CN103757743B - 包载脂质体的核壳纳米纤维 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种核层包载脂质体的核壳纳米纤维及其制备方法和用途,其特征在于:所述核壳纳米纤维的壳层为生物相容性聚合物,核层为天然聚电解质,脂质体包载于纤维的核层中,脂质体内装载有活性物质。所述核壳纳米纤维的直径介于100‑800nm。所述核壳纳米纤维可以控制其中的脂质体内装载的活性物质在8‑14天内缓慢释放至平衡。本发明制备的核壳纳米纤维材料生物相容性好,可控制释放生长因子、抗菌肽和各类活性药物,性能稳定且易于保存,应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于核壳纳米纤维的制备领域,具体来说本发明涉及一种核层包含脂质体的核壳纳米纤维、其制备方法及其用途。
背景技术
静电纺丝技术是指聚合物溶液在高压静电场作用下形成纤维的过程。该技术简单方便,所制备的纤维直径介于大约0.05~5μm,比表面积介于大约1-100m2/g,膜孔隙率高达约90%以及孔径低于约100nm。这些特性使得静电纺丝纤维膜可以应用于织物、滤膜、复合材料增强体,伤口敷料、组织工程支架、传感器、光电子器件以及催化等领域。
静电纺丝纤维膜包覆伤口时具有透气阻菌、不粘附伤口以及促进细胞迁移增殖的性质,因而可以作为较理想的伤口敷料材料。为了进一步保护伤口并促进伤口愈合,静电纺丝纤维还可以包载生长因子、生物酶以及抗菌消炎药物。通常,这些活性物质先与聚合物形成混合溶液,然后通过静电纺丝获得包载活性物质的纳米纤维膜。但是通过混合静电纺丝方法制备的纳米纤维在进行体外释放实验的第1小时内释放活性物质的速率较快。虽然内容物的快速释放对缓解伤口疼痛、抑制伤口感染及促进伤口愈合有积极的作用,但相对于约8-12周的伤口愈合周期来说,所希望的是药物能够在更长的时间范围内缓慢释放,以便很好地长期保护伤口并减少敷料更换次数,进而减轻病人在伤口处理过程中的疼痛和医务工作人员的工作量。
随着静电纺丝技术的发展,人们利用同轴静电纺丝技术制备了其核层包载活性物质的核壳纳米纤维。虽然不含活性物质的壳层在体外释放实验中可以适度延缓活性物质的突释,但纤维中的内容物达到释放平衡的时间最长也只有约24小时。
已知脂质体具有良好的生物相容性和内容物控释能力。但是当采用脂质体与聚合物的混合溶液直接进行单轴静电纺丝时,脂质体由于受到聚合物溶液施加的高剪切力而易于发生破裂,其包载的内容物也因此容易发生泄漏,这对于内容物的控制释放是不利的。
针对以上问题,本发明提供了一种其中包载脂质体的核壳纳米纤维。所述纤维结合了核壳纤维与脂质体的优点。其中,核壳结构既可以控制未包载入脂质体的内容物的释放,又可以防止脂质体在静电纺丝过程因受到较大剪切力而发生破裂;而包含于核层的脂质体可以控制其内容物的释放,达到药物的长期控制释放。本发明的方法操作简单,原料价格低廉,反应条件温和,具有极好的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种包载脂质体的核壳纳米纤维,其特征在于所述核壳纳米纤维的壳层为生物相容性聚合物,核层为天然聚电解质,脂质体包载于纤维的核层中,脂质体内装载有活性物质。所述核壳纳米纤维的直径介于大约100-800nm,优选其直径为大约200-500nm,更优选为大约300-400nm。所述核壳纳米纤维可以控制其中的脂质体内装载的活性物质在8-14天内,优选在10-12天内缓慢释放至平衡。
所述生物相容性聚合物可以选自合成聚合物和天然大分子,其中所述合成聚合物包括聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、聚氧化乙烯(PEO)、聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)和聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA);所述天然大分子包括醋酸纤维素(CA)、乙基纤维素(EC)、羟丙基纤维素(HPC)、羟丙甲基纤维素(HPMC)、壳聚糖和蚕丝蛋白。
所述天然聚电解质为透明质酸钠、壳聚糖、海藻酸钠中的一种或几种。
所述脂质体包括不带电荷的中性脂质体,例如由卵磷脂构成的脂质体;带正电荷脂质体,例如膜层包含硬脂酰胺(SA)的脂质体;以及带负电荷脂质体,例如膜层包含心磷脂(CL)的脂质体,其粒径介于约20-500nm,优选其粒径为约50-150nm。所述脂质体特别优选为中性脂质体。
所述活性物质可以是染料分子、生物活性因子。
所述染料分子例如是罗丹明B和异硫氰酸荧光素。
所述生物活性因子包括生长因子、抗菌肽和活性药物,其中所述生长因子包括碱性纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、组织转化生长因子(TGF-β)、血小板衍生生长因子(PDGF)和胰岛素样生长因子(IGF);所述的抗菌肽包括微生物源抗菌肽、植物源抗菌肽、动物源抗菌肽以及基因工程来源的抗菌肽;所述的活性药物包括消炎药和抗生素。
所述消炎药例如有萘普生、阿司匹林、对乙酰氨基酚、双氯芬酸、吲哚美辛、舒林酸、布洛芬和芬布芬。所述抗生素例如是青霉素类、头孢菌素类、大环内酯类、氨基糖苷类、四环素类、氯霉素类、喹诺酮类、磺胺类和万古霉素类。
本发明进一步涉及制备本发明的核壳纳米纤维方法,包括:
(1)通过脂质膜水化法制备装载活性物质的脂质体悬液:将一定质量比的磷脂、胆固醇和活性物质溶解到适量的溶剂中;待完全溶解后,使用例如旋转蒸发仪在大约30℃条件下将溶剂蒸干得脂质膜;
向上述脂质膜中加入与上述有机溶剂等体积的缓冲液;再次使用例如旋转蒸发仪在保护气体气氛下例如在氮气环境中于大约30℃条件下进行蒸发,直至脂质膜完全脱落并分散到水中,得到乳白色的悬液;将该悬液静置约4-6小时以完成脂质体的膨胀;然后再向悬液中注入保护性气体例如氩气并进行水浴超声处理,得到粒径均匀的脂质体悬液;
(2)向步骤(1)的脂质体悬液中加入一定比例的天然聚电解质水溶液以稳定脂质体,得到的混合溶液作为同轴静电纺丝的核层溶液;所述天然聚电解质水溶液的浓度为约1-3%,与脂质体悬液的混合比例为约1∶1-1∶2;
(3)使用易于静电纺丝的生物相容性聚合物的溶液作为壳层溶液,进行同轴静电纺丝,得到核层包含载有活性物质的脂质体的核壳纳米纤维。
在本发明的方法中,所述磷脂可以选自卵磷脂、鞘磷脂、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、硬脂酰胺和心磷脂。
在步骤(1)中所加入的胆固醇的量以磷脂质量为基础计为大约0-100%,优选为约10-50%;胆固醇的作用是稳定所制备的脂质体;根据脂水分配系数及目标装载量的不同,活性物质的质量以磷脂和胆固醇质量之和为基础计可以为约1-100%,优选为大约10-50%。
步骤(1)中所述活性物质根据其脂水分配系数的不同,可以在开始时与磷脂、胆固醇一起直接加入,也可以溶解于缓冲液中后与缓冲液一起加入。
步骤(1)中的溶剂为氯仿或氯仿/甲醇混合溶液,要求加入的溶剂的量既能够完全溶解所加入的磷脂、胆固醇和活性物质,但又不超过圆底烧瓶体积的1/25。氯仿/甲醇混合液中甲醇的体积含量介于大约0-50%,优选为大约20-40%。
所述缓冲液可以是超纯水或pH=6.4的磷酸缓冲液。
步骤(1)中的脂质体悬液中脂质体的粒径为大约50-150nm。本方法中经过超声处理所制备的脂质体主要为单壁脂质体,包括小单壁脂质体和大单壁脂质体。
在步骤(3)中,所述同轴静电纺丝所使用的同轴喷丝头内孔内径为约0.4-0.8mm,外孔内径为约1.0-1.4mm;所述同轴静电纺丝的溶液推进速率:核层溶液为约0.05-0.25mL/h,壳层溶液为约0.35-1.0mL/h;所述同轴静电纺丝的工艺参数为:电压为10-20kV,喷丝头与接收板之间的距离为约10-20cm,环境温度为约20-30℃,湿度为约20-40%。
将根据本发明的方法所得到的纳米纤维置于pH为大约4.0-7.4,优选为大约5-6.5的磷酸缓冲液中进行体外药物释放实验,研究纤维中脂质体对活性物质的控制释放。
本发明进一步涉及根据本发明的核壳纳米纤维在整形外科材料、伤口敷料、手术支架、组织工程支架及药物输送等领域的应用。
本发明的核层包载脂质体的核壳纳米纤维具有良好的生物相容性,制备方法简单,反应条件温和,实验原料价格低廉,脂质体在核壳纳米纤维核层稳定分散。该核壳纳米纤维同时可携载并缓释生长因子、抗菌肽及其它活性药物等活性物质,从而在伤口敷料、手术支架等生物医学、组织再生领域具有很好的应用前景。
附图说明:
图1是实施例1中包载萘普生的脂质体的透射电子显微镜(TEM)图片,其中(a)图标尺为100nm,(b)图标尺为200nm;由图可知其粒径介于50-150nm,属于中等大小单层脂质体。
图2中图片(a)是实施例1中同轴静电纺丝制备的核壳纳米纤维的扫描电子显微镜(SEM)图,由图可以看出纤维表面均匀光滑,脂质体包含入纤维内部;图片(b)是纤维直径统计结果,得到纤维的平均直径为359.4±126.2nm。
图3是实施例1中同轴静电纺丝制备的核壳纳米纤维的能量弥散X射线谱(EDS)结果。其中右侧(a)图是左侧(a)点的测试结果,右侧(b)图是左侧(b)点的测试结果;由图中结果可知,纤维表层只含有C和O元素(来自于醋酸纤维素),不包含Na元素(来自于透明质酸钠)和P元素(来自于卵磷脂);这表明纤维表层为醋酸纤维素,在同轴静电纺丝过程中核液与壳液没有发生融合,而且脂质体没有发生破裂。
图4是实施例1中同轴静电纺丝制备的核壳纳米纤维的透射电子显微镜(TEM)图片,图(a)中样品未经处理,图(b)中样品经2%磷钨酸水溶液处理;圆圈中标出的是包含于核壳纳米纤维核层的脂质体;由图可以看出,纤维具有明显的核壳结构,且脂质体在纤维核层离散分布。
图5是实施例1中同轴静电纺丝制备的核壳纳米纤维的体外药物释放结果,由图可以看出,纤维中药物分两阶段释放,未包载入脂质体的萘普生在8小时内快速释放,而包载入脂质体的萘普生缓慢释放至12天达到释放平衡。
图6是实施例2中同轴静电纺丝制备的核层包载脂质体的核壳纳米纤维的激光共聚焦显微镜(LSCM)图片,其中(a)图是荧光图像,其中离散的荧光点是包载于纤维的脂质体;(b)图是明场图像;由图可以看出,包载有罗丹明B的脂质体在纤维内部稳定且离散分布。
图7是对比实施例1中静电纺丝制备的纳米纤维的扫描电子显微镜(SEM)图片(a)及其直径统计结果(b);由图可以看出,所制备的纤维表面均匀光滑,萘普生包载入纤维内部。
图8是对比实施例1中静电纺丝制备的纳米纤维的体外药物释放结果,由结果可以看出,纤维中萘普生释放较快,在1天内达到释放平衡。
图9是对比实施例2中同轴静电纺丝制备的核壳纳米纤维的扫描电子显微镜(SEM)图片(a)及其直径统计结果(b);由图可以看出,所制备的纤维表面均匀光滑,萘普生包载入纤维内部。
图10是对比实施例2中同轴静电纺丝制备的核壳纳米纤维的透射电子显微镜(TEM)图片;由图可以看出,所制备的纤维为核壳结构,萘普生在纤维中均匀分散。
图11是对比实施例2中静电纺丝制备的核壳纳米纤维的体外药物释放结果,由结果可知,纤维中萘普生释放较快,在1天内即达到释放平衡。
具体实施方式:
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应当理解的是,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1:脂质体包载萘普生的透明质酸钠/醋酸纤维素核壳纳米纤维的制备及其体外药物释放测定
(1)采用脂质膜水化法制备载药脂质体:将卵磷脂(购于阿拉丁,提取自大豆,纯度>98%)160mg、胆固醇(购于Alfa Aesar,货号A11470,纯度95%)20mg和萘普生(购于AlfaAesar)90mg加入250mL的圆底烧瓶中,然后加入5mL氯仿/甲醇混合溶剂(v/v=2/1),待充分溶解后,使用旋转蒸发仪在大约30℃恒温水浴和60rpm的转速下将溶剂蒸干得脂质膜;
(2)向上述脂质膜中加入5mL超纯水和0.5g玻璃珠。再次使用旋转蒸发仪在氮气环境中于大约30℃恒温水浴和60rpm的转速下旋转30min,得到乳白色的悬液。在室温下密闭放置4小时完成膨胀过程后,再注入氩气并水浴超声处理1小时,得到粒径介于50-150nm的脂质体悬液;
(3)将上述脂质体悬液与3%(w/v)透明质酸钠(购于阿拉丁,提取自鸡冠,分子量大于106kDa)水溶液按2∶1(v/v)的比例混合后作为同轴静电纺丝的核层溶液,同时使用17%(w/v)醋酸纤维素(购于Sigma Aldrich,分子量为2.9×104kDa)/丙酮/N,N-二甲基乙酰胺溶液(2∶1,v/v)作为壳层溶液进行同轴静电纺丝,纺丝条件为:同轴喷丝头内径0.5/1.2mm,工作电压15kV,喷丝头与接收板之间距离15cm,核/壳溶液推进速率0.05/0.37mL/h,温度20℃,湿度20-30%;得到平均直径为359.4±126.2nm的核壳纳米纤维。
(4)将上述方法制备的纳米纤维置于pH=6.4左右的磷酸缓冲液中进行体外药物释放实验。萘普生随时间释放入缓冲液中的量通过紫外-可见光度计测定,所选吸收波长为262nm。测定结果显示:萘普生前8小时释放较快,然后缓慢释放至12天达到平衡。
实施例2:脂质体包载罗丹明B的透明质酸钠/聚乙烯基吡咯烷酮核壳纳米纤维的制备
(1)采用脂质膜水化法制备载荧光染料脂质体:将卵磷脂(购于Alfa Aesar,提取自大豆,货号36486)80mg、胆固醇(购于Alfa Aesar,货号A11470,纯度95%)10mg加入250mL的圆底烧瓶中,然后加入5mL氯仿/甲醇混合溶剂(v/v=2/1),待充分溶解后,使用旋转蒸发仪在30℃恒温水浴和60rpm的转速下将溶剂蒸干得脂质膜;
(2)向上述脂质膜中加入预制的浓度为3mg/mL的罗丹明B(购于Sigma Aldrich)水溶液5mL,再次使用旋转蒸发仪在氮气环境中于大约30℃恒温水浴和60rpm的转速下旋转30min,得到悬浊液。在室温下密闭放置大约4小时完成膨胀过程后,再注入氩气并水浴超声处理大约1小时,得到粒径介于20-80nm的脂质体悬液。悬液再经过超纯水透析以便除去没有包载入脂质体的罗丹明B。
(3)将上述脂质体悬液与3%(w/v)透明质酸钠(购于阿拉丁,提取自鸡冠,分子量大于106kDa))水溶液按2∶1(v/v)的比例混合后作为同轴静电纺丝的核层溶液,同时使用7%(w/v)聚乙烯吡咯烷酮(购于Alfa Aesar,分子量为1.6×106kDa)/乙醇溶液作为壳层溶液进行同轴静电纺丝。纺丝条件为:同轴喷丝头内径0.6/1.4mm,工作电压10kV,喷丝头与接收板之间距离10cm,核/壳溶液推进速率0.05/0.37mL/h,温度20℃,湿度20-30%。得到平均直径为118.5±54.5nm的纤维。
对比实施例1:包载萘普生的醋酸纤维素纳米纤维的制备及其体外药物释放的测定
(1)将570mg醋酸纤维素(购于Sigma Aldrich,分子量为2.9×104kDa)加入3mL丙酮/N,N-二甲基乙酰胺混合液(2∶1,v/v),制备浓度为19%(w/v)的醋酸纤维素溶液;然后加入57mg萘普生(购于Alfa Aesar),得到混合溶液。
(2)将上述混合溶液直接进行静电纺丝。纺丝条件为:喷丝头内径1.0mm,工作电压12kV,喷丝头与接收板之间距离15cm,溶液推进速率0.5mL/h,温度20℃,湿度20-30%。
(3)将上述方法制备的纳米纤维置于pH=6.4的磷酸缓冲液中进行体外药物释放实验。萘普生随时间释放入缓冲液中的量通过紫外-可见光度计测定,所选吸收波长为262nm。观察到萘普生释放较快,1天即达到释放平衡。
对比实施例2:核层包载萘普生的醋酸纤维素/醋酸纤维素核壳纳米纤维的制备及其体外药物释放的测定
1)将570mg醋酸纤维素(购于Sigma Aldrich,分子量为2.9×104kDa)加入3mL丙酮/N,N-二甲基乙酰胺混合液(2∶1,v/v),制备两份浓度均为19%(w/v)的醋酸纤维素溶液;然后向其中一份中加入57mg萘普生(购于Alfa Aesar),得到混合溶液。
(2)将上述萘普生与醋酸纤维素的混合溶液作为同轴静电纺丝的核层溶液,同时使用19%的醋酸纤维素溶液作为壳层溶液进行同轴静电纺丝。纺丝条件为:同轴喷丝头内径0.7/1.4mm,工作电压15kV,喷丝头与接收板之间距离15cm,核/壳溶液推进速率0.5/0.5mL/h,温度20℃,湿度20-30%。
(3)将上述方法制备的纳米纤维置于pH=6.4的磷酸缓冲液中进行体外药物释放实验。萘普生随时间释放入缓冲液中的量通过紫外-可见光度计测定,所选吸收波长为262nm。观察到萘普生释放较快,1天即达到释放平衡。
Claims (10)
1.一种核壳纳米纤维,其特征在于:所述核壳纳米纤维的壳层为生物相容性聚合物,核层为天然聚电解质,所述纤维的核层包载有脂质体,脂质体内装载有活性物质,其中所述核壳纳米纤维的直径介于100-800nm,所述脂质体粒径为20-500nm。
2.根据权利要求1所述的核壳纳米纤维,其中所述的生物相容性聚合物选自合成聚合物和天然大分子。
3.根据权利要求2所述的核壳纳米纤维,其中所述的合成聚合物包括聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、聚氧化乙烯(PEO)、聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)和聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA),所述的天然大分子包括醋酸纤维素(CA)、乙基纤维素(EC)、羟丙基纤维素(HPC)、羟丙甲基纤维素(HPMC)、壳聚糖和蚕丝蛋白。
4.根据权利要求1所述的核壳纳米纤维,其中所述的天然聚电解质为透明质酸钠、壳聚糖、海藻酸钠中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的核壳纳米纤维,其中所述的脂质体选自中性脂质体、带正电荷脂质体和带负电荷脂质体。
6.根据权利要求1所述的核壳纳米纤维,其中所述的活性物质选自染料分子和生物活性因子,所述的生物活性因子为生长因子、抗菌肽和活性药物。
7.制备如前述权利要求1-6任一项所述的核壳纳米纤维方法,包括:
(1)通过脂质膜水化法制备装载活性物质的脂质体悬液:将一定质量比的磷脂、胆固醇和活性物质溶解到适量的溶剂中;完全溶解后,蒸干溶剂得脂质膜;
向上述脂质膜中加入与上述溶剂等体积的缓冲液;再次在保护气体气氛下进行旋转,直至脂质膜完全脱落,分散于水中,得到乳白色的悬液;静置使得脂质体膨胀,然后向悬浊液中注入保护气体并进行超声处理,得到粒径均匀的脂质体悬液;
(2)向步骤(1)的脂质体悬液中加入与脂质体悬液的比例为1∶1-1∶2的浓度为1-3%的天然聚电解质水溶液,得到的混合溶液作为同轴静电纺丝的核层溶液;
(3)使用易于静电纺丝的生物相容性聚合物的溶液作为壳层溶液,进行同轴静电纺丝,得到核层包含装载有活性物质的脂质体的核壳纳米纤维。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述磷脂选自卵磷脂、鞘磷脂、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、硬脂酰胺和心磷脂;所述溶剂是甲醇含量0-50%的氯仿/甲醇混合溶剂;所述缓冲液是超纯水或pH=7.4的磷酸缓冲液。
9.根据权利要求7所述的方法,其中在步骤(1)中,所述活性物质根据其脂水分配系数的不同,也可以溶解于缓冲液中后与其一起加入;根据脂水分配系数及目标装载量的不同,活性物质的质量以磷脂和胆固醇质量之和为基础计为1-100%;加入的胆固醇的质量以磷脂质量为基础计为0-100%;在步骤(3)中,所述同轴静电纺丝所使用的同轴喷丝头内孔内径为0.4-0.8mm,外孔内径为1.0-1.4mm;所述同轴静电纺丝的溶液推进速率:核层溶液为0.05-0.25mL/h,壳层溶液为0.35-1.0mL/h;所述同轴静电纺丝的电压为10-20kV,喷丝头与接收板之间的距离为10-20cm,环境温度为20-30℃,湿度为20-40%。
10.根据权利要求1-6所述的核壳纳米纤维在整形外科材料、伤口敷料、手术支架、组织工程支架及药物输送领域的应用。
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