分基本溶出完全，累积溶出百分率均可达80%以上。
6、滴丸的影响因素试验
（1）高温试验
滴丸样品分别置于40℃、60℃温度下放置10天，分别于0、5、10天取样检查，考察滴丸的外观及α-香附酮、苍术素的含量，结果见表16。
表16滴丸高温试验
由上表可见，高温40℃条件下，滴丸样品的外观及主要有效成分的外观无明显变化。高温60℃条件下，滴丸受热融化呈液体状，主要有效成分也呈下降趋势。
（2）高湿试验
滴丸样品精密称重后，在25℃分别置于RH75%（NaCl饱和溶液）和RH92.5%（KNO3饱和溶液）条件下的恒湿干燥器中，放置10天，分别于0、5、10天取样检测，考察滴丸的外观、吸湿性，结果见表17。
表17滴丸高湿试验
由上表可见，高湿度75%及92.5%条件下，滴丸外观发粘，变软，外观发生显著性变化，主要有效成分含量也呈下降趋势。
（3）强光照射试验
滴丸样品室温置于装有日光灯的光照箱内，于照度为4500Lx±500Lx条件下放置10天，在0、5、10天取样检测，考察滴丸的外观及α-香附酮、苍术素的含量，结果见表18。
表18滴丸样品强光试验
由上表可见，光照对挥发油液体的外观无显著影响，主要有效成分的含量显著下降，须避光保存。
（七）提取物颗粒的制备
中药浸膏粉通常具有较强的吸湿性，故直接制粒有一定难度，为了降低其吸湿性以便于制粒，一般加入适量辅料与之混合。故在此以颗粒成型性、休止角、堆密度为考察指标，筛选颗粒的处方及成型工艺。
1、制粒的评价指标
（1）成型率
提取物粉末和辅料混合均匀，制粒，干燥后分别过14目筛与60目筛，收集能通过14目筛而不能通过60目筛的颗粒称重，按下式计算成型率：成型率(%)=通过1号筛而不能通过4号筛的颗粒重/投料量×100%。
（2）休止角
采用漏斗法测定休止角，取适量提取物颗粒，在直径为8.6cm的倒扣在桌面上的培养皿的上中央，高约5cm的位置上，用漏斗慢慢加入提取物颗粒，以粉体自动流出边缘，并形成较稳定的锥形粉末堆为止。测定粉末高度，用excel的反正切函数算出。
（3）堆密度
采用量筒法测定颗粒堆密度，取颗粒5g，置10mL量筒中，于振实仪中重复振动500次后，读取颗粒的容积，计算堆密度。综合评分=成型率/最高值×0.4+最低值/休止角×0.4+堆密度/最高值×0.2。
2、颗粒制备工艺筛选
（1）辅料种类的筛选
提取物稳定性影响因素试验发现浸膏粉具有一定的吸湿性，易结块，流动性差，考虑加入辅料改善浸膏粉的性质，以便于制粒和灌装胶囊。工艺考察中选用淀粉、微晶纤维素、微粉硅胶、乳糖、低取代羟丙基纤维素等辅料，辅料用量10%，投药总量20g，喷入80%乙醇并搅拌混匀，用14目筛网制成湿颗粒，于40℃干燥，并收集通过14目筛而不能通过60目筛的颗粒。以成型率、休止角、堆密度为考察指标，考察辅料种类对浸膏粉性质影响，结果见表19。
表19辅料种类对颗粒成型影响
上表结果可以看出，采用微粉硅胶、低取代羟丙甲纤维素作为辅料所制颗粒各评价指标均较好，综合考虑，选择微粉硅胶、低取代羟丙基纤维素作为混合辅料。
（2）混合辅料比例考察
现考察微粉硅胶和低取代羟丙基纤维素混合比例对颗粒成型的影响，结果见表20。
表20混合辅料比例对颗粒成型影响
上表结果可以看出，微粉硅胶和低取代羟丙基纤维素辅料等比例混合时颗粒成型性、流动性及堆密度均较好，故选择混合辅料等比例混合。
（3）辅料用量考察
辅料用量对颗粒成型有一定影响。一般来说，辅料用量越大，颗粒制备越容易，但是日服剂量也加大，且成本高，不利于大生产。为了尽量减少患者的服用量，在预实验的基础上，我们选择了辅料用量为5%、10%、15%来考察颗粒成型情况，结果见表21。
表21辅料用量对颗粒成型影响
上表结果可以看出，辅料用量10%和15%时，颗粒成型均较好，为了减少患者的服用量，选择辅料用量10%。
（4）润湿剂浓度考察
按比例称取浸膏粉与辅料（微粉硅胶和低取代羟丙基纤维素等比例）适量混匀，并且均分为3份，然后每份分别喷入不同浓度的乙醇搅拌混合，用14目筛网制成湿颗粒，于40℃干燥，以成型率、休止角、堆密度为考察指标，考察其对颗粒成型影响，结果见表22。
表22润湿剂浓度对颗粒成型影响
上表结果可以看出，选择80%乙醇作为润湿剂，颗粒成型效果最好。
（5）润湿剂用量考察
称取3份已混合均匀的粉末，分别加入不同量的80%乙醇溶液，制粒，干燥，以成型率、休止角、堆密度为考察指标，考察其对颗粒成型影响，结果见表23。
表23润湿剂用量对颗粒成型影响
试验过程中发现，润湿剂用量1.5%时，制软材情况及颗粒成型情况均较好，故选择润湿剂用量1.5%。
（6）制粒工艺条件的验证
称取提取物粉末18g，微粉硅胶和低取代羟丙基纤维素各1g，混合均匀，加入约3mL80%乙醇制软材，用14目筛网制成湿颗粒，于40℃干燥，并收集通过14目筛而不能通过60目筛的颗粒。以成型率、休止角、堆密度为考察指标，考察颗粒成型情况，结果见表24。
表24制粒工艺条件的验证
由上表可知，3份样品所制得的颗粒，从成型率、休止角、堆密度上看，重现性好，工艺较为稳定。
3、颗粒体外溶出度试验
（1）平衡溶解度测定
取过量的颗粒粉末数份，分别置于25mL的具塞锥型瓶中，加入0.1moL·L-1HCL、水、pH6.8磷酸缓冲液、0.1%SDS溶液、0.2%SDS溶液、0.5%SDS溶液、1.0%SDS溶液，于37℃恒温振荡器中振荡，定时取样，样品经处理后进行HPLC分析，根据标准曲线方程，计算颗粒样品中白头翁皂苷B4、盐酸小檗碱的浓度，直至数值不再增加时的药物浓度即为颗粒的平衡溶解度。结果见表25。
表25白头翁皂苷B4、盐酸小檗碱在不同介质中的平衡溶解度（n=3）
由上表可见，SDS溶液对白头翁皂苷B4、盐酸小檗碱有一定的增溶作用，综合考虑，选择0.5%SDS溶液作为溶出介质即可满足漏槽条件。
（2）溶出测定方法
按中国药典2010年版（二部）小杯法测定，溶出介质：200mL0.5%SDS水溶液，温度：37±0.5℃，转速：100r·min-1。每个溶出杯内放入1.8g提取物颗粒（约相当于一次服药量），分别于5、10、20、30、45、60min取溶出液2mL（取出后迅速补加等量的新鲜介质），经0.45μm微孔滤膜滤过，弃初滤液，取续滤液，进行HPLC分析，根据标准曲线方程，计算溶出样品中白头翁皂苷B4、盐酸小檗碱的浓度并计算其累积溶出百分率。
（3）溶出试验结果
按照（2）项溶出测定方法进行颗粒样品的溶出试验，并计算累积溶出百分率，结果见表26及图9。
表26颗粒的体外溶出度结果(n=6)
由图9可以看出，取样30min时，颗粒样品中白头翁皂苷B4、盐酸小檗碱累积溶出百分率可达97%、86%，且随着溶出时间延长，累积溶出百分率并无上升趋势。
4、颗粒的影响因素试验
（1）高温试验
颗粒供试品分别置于40℃、60℃温度下放置10天，分别于0、5、10天取样检查，考察颗粒的外观及有效成分的含量，结果见表27。
表27颗粒样品高温试验
由上表可见，高温40℃及60℃对颗粒的外观无显著性影响，但高温60℃时白头翁皂苷B4、盐酸小檗碱的含量呈显著下降趋势。
（2）高湿试验
颗粒供试品精密称重后，在25℃分别置于RH75%（NaCl饱和溶液）和RH92.5%（KNO3饱和溶液）条件下的恒湿干燥器中，放置10天，分别于0、5、10天取样检测。考察颗粒的外观、吸湿性，结果见表28。
表28颗粒样品高湿试验
由上表可见，高湿度75%、92.5%条件下，颗粒的外观均有明显变化，吸湿严重，主要有效成分呈下降趋势。
（3）强光照射试验
颗粒供试品室温置于装有日光灯的光照箱内，于照度为4500Lx±500Lx条件下放置10天，在0、5、10天取样检测，考察提取物的外观及三个指标成分的含量，结果见表29。
表29颗粒样品强光试验
由上表可见，光照使颗粒外观颜色变深，有效成分含量均呈下降趋势。
（八）防治慢性盆腔炎的双相胶囊制剂的制备
防治慢性盆腔炎的双相胶囊是指将香附、苍术经超临界萃取的挥发油成分制成小型滴丸，浸出物制成颗粒，再把小滴丸和颗粒等定量装入同一硬胶囊中。防治慢性盆腔炎的双相胶囊的规格为每粒含提取物颗粒300mg、挥发油0.012mL（1粒滴丸，约20mg），共同装填于1号硬胶囊中。
（九）制剂影响因素试验
1、高温试验
制剂供试品分别置于40℃、60℃温度下放置10天，分别于0、5、10天取样检查，考察供试品外观及主要有效成分成分的含量，结果见表30。
表30制剂高温试验
由上表可见，高温40℃对制剂的外观和含量均无显著性影响。高温60℃条件下，滴丸和颗粒粘连成块，含量显著下降。
2、高湿试验
制剂供试品精密称重后，在25℃分别置于RH75%（NaCl饱和溶液）和RH92.5%（KNO3饱和溶液）条件下的恒湿干燥器中，放置10天，分别于0、5、10天取样检测。结果见表31。
表31制剂高湿试验
由上表可见，高湿度75%、92.5%条件下，制剂的颗粒和滴丸粘连成块，吸湿严重，主要有效成分含量均呈下降趋势。
3、强光照射试验
制剂供试品室温置于装有日光灯的光照箱内，于照度为4500Lx±500Lx条件下放置10天，在0、5、10天取样检测，考察制剂的外观及指标成分的含量，结果见表32。
表32制剂强光试验
由上表可见，光照对制剂的外观无显著影响，但主要有效成分的含量呈下降趋势，故制剂应避光保存。
另外，为了确保本发明含量检测方法科学、合理、可行，申请人进行了一系列系统适用性试验和方法学考察。
（一）仪器与试药
1、试药：对照品：白头翁皂苷B4（批号111766-200601）、α-香附酮（批号110748-200709）、盐酸小檗碱（批号110713-200910）、蛇床子素（批号110822-200305）、β-蜕皮甾酮（批号111638-200402）、苍术素（批号111924-201001）购自中国药品生物制品检定所；人参皂苷Ro（批号34367-04-9）、黄柏碱（批号6873-13-8）购自中药固体制剂制造技术国家工程研究中心。对照药材：香附（批号121059-200706）、苍术（批号120932-200405）、牛膝（批号121066-200504）、黄柏（批号121510-200703）、蛇床子（批号121030-200405）均购自中国药品生物制品检定所。饮片：白头翁购自吴江上海蔡同德堂中药饮片有限公司；十二烷基磺酸钠（SDS，化学纯，上海凌峰化学试剂有限公司）。乙腈、甲醇（色谱纯，美国天地化学试剂有限公司），其他试剂均为分析纯。
2、仪器：高效液相色谱仪（配备SPD-M20A型二极管阵列检测器，LC-20AT型泵，CTO-10AS vp型温控柱温箱，LC soLution型色谱工作站，日本岛津仪器公司）；KQ-100DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；电子分析天平（starorious）；高速中药粉碎机(上海天谊仪器有限公司)；加热套、水浴锅（巩义市英裕予华仪器厂）；挥发油提取器（广州市医药公司）。
（二）鉴别
1、白头翁
照本发明所述白头翁鉴别方法制得供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液，另取不含白头翁的样品0.72g，同供试品溶液制备法制成阴性对照溶液，吸取上述四种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-醋酸-水（4:1:2）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰，结果见图1（从左到右依次是对照品溶液、供试品溶液、对照药材溶液、阴性对照溶液）。
2、香附
照本发明所述香附鉴别方法制得供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液，另取不含香附的样品0.72g，供试品溶液制备法制成阴性对照溶液。吸取上述四种溶液各2μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸（80:1:1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的深蓝色斑点，阴性样品无干扰，结果见图2（从左到右依次是对照品溶液、供试品溶液、对照药材溶液、阴性对照溶液）。
3、苍术
照本发明所述苍术鉴别方法制得供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液，另取不含苍术的样品0.96g，同供试品溶液制备法制成阴性对照溶液。吸取供试品溶液、对照药材溶液、阴性样品溶液各6μL，对照品溶液2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）-丙酮（9:2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰，结果见图3（从左到右依次是对照品溶液、供试品溶液、对照药材溶液、阴性对照溶液）。
4、牛膝
照本发明所述牛膝鉴别方法制得供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液，另取不含牛膝的样品4.8g，同供试品溶液制备法制成阴性对照溶液。吸取供试品溶液、阴性对照溶液各4～8μL，对照品和对照药材溶液各4μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水-甲酸（7:3:0.5:0.05）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸试液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰，结果见图4（从左到右依次是β-蜕皮甾酮对照品溶液、人参皂苷Ro对照品溶液、供试品溶液、对照药材溶液、阴性对照溶液）。
5、黄柏
（1）黄柏碱TLC
照本发明所述黄柏碱鉴别方法制得供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液，另取不含黄柏的样品0.24g，同供试品溶液制备法制成阴性对照溶液。吸取上述四种溶液各3～5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（30:15:4）的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰，结果见图5（从左到右依次是对照品溶液、供试品溶液、对照药材溶液、阴性对照溶液）。
（2）小檗碱TLC
照本发明所述小檗碱鉴别方法制得供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液，同供试品溶液制备法制成阴性对照溶液，吸取上述四种溶液各1μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-水（6:3:2:1.5:0.3）为展开剂，置氨蒸气预饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材和对照色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰，结果见图6（从左到右依次是对照品溶液、供试品溶液、对照药材溶液、阴性对照溶液）。
6、蛇床子
照本发明所述蛇床子鉴别方法制得供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液，再取不含蛇床子的样品0.54g，同供试品溶液制备法制成阴性对照溶液。吸取上述四种溶液各2μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-正己烷（3:1:4）为展开剂，展开，取出，晾干，紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰，结果见图7（从左到右依次是对照品溶液、供试品溶液、对照药材溶液、阴性对照溶液）。
（三）含量测定
1、白头翁皂苷B4含量测定
（1）色谱条件与系统适用性试验：色谱柱：diamonsilTMC18柱（15×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈（A）-水（B），梯度程序：0～15min，B体积分数为74%；15～17min，B体积分数为74%～5%；17～35min，B体积分数为5%。柱温：35℃；流速：1.0mL·min-1；检测波长：201nm；进样量：20μL。按白头翁皂苷B4峰计算，理论塔板数（N）在3000以上。
（2）对照品溶液的配制
精密称取白头翁皂苷B4对照品5.55mg，置于10mL容量瓶中，甲醇稀释并定容至刻度，即得浓度为555.00μg·mL-1的贮备液。精密吸取储备液6mL，置于10mL容量瓶中，甲醇稀释并定容至刻度，即得浓度为333.00μg·mL-1的溶液。
（3）供试品溶液及阴性对照溶液的配制
供试品溶液：精密称取胶囊内容物颗粒20mg，置10mL容量瓶中，加甲醇至刻度的2/3处，超声（功率150W，频率40KHz）10min后，冷却至室温，再用甲醇定容至刻度，过0.45μm微孔滤膜，即得。
阴性对照溶液：按照处方量称取除提取物粉末以外的各辅料溶于流动相中，配成0.2mg/mL的阴性对照溶液。
（4）专属性试验
精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各20μL，进样测定。在选定色谱条件下，白头翁皂苷B4与样品中其它组分色谱峰可基线分离，分离度大于1.5，阴性对照溶液无干扰，色谱图见图10、11、12。
（5）标准曲线的绘制
精密吸取一定量的333.00μg·mL-1白头翁皂苷B4对照品溶液，以甲醇配制成浓度分别为5.20、10.41、20.81、41.63、83.25、166.50、333.00μg·mL-1的系列标准溶液。将上述系列标准溶液各进样20μL，测定白头翁皂苷B4的峰面积。以白头翁皂苷B4浓度（C，μg·mL-1）为横坐标，以峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程：A=6124C+3569.2，相关系数r=0.9999，线性范围为5.20～333.00μg·mL-1。
（6）精密度试验
取白头翁皂苷B4标准溶液（166.50μg·mL-1）连续进样6次，得白头翁皂苷B4峰面积的RSD为0.97%，表明方法精密度良好，结果见表33。
表33精密度试验结果
（7）稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液20μL，分别于0、2、4、6、8h进样。经考察，供试品溶液8h稳定性良好，白头翁皂苷B4峰面积的RSD为0.42%，结果见表34。
表34稳定性试验结果
（8）重复性试验
取同一批内容物颗粒样品，按供试品溶液制备方法分别配制6份供试品溶液，进样20μL，经考察，白头翁皂苷B4峰面积的RSD为1.21%，表明该方法重复性良好，结果见表35。
表35重复性试验结果
（9）加样回收率试验
精密称取已知白头翁皂苷B4含量的内容物颗粒样品10mg，共6份，分别精密加入相当于上述样品中白头翁皂苷B4对照品溶液，制备加样回收样品溶液，进样20μL测定加入的白头翁皂苷B4的量，回收率的结果见表36，表明该方法的回收率良好。
表36加样回收率试验结果
2、α-香附酮、苍术素含量测定
（1）色谱条件：色谱柱：diamonsilTM C18柱（15×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-水（74:26）；流速：1.0mL·min-1；检测波长：252nm（α-香附酮）；340nm（苍术素）；柱温：25℃；进样量：20μL。
（2）对照品溶液的配制
α-香附酮对照品溶液：精密称取α-香附酮对照品79.80mg，置于25mL容量瓶中，乙酸乙酯稀释并定容至刻度，即得浓度为3192.00μg·mL-1的α-香附酮贮备液。精密吸取该贮备液0.05mL，置于10mL容量瓶中，乙酸乙酯稀释并定容至刻度，摇匀，即得浓度为15.96μg·mL-1对照品溶液。
苍术素对照品溶液：精密称取苍术素对照品9.90mg，置于10mL容量瓶中，甲醇稀释并定容至刻度，即得浓度为990.00μg·mL-1的苍术素贮备液。精密吸取该贮备液1.0mL，置于10mL容量瓶中，甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，即得浓度为99.00μg·mL-1对照品溶液。
（3）供试品溶液及阴性对照溶液的配制
供试品溶液：取滴丸样品5粒研磨均匀，从中精密称取20mg于10mL容量瓶中，加甲醇至刻度的2/3处，超声至溶解，甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，即得。
阴性对照溶液：按照处方量称取除挥发油液体以外的各辅料溶于甲醇中，配成0.2mg/mL的阴性对照溶液。
（4）专属性试验
精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各20μL，进样测定。在选定色谱条件下，α-香附酮、苍术素与样品中其它组分色谱峰可基线分离，分离度大于1.5，阴性对照溶液无干扰，色谱图见图13-18（1α-香附酮，2苍术素）。
（5）标准曲线的绘制
精密吸取一定量的15.96μg/mLα-香附酮对照品溶液，以乙酸乙酯配制成浓度分别为0.25、0.5、1.0、2.0、3.99、7.98、15.96μg·mL-1的系列标准溶液。将上述系列标准溶液各进样20μL，252nm下测定α-香附酮的峰面积。以α-香附酮的浓度（C，μg·mL-1）为横坐标，以峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程：A=99290C-8222，相关系数r=0.9999，线性范围为0.25～15.96μg·mL-1。
精密吸取一定量的99.00μg·mL-1苍术素对照品溶液，以甲醇配制成浓度分别为1.55、3.09、6.19、12.38、24.75、49.50、99.00μg·mL-1的系列标准溶液。将上述系列标准溶液各进样20μL，340nm下测定苍术素的峰面积。以苍术素的浓度（C，μg·mL-1）为横坐标，以峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程：A=165175C-130341，相关系数r=0.9999，线性范围为1.55～99.00μg·mL-1。
（6）精密度试验
取α-香附酮标准溶液（7.98μg·mL-1）和苍术素标准溶液（49.50μg·mL-1），连续进样6次，得α-香附酮、苍术素峰面积的RSD分别为0.44%、0.98%，表明方法精密度良好，结果见表37。
表37精密度试验结果
（7）稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液20μL，分别于0、2、4、6、8h进样。经考察，供试品溶液8h稳定性良好，α-香附酮、苍术素峰面积的RSD分别为1.92%、1.45%，结果见表38。
表38稳定性试验结果
（8）重复性试验
取同一批滴丸样品，按供试品溶液制备方法分别配制6份供试品溶液，进样20μL，经考察，α-香附酮、苍术素峰面积的RSD分别为1.79%、1.83%，表明该方法重复性良好，结果见表39。
表39重复性试验结果
（9）加样回收率试验
精密称取已知α-香附酮、苍术素含量的滴丸样品10mg，共6份，分别精密加入相当于上述样品中含量的α-香附酮、苍术素对照品溶液，制备加样回收样品溶液，进样20μL测定加入的α-香附酮、苍术素的量，回收率的结果见表40，表明该方法的回收率良好。
表40加样回收率试验结果
3、盐酸小檗碱含量测定
（1）色谱条件与系统适用性试验
色谱柱：diamonsilTMC18柱（15×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈:0.1%磷酸=50:50（每100mL含0.1g十二烷基磺酸钠）；柱温为35℃；流速为1.0mL·min-1；检测波长为265nm；进样量为20μL；理论塔板数N按盐酸小檗碱峰计算不小于4000。
（2）对照品溶液的配制
精密称取盐酸小檗碱对照品21.84mg，置于100mL容量瓶中，流动相稀释并定容至刻度，即得浓度为218.40μg·mL-1的贮备液。精密吸取该贮备液1mL，置于10mL容量瓶中，流动相稀释并定容至刻度，摇匀，即得浓度为21.84μg·mL-1对照品溶液。
（3）供试品溶液及阴性对照溶液的配制
供试品溶液：精密称取胶囊内容物颗粒10mg，置10mL容量瓶中，加流动相至刻度的2/3处，超声（功率150W，频率40KHz）10min后，冷却至室温，再用流动相定容至刻度，过0.45μm微孔滤膜，即得。
阴性对照溶液：按照处方量称取除提取物粉末以外的各辅料溶于流动相中，配成0.2mg/mL的阴性对照品溶液。
（4）专属性试验
精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各20μL，进样测定。在选定色谱条件下，盐酸小檗碱与样品中其它组分色谱峰可基线分离，分离度大于1.5，阴性对照溶液无干扰，色谱图见图19-21（1盐酸小檗碱）。
（5）标准曲线的绘制
精密吸取一定量的21.84μg·mL-1盐酸小檗碱对照品溶液，以流动相配制成浓度分别为1.37、2.73、5.46、10.92、21.84μg·mL-1的系列标准溶液。将上述系列标准溶液各进样20μL，测定盐酸小檗碱的峰面积。以盐酸小檗碱浓度（C，μg·mL-1）为横坐标，以峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程：A=79625C+27463，相关系数r=0.9999，线性范围为1.37～21.84μg·mL-1。
（6）精密度试验
取盐酸小檗碱标准溶液（10.92μg·mL-1）连续进样6次，得盐酸小檗碱峰面积的RSD为0.37%，表明方法精密度良好，结果见表41。
表41精密度试验结果
（7）稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液20μL，分别于0、2、4、6、8h进样。经考察，供试品溶液8h稳定性良好，盐酸小檗碱峰面积的RSD为1.16%，结果见表42。
表42稳定性试验结果
（8）重复性试验
取同一批内容物颗粒样品，按供试品溶液制备方法分别配制6份供试品溶液，进样20μL，经考察，盐酸小檗碱峰面积的RSD为1.16%，表明该方法重复性良好，结果见表43。
表43重复性试验结果
（9）加样回收率试验
精密称取已知盐酸小檗碱含量的内容物颗粒样品5mg，共6份，分别精密加入相当于上述样品中盐酸小檗碱含量的盐酸小檗碱对照品溶液，制备加样回收样品溶液，进样20μL测定加入的盐酸小檗碱的量，回收率的结果见表44，表明该方法的回收率良好。
表44加样回收率试验结果
（四）体外溶出度试验
1、试验方法
按中国药典2010年版（二部）小杯法测定，溶出介质：200mL0.5%SDS水溶液，温度：37±0.5℃，转速：100r·min-1。每个溶出杯内放入滴丸6粒（约120mg）和提取物颗粒1.8g，分别于5、10、20、30、45、60min取溶出液2mL（取出后迅速补加等量的新鲜介质），经0.45μm微孔滤膜滤过，弃初滤液，取续滤液，进行HPLC分析，根据标准曲线方程，计算溶出样品中白头翁皂苷B4、盐酸小檗碱、α-香附酮、苍术素的浓度并计算其累积溶出百分率。
2、结果讨论
表45制剂体外溶出度试验结果（n=6）
以取样时间为横坐标，以白头翁皂苷B4、α-香附酮、苍术素、盐酸小檗碱的累积溶出百分率为纵坐标作图，得溶出曲线，结果见图22。
图22结果可以看出，制剂溶出30min时，白头翁皂苷B4、α-香附酮、苍术素、盐酸小檗碱指标性成分基本溶出完全，累积溶出百分率达80%以上。
（五）加速试验和长期试验
表46加速试验和长期试验结果
由上表数据可以看出，加速试验（0～6月）：白头翁皂苷B4转移率结果从50.58%降至44.5%，下降了6.08%；盐酸小檗碱转移率结果从51.02%降至50.6%，下降了0.42%，基本稳定；蛇床子素转移率结果从40.33%降至38.06%，下降了2.27%。长期试验（0～6月）：白头翁皂苷B4转移率结果从50.58%降至44.39%，下降了6.19%；盐酸小檗碱转移率结果从51.02%降至50.97%，下降了0.03%，基本稳定；蛇床子素转移率结果从40.33%降至37.95%，下降了2.38%。
与现有技术相比，申请人通过创造性劳动对防治慢性盆腔炎的双相胶囊的处方及制备工艺进行改进，使得药材中防治慢性盆腔炎的主要活性物质提取更为充分，其临床疗效更好；而且，又针对改进后的防治慢性盆腔炎的双相胶囊建立了系统的、完整的、有效的质量检测方法，采用薄层色谱法对制剂中有效成分进行了鉴别，并采用HPLC法建立了制剂中白头翁皂苷B4、α-香附酮、苍术素、盐酸小檗碱的含量测定方法；所建立的方法能准确、快速地对防治慢性盆腔炎的双相胶囊制剂进行定性、定量检测，可用于该制剂质量控制；制剂的体外溶出度结果表明，以0.5%SDS溶液作为溶出介质，转速100r·min-1时，防治慢性盆腔炎的双相胶囊在30min基本溶出完全，主要有效成分的累积溶出百分率在80%以上；所述检测方法的专属性强，精密度高，重现性好，回收率高，测量结果准确，达到了有效控制药物质量的目的，从而确保了产品质量的稳定以及临床用药的安全、有效。
附图说明
图1～图7依次是白头翁、香附、苍术、牛膝、黄柏（黄柏碱）、黄柏（小檗碱）、蛇床子TLC鉴别图；
图8、图9分别是滴丸样品、颗粒样品的溶出试验曲线图（n=6，X±S）；
图10、图11、图12分别是制剂中阴性对照溶液、白头翁皂苷B4对照品溶液、供试品溶液色谱图；
图13～图15分别是α-香附酮、苍术素含量测定中阴性对照溶液、对照品溶液、供试品溶液在波长252nm的色谱图；
图16～图18分别是α-香附酮、苍术素含量测定中阴性对照溶液、对照品溶液、供试品溶液在波长340nm的色谱图；
图19～图21分别是制剂中阴性对照溶液、盐酸小檗碱对照品、供试品的色谱图；
图22是防治慢性盆腔炎的双相胶囊制剂的体外溶出曲线图（n=6，X±S）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：称取白头翁20g、香附20g、怀牛膝12g、苍术12g、黄柏8g、蛇床子8g；将香附、苍术两味药材粉碎成粗粉后采用超临界CO2流体萃取，收集挥发油制成小型滴丸，其混合基质PEG10000：PEG20000=3:1，载药量60%，待基质75℃水浴熔融后加入挥发油药物，药液温度75℃，采用冷凝剂二甲基硅油，制冷温度15℃、管口温度20℃，滴头口径2.0/2.5mm·mm-1，滴距8cm，滴速20d·min-1，滴丸收集后用吸水纸擦干；香附、苍术经萃取后的残渣与黄柏、怀牛膝、白头翁和蛇床子素粗粉混合后采用乙醇渗漉提取，将提取物干膏与辅料微粉硅胶、低取代羟丙基纤维素混合均匀，微粉硅胶和低取代羟丙基纤维素用量各占投药量的5%，加入1.5%体积的80%乙醇制软材，用14目筛网制成湿颗粒，于40℃干燥，并收集通过14目筛而不能通过60目筛的颗粒；最后将小滴丸和颗粒等定量装入同一硬胶囊中，即得。防治慢性盆腔炎的双相胶囊的规格为每粒含提取物颗粒300mg、挥发油0.012mL（1粒滴丸，约20mg），共同装填于1号硬胶囊中。
实施例2：本发明所述防治慢性盆腔炎的双相胶囊的完整检测方法为：
鉴别：（1）白头翁的薄层色谱鉴别：取本制剂内容物颗粒0.72g，加甲醇20mL，超声使溶解，滤过，滤液置水浴上蒸干，残渣加水30mL使溶解，用水饱和的正丁醇萃取三次，每次30mL，合并正丁醇液，用氨试液洗正丁醇萃取液两次，弃去洗液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇10mL溶解，作为供试品溶液；另取白头翁对照药材1.0g，同法制成对照药材溶液；再取白头翁皂苷B4对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述三种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-醋酸-水=4:1:2的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
（2）香附的薄层色谱鉴别：取本制剂内容物滴丸0.72g，加乙醚5mL，放置1h，时时振摇，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯0.5mL使溶解，作为供试品溶液；取香附对照药材1.0g，同供试品溶液制备法制成对照药材溶液；另取α-香附酮对照品，加乙酸乙酯制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述三种溶液各2μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸=80:1:1为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的深蓝色斑点；
（3）苍术的薄层色谱鉴别：取本制剂内容物滴丸0.96g，加甲醇10mL，超声处理15分钟，滤过，取滤液作为供试品溶液；取苍术对照药材0.8g，同法制成对照药材溶液；另取苍术素对照品，加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液，作为对照品溶液；吸取供试品溶液、对照药材溶液各6μL，对照品溶液2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以60～90℃的石油醚-丙酮=9:2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
（4）牛膝的薄层色谱鉴别：取本制剂内容物颗粒4.8g，加80%甲醇50mL，加热回流3h，滤过，滤液蒸干，残渣加水15mL，微热使溶解，加在内径为1.5cm、柱高15cm的D101大孔吸附树脂柱上，用水100mL洗脱，弃去水液，再用20%乙醇100mL洗脱，弃去洗脱液，继用80%乙醇100mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加80%甲醇1mL使溶解，即为供试品溶液；取牛膝对照药材4.0g，同法制成对照药材溶液；再取β-蜕皮甾酮、人参皂苷Ro对照品，加甲醇分别制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；吸取供试品溶液4～8μL，对照品和对照药材溶液各4μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水-甲酸=7:3:0.5:0.05为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸试液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
（5）黄柏的薄层色谱鉴别：
①黄柏碱：取本制剂内容物颗粒0.24g，加1%醋酸甲醇溶液40mL，于60℃超声处理20分钟，滤过，滤液浓缩至2mL，作为供试品溶液；再取黄柏对照药材0.1g，加1%醋酸甲醇溶液40mL，同法制成对照药材溶液；另取黄柏碱对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述三种溶液各3～5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水=30:15:4的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
②小檗碱：取本制剂内容物颗粒0.12g，研细，加甲醇10mL，加热回流30分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取黄柏对照药材0.05g，加甲醇5mL，同法制成对照药材溶液；再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典附录VIB的薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各1μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-水=6:3:2:1.5:0.3为展开剂，置氨蒸气预饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材和对照色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
（6）蛇床子的薄层色谱鉴别：取本制剂内容物颗粒0.54g，加无水乙醇5mL，超声处理5分钟，放置，取上清液作为供试品溶液；取蛇床子对照药材0.3g，同法制成对照药材溶液；另取蛇床子素对照品，加无水乙醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述三种溶液各2μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-正己烷=3:1:4为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
含量测定：（1）白头翁皂苷B4含量测定：参照2010版《中国药典》一部附录ⅥD高效液相色谱法测定：
色谱条件与系统适用性试验：
色谱柱：15×4.6mm，5μm的diamonsilTMC18柱；
流动相：乙腈-水=A:B，0～15min，B体积分数为74%，15～17min，B体积分数为74%～5%，17～35min，B体积分数为5%；
柱温为35℃；流速为1.0mL·min-1；检测波长为201nm；进样量为20μL；理论塔板数N按白头翁皂苷B4峰计算不低于3000；
对照品溶液的制备：精密称取白头翁皂苷B4对照品5.55mg，置于10mL容量瓶中，甲醇稀释并定容至刻度，即得浓度为555.00μg·mL-1的贮备液；精密吸取储备液6mL，置于10mL容量瓶中，甲醇稀释并定容至刻度，即得浓度为333.00μg·mL-1的对照品溶液；
供试品溶液的制备：精密称取胶囊内容物颗粒20mg，置10mL容量瓶中，加甲醇至刻度的2/3处，采用功率150W、频率40KHz的超声10min，冷却至室温，再用甲醇定容至刻度，过0.45μm微孔滤膜，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得；
（2）盐酸小檗碱的含量测定：
色谱条件与系统适用性试验：色谱柱：15×4.6mm，5μm的diamonsilTMC18柱；流动相为乙腈:0.1%磷酸=50:50；柱温为35℃；流速为1.0mL·min-1；检测波长为265nm；进样量为20μL；理论塔板数N按盐酸小檗碱峰计算不小于4000；
对照品溶液的制备：精密称取盐酸小檗碱对照品21.84mg，置于100mL容量瓶中，流动相稀释并定容至刻度，即得浓度为218.40μg·mL-1的贮备液；精密吸取该贮备液1mL，置于10mL容量瓶中，流动相稀释并定容至刻度，摇匀，即得浓度为21.84μg·mL-1对照品溶液；
供试品溶液的制备：精密称取胶囊内容物颗粒10mg，置10mL容量瓶中，加流动相至刻度的2/3处，采用功率150W、频率40KHz的超声10min，冷却至室温，再用流动相定容至刻度，过0.45μm微孔滤膜，即得；
测定法：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得；
（3）苍术素的含量测定：
色谱条件与系统适用性试验：色谱柱：15×4.6mm，5μm的diamonsilTM C18柱；流动相为甲醇-水=74:26；流速为1.0mL·min-1；检测波长为340nm；柱温为25℃；进样量为20μL；理论塔板数N按苍术素峰计算不低于3000；
对照品溶液的制备：精密称取苍术素对照品9.90mg，置于10mL容量瓶中，甲醇稀释并定容至刻度，即得浓度为990.00μg·mL-1的苍术素贮备液；精密吸取该贮备液1.0mL，置于10mL容量瓶中，甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，即得浓度为99.00μg·mL-1对照品溶液；
供试品溶液的制备：取滴丸样品5粒研磨均匀，从中精密称取20mg于10mL容量瓶中，加甲醇至刻度的2/3处，超声至溶解，甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，即得；
测定法：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20μL，测定，即得；
（4）α-香附酮的含量测定：
色谱条件与系统适用性试验：色谱柱：15×4.6mm，5μm的diamonsilTM C18柱；流动相为甲醇-水=74:26；流速为1.0mL·min-1；检测波长为252nm；柱温为25℃；进样量为20μL；理论塔板数N按α-香附酮峰计算不低于3000；
对照品溶液的制备：精密称取α-香附酮对照品79.80mg，置于25mL容量瓶中，乙酸乙酯稀释并定容至刻度，即得浓度为3192.00μg·mL-1的α-香附酮贮备液；精密吸取该贮备液0.05mL，置于10mL容量瓶中，乙酸乙酯稀释并定容至刻度，摇匀，即得浓度为15.96μg·mL-1对照品溶液；
供试品溶液的制备：取滴丸样品5粒研磨均匀，从中精密称取20mg于10mL容量瓶中，加甲醇至刻度的2/3处，超声至溶解，甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，即得；
测定法：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20μL，测定，即得。
Claims (4)
1.一种防治慢性盆腔炎的双相胶囊，其特征在于：它是以白头翁20g、香附20g、怀牛膝12g、苍术12g、黄柏8g、蛇床子8g为原料药，提取后加入微粉硅胶和低取代羟丙基纤维素，并以80%乙醇为润湿剂制成的；其中微粉硅胶和低取代羟丙基纤维素等比例混合，润湿剂的用量为原料药粉末用量的1.5%。
2.如权利要求1所述的防治慢性盆腔炎的双相胶囊的制备方法，其特征在于：将香附、苍术两味药材粉碎成粗粉后采用超临界CO2流体萃取，收集挥发油制成小型滴丸，残渣与黄柏、怀牛膝、白头翁和蛇床子素粗粉混合后采用乙醇渗漉提取，提取物与辅料混合制成颗粒，再把小滴丸和颗粒定量装入同一硬胶囊中；滴丸制备工艺具体如下：混合基质PEG10000：PEG20000=3:1，载药量60%，待基质75 ℃水浴熔融后加入挥发油药物，药液温度75 ℃，采用冷凝剂二甲基硅油，制冷温度15 ℃、管口温度20 ℃，滴头口径2.0/2.5 mm·mm-1，滴距8 cm，滴速20 d·min-1，滴丸收集后用吸水纸擦干。
3.根据权利要求2所述的防治慢性盆腔炎的双相胶囊的制备方法，其特征在于，颗粒制备工艺具体如下：微粉硅胶和低取代羟丙基纤维素用量各占投药量的5%，与提取物粉末混合均匀，加入1.5%体积的80%乙醇制软材，用14目筛网制成湿颗粒，于40 ℃干燥，并收集通过14目筛而不能通过60目筛的颗粒。
4.如权利要求1所述的防治慢性盆腔炎的双相胶囊的检测方法，其特征在于：所述的检测方法包括鉴别和含量测定项目；其中鉴别是对胶囊制剂中的白头翁、香附、苍术、牛膝、黄柏、蛇床子的薄层色谱鉴别；含量测定是用高效液相色谱法分别测定制剂中α-香附酮、苍术素、白头翁皂苷B4、盐酸小檗碱的含量；
具体鉴别方法为：
（1）白头翁的薄层色谱鉴别：取本制剂内容物颗粒0.72g，加甲醇20mL，超声使溶解，滤过，滤液置水浴上蒸干，残渣加水30 mL使溶解，用水饱和的正丁醇萃取三次，每次30mL，合并正丁醇液，用氨试液洗正丁醇萃取液两次，弃去洗液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇10mL溶解，作为供试品溶液；另取白头翁对照药材1.0g，同法制成对照药材溶液；再取白头翁皂苷B4对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述三种溶液各5µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-醋酸-水=4:1:2的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
（2）香附的薄层色谱鉴别：取本制剂内容物滴丸0.72g，加乙醚5mL，放置1h，时时振摇，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯0.5mL使溶解，作为供试品溶液；取香附对照药材1.0g，同供试品溶液制备法制成对照药材溶液；另取α-香附酮对照品，加乙酸乙酯制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述三种溶液各2µL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸=80:1:1为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的深蓝色斑点；
（3）苍术的薄层色谱鉴别：取本制剂内容物滴丸0.96g，加甲醇10mL，超声处理15分钟，滤过，取滤液作为供试品溶液；取苍术对照药材0.8 g，同法制成对照药材溶液；另取苍术素对照品，加甲醇制成每1mL含0.2 mg的溶液，作为对照品溶液；吸取供试品溶液、对照药材溶液各6µL，对照品溶液2µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以60～90℃的石油醚-丙酮=9:2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
（4）牛膝的薄层色谱鉴别：取本制剂内容物颗粒4.8 g，加80%甲醇50mL，加热回流3h，滤过，滤液蒸干，残渣加水15mL，微热使溶解，加在内径为1.5cm、柱高15cm 的D101大孔吸附树脂柱上，用水100mL洗脱，弃去水液，再用20%乙醇100mL洗脱，弃去洗脱液，继用80%乙醇100mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加80%甲醇 1mL使溶解，即为供试品溶液；取牛膝对照药材4.0g，同法制成对照药材溶液；再取β-蜕皮甾酮、人参皂苷Ro对照品，加甲醇分别制成每1mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液；吸取供试品溶液4～8µL，对照品和对照药材溶液各4µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水-甲酸=7:3:0.5:0.05为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸试液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
（5）黄柏的薄层色谱鉴别：
①黄柏碱：取本制剂内容物颗粒0.24g，加1%醋酸甲醇溶液40 mL，于60 ℃超声处理20分钟，滤过，滤液浓缩至2mL，作为供试品溶液；再取黄柏对照药材0.1g，加1%醋酸甲醇溶液40mL，同法制成对照药材溶液；另取黄柏碱对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述三种溶液各3～5µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水=30:15:4的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
②小檗碱：取本制剂内容物颗粒0.12g，研细，加甲醇10mL，加热回流30分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取黄柏对照药材0.05g，加甲醇5 mL，同法制成对照药材溶液；再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典附录VI B的薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各1μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-水=6:3:2:1.5:0.3为展开剂，置氨蒸气预饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材和对照色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
（6）蛇床子的薄层色谱鉴别：取本制剂内容物颗粒0.54g，加无水乙醇5mL，超声处理5分钟，放置，取上清液作为供试品溶液；取蛇床子对照药材0.3g，同法制成对照药材溶液；另取蛇床子素对照品，加无水乙醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述三种溶液各2µL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-正己烷=3:1:4为展开剂，展开，取出，晾干，置365 nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
具体含量测定方法为：
（1）白头翁皂苷B4含量测定：参照2010版《中国药典》一部附录Ⅵ D高效液相色谱法测定：
色谱条件与系统适用性试验：
色谱柱：15×4.6mm，5µm的diamonsilTMC18柱；
流动相：乙腈-水=A:B，0～15 min，B体积分数为74%，15～17min，B体积分数为74%～5%，17～35 min，B体积分数为5%；
柱温为35 ℃；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为201 nm；进样量为20 µL；理论塔板数N按白头翁皂苷B4峰计算不低于3000；
对照品溶液的制备：精密称取白头翁皂苷B4对照品5.55 mg，置于10 mL容量瓶中，甲醇稀释并定容至刻度，即得浓度为555.00μg·mL-1的贮备液；精密吸取储备液6 mL，置于10 mL容量瓶中，甲醇稀释并定容至刻度，即得浓度为333.00μg·mL-1的对照品溶液；
供试品溶液的制备：精密称取胶囊内容物颗粒20 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度的2/3处，采用功率150 W、频率40 KHz的超声10 min，冷却至室温，再用甲醇定容至刻度，过0.45 µm微孔滤膜，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20 μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得；
（2）盐酸小檗碱的含量测定：
色谱条件与系统适用性试验：色谱柱：15×4.6mm，5µm的diamonsilTMC18柱；流动相为乙腈:0.1%磷酸=50:50；柱温为35℃；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为265 nm；进样量为20 µL；理论塔板数N按盐酸小檗碱峰计算不小于4000；
对照品溶液的制备：精密称取盐酸小檗碱对照品21.84 mg，置于100 mL容量瓶中，流动相稀释并定容至刻度，即得浓度为218.40μg•mL-1的贮备液；精密吸取该贮备液1 mL，置于10 mL容量瓶中，流动相稀释并定容至刻度，摇匀，即得浓度为21.84μg·mL-1对照品溶液；
供试品溶液的制备：精密称取胶囊内容物颗粒10 mg，置10 mL容量瓶中，加流动相至刻度的2/3处，采用功率150W、频率40 KHz的超声10 min，冷却至室温，再用流动相定容至刻度，过0.45 µm微孔滤膜，即得；
测定法：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20 μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得；
（3）苍术素的含量测定：
色谱条件与系统适用性试验：色谱柱：15×4.6mm，5µm的diamonsilTMC18柱；流动相为甲醇-水=74:26；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为340 nm；柱温为25℃；进样量为20 μL；理论塔板数N按苍术素峰计算不低于3000；
对照品溶液的制备：精密称取苍术素对照品9.90 mg，置于10 mL容量瓶中，甲醇稀释并定容至刻度，即得浓度为990.00μg·mL-1的苍术素贮备液；精密吸取该贮备液1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，即得浓度为99.00 μg·mL-1对照品溶液；
供试品溶液的制备：取滴丸样品5粒研磨均匀，从中精密称取20 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度的2/3处，超声至溶解，甲醇定容，过0.45 µm微孔滤膜，即得；
测定法：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20μL，测定，即得；
（4）α-香附酮的含量测定：
色谱条件与系统适用性试验：色谱柱：15×4.6mm，5µm的diamonsilTMC18柱；流动相为甲醇-水=74:26；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为252nm；柱温为25℃；进样量为20 μL；理论塔板数N按α-香附酮峰计算不低于3000；
对照品溶液的制备：精密称取α-香附酮对照品79.80 mg，置于25mL容量瓶中，乙酸乙酯稀释并定容至刻度，即得浓度为3192.00μg·mL-1的α-香附酮贮备液；精密吸取该贮备液0.05 mL，置于10 mL容量瓶中，乙酸乙酯稀释并定容至刻度，摇匀，即得浓度为15.96 μg·mL-1对照品溶液；
供试品溶液的制备：取滴丸样品5粒研磨均匀，从中精密称取20 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度的2/3处，超声至溶解，甲醇定容，过0.45 µm微孔滤膜，即得；测定法：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20μL，测定，即得。
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