CN102797074B - 基于静电纺丝技术制备天然材料-脂质体复合纳米纤维 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于静电纺丝技术制备天然材料-脂质体复合纳米纤维方法，包括：（1）将卵磷脂、胆固醇和十八胺加入到反应容器中，再加无水乙醇，搅拌溶解，最后减压去除乙醇，得到脂质体膜；（2）将去离子水加入到含有上述脂质体膜的反应容器中，搅拌后室温搅拌；然后进行超声，得到粒径均匀的脂质体悬液；（3）采用上述脂质体悬液作为溶剂，配制含有天然材料的纺丝液，然后进行静电纺丝，得纳米纤维；（4）将上述纳米纤维在京尼平溶液或者乙醇蒸汽中熏蒸交联，即可。本发明操作简单，原料价格低廉，反应条件温和，生物相容性好；本发明制备的复合纳米纤维支架可控制释放基因、生长因子以及各类药物，性能稳定并易于保存，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于脂质体复合纳米纤维的制备领域，特别涉及一种基于静电纺丝技术制备天然材料-脂质体复合纳米纤维方法。
背景技术
制备纳米纤维的方法很多，如：模板合成、自组装、相分离和静电纺丝等技术。相对于其他技术，静电纺丝有其显著的优势。模板合成方法是指利用具有纳米结构的模具，使材料形成纤维或者导管的结构，该方法的最大优势就是使用模板可以将许多材料例如金属、电子导电高分子、半导体材料、碳材料制备成纳米级的纤维或导管。但是，该方法不能实现制备一对一的连续的纳米纤维。相分离方法主要是使用不同的溶剂，冷冻及干燥的方法，经过溶解-凝固-萃取的一系列过程，制备出所需孔径的泡沫状多孔材料，该方法的缺点是需要较长时间才能使固体高分子转为所需的泡沫状多孔结构。自组装技术是将一些分散的化合物自动组装成所需的结构和功能，其制备方法同样需要较长时间。静电纺丝技术是指在高压电场的条件下，使高分子纺丝液形成带电的喷射流，喷射流中的溶剂在到达接收装置之前挥发，带电的高分子克服表面张力瞬间被拉伸上千万倍，最后在接收装置上形成相互缠绕的纤维网状结构的纳米纤维。静电纺技术简单方便，是目前最具工业化前景的纳米纤维制备方法。大量研究表明，细胞在小于自身尺度的纳米纤维支架上具有更好的粘附、增殖和迁移特性。通过静电纺丝技术可以很便捷的获取适合细胞生长的纳米纤维支架。
组织工程支架材料必须具备良好的生物安全性，对细胞无毒害，并且具有生物可降解性和低免疫原性。天然材料因其具备上述优良特性，是构建组织工程支架的首选材料。天然细胞外基质是有由纳米级的丝状蛋白和多糖类组成，天然蛋白（如，胶原蛋白、丝素蛋白等）纳米纤维可在某种程度上模拟天然细胞外基质，为体外细胞的生长提供良好的环境。除了在结构上仿生，纳入支架体系的生长因子等生物活性分子可在功能上进一步仿生天然细胞外基质。
生物活性分子的稳定性差，易被体内的一些酶降解或者遇到酸碱自行降解，并且半衰期短需要频繁给药，容易给病人带来不良反应甚至产生毒性反应。为了提高这些生物活性分子的稳定性，提高其靶向性，降低由加大剂量带来的毒性，必须采用合适的给药系统。脂质体很容易与细胞膜融合从而将其内容物携带至细胞内，因此作为一种载体被广泛用来包裹各种药物分子（包括蛋白质和核酸）构建各种载药系统。长期以来，脂质体转染一直是基因转染技术中主要的非病毒转染手段，它具有操作简单、无致瘤风险以及无免疫原性等优点。近年来的研究表明，通过包埋嵌入、表面吸附、共价接枝等方式纳入组织工程支架体系中的载药脂质体由于受到支架材料的保护和牵制，其转染细胞的效果比单纯用没有支架的脂质体更好，药物分子的释放更平稳持久，对细胞的诱导效果更佳。显然，脂质体技术的介入将使功能性支架的制备更为方便，支架的功能设计也将朝着更精细的方向发展。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于静电纺丝技术制备天然材料-脂质体复合纳米纤维方法，该方法操作简单，原料价格低廉，反应条件温和，得到的复合纳米纤维可控制释放基因、生长因子以及各类药物，性能稳定并易于保存。
本发明的一种基于静电纺丝技术制备天然材料-脂质体复合纳米纤维方法，包括：
（1）采用薄膜分散法制备脂质体微球：将卵磷脂0.2-0.5g、胆固醇0.1-0.3g和十八胺0.01-0.05g加入到反应容器中，再加无水乙醇1-2mL，于65-70℃搅拌溶解，最后减压去除乙醇，得到脂质体膜；
（2）将50-70℃的去离子水30-50mL加入到含有上述脂质体膜的反应容器中，于50-70℃搅拌10-30min，随后室温搅拌30-60min，如果溶液体积减少，可补加去离子水，混匀；然后进行超声，得到粒径均匀的脂质体悬液；
（3）采用上述脂质体悬液作为溶剂，配制含有天然材料的纺丝液，然后进行静电纺丝，得纳米纤维；
（4）将上述纳米纤维在质量百分比0.5-2%的京尼平溶液的蒸汽或者体积浓度75%的乙醇蒸汽中熏蒸交联0.5-48h，得到交联程度不同的纳米纤维支架，不同的交联程度使得纳米纤维的溶解速度不同，从而达到一个控释药物释放的效果。
步骤（2）中所述的50-70℃的去离子水中溶解或分散有染料分子、生物活性因子中的一种或几种。
所述的染料分子包括异硫氰酸荧光素和尼罗红。
所述的生物活性因子包括生长因子、生物酶、基因、活性药物。
所述的生长因子包括磷酸鞘氨醇、血管内皮生长因子、神经生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子；所述的生物酶包括果胶酶、蛋白酶、脂肪酶、过氧化氢酶和淀粉酶等。
所述的基因包括基因片段、基因表达载体、MicroRNA、siRNA、mRNA、tRNA和rRNA。
所述的药物包括阿霉素、地塞米松、洛莫司汀、丹参酮、卡莫司汀、右雷佐生、磷酸氟达拉滨、卡培他滨、紫杉醇、替吉奥、奥沙利铂、多西他赛、长春瑞滨、榄香烯、羟基喜树碱、荧光素纳等。
步骤（2）中所述的脂质体悬液中脂质体的粒径为100-500nm。
步骤（3）中所述的天然材料为明胶、丝素蛋白、壳聚糖、胶原蛋白、海藻酸钠等天然材料。
步骤（3）中所述的纺丝液中天然材料的质量百分比为10-30%。
步骤（3）中所述的纺丝液中脂质体占天然材料的质量分数为1-15%。
步骤（3）中所述的静电纺丝的工艺参数为：电压为8-20kV，推进速度为0.3-1.0mL/h，接收距离为15-20cm，温度为20-40℃，湿度为30-60%。
本发明利用静电纺丝技术制备出负载有机纳米粒子的天然材料复合纳米纤维，主要是利用静电纺技术将天然蛋白和纳米级有机粒子进行混纺、同轴纺，进而得到天然材料-有机纳米粒子复合纳米纤维组织工程支架。纳米有机粒子可包裹生物活性分子（如生长因子、基因以及其他活性药物）极大的拓展纳米纤维在生物医学，组织再生等领域的应用。
本发明采用薄膜分散法制备粒径100-500nm、表面带阳性电荷的脂质体，并结合静电纺丝技术，最终制备出直径100-800nm的天然材料-有机纳米粒子复合纳米纤维。本发明所制备的天然材料-有机纳米粒子复合纳米纤维，具有良好的生物相容性，制备方法简单反应条件温和，且整个实验过程不涉及任何有毒有害对环境不友好的物质，实验原料价格低廉，载药量高，能够受控长期释放。由该复合纳米纤维构成的支架可携载并缓释生长因子、基因片段等活性分子，从而在组织工程乃至癌症治疗等在生物医学、组织再生领域具有良好的应用前景。
有益效果：
（1）本发明操作简单，原料价格低廉，反应条件温和，绿色友好，经济性好，生物相容性好；
（2）本发明制备的复合纳米纤维支架可控制释放基因、生长因子以及各类药物，性能稳定并易于保存，在组织修复乃至肿瘤治疗等生物医学领域具有良好的应用前景。
附图说明
图1是实施例1所得产物的SEM照片；
图2是实施例2所得产物的SEM照片；
图3是实施例3所得产物的TEM照片；
图4是实施例4所得产物的SEM照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
负载脂质体的明胶纳米纤维支架
（1）采用薄膜分散法制备脂质体微球。称取卵磷脂0.23g、胆固醇0.15g、十八胺0.02g于50mL小烧杯中，加无水乙醇1.5mL，置于65℃水浴中，搅拌使溶解，减压的条件下将乙醇挥去，得脂质体膜。
（2）取去离子水30mL于小烧杯中，置于65℃水浴中，保温待用。
（3）将步骤（2）的产物加至步骤（1）中的小烧杯中，65℃水浴中搅拌水化10min。随后将小烧杯置于磁力搅拌器上，室温搅拌30min，如果溶液体积减少，可补加去离子水，混匀。
（4）将步骤（3）的产物进行超声，得到粒径均匀的脂质体悬液。
（5）将步骤（4）中的产物作为溶剂配置质量体积比为10%的明胶-脂质体纺丝液，加脂质体的量相对于明胶的质量为15.6%。用注射器吸取该溶液，调节电压为20kV，推进速度为1.0mL/h，接收距离为15cm，制得负载脂质体的明胶复合纳米纤维。
（6）所得明胶复合纳米纤维在1%浓度的京尼平溶液蒸汽中熏蒸交联48h，得到交联程度不同的纳米纤维支架，不同的交联程度使得纳米纤维的溶解速度不同，从而达到控释药物的效果。
实施例2
负载脂质体的丝素蛋白纳米纤维支架
（1）采用薄膜分散法制备脂质体微球。称取卵磷脂0.3g、胆固醇0.15g、十八胺0.02g于50mL小烧杯中，加无水乙醇1.5mL，置于65℃水浴中，搅拌使溶解，减压的条件下将乙醇挥去，得到脂质体膜。
（2）取去离子水30ml于小烧杯中，置于65℃水浴中保温待用。
（3）将步骤（2）的产物加至步骤（1）中的小烧杯中，65℃水浴中搅拌水化10min。随后将小烧杯置于磁力搅拌器上，室温，搅拌30min，如果溶液体积减少，可补加去离子水，混匀。
（4）将步骤（3）的产物进行超声，得到粒径均匀的脂质体悬液。
（5）将步骤（4）中的产物作为溶剂配置质量百分比为25%的丝素-脂质体纺丝液，加脂质体的量相对于丝素的质量为11.2%。用注射器吸取该溶液，调节电压为20kV，推进速度为0.3mL/h，接收距离为20cm，制得负载脂质体的丝素复合纳米纤维。
（6）所得纳米纤维在75%乙醇蒸汽中熏蒸交联20h，既可以达到消毒除菌的效果还可以进行交联，使所得复合纳米纤维从原来的超亲水性转变为疏水性支架。
实施例3
负载脂质体的丝素蛋白纳米纤维支架
（1）采用薄膜分散法制备脂质体微球。称取卵磷脂0.3g、胆固醇0.15g、十八胺0.02g于50mL小烧杯中，加无水乙醇1.5mL，置于65℃水浴中，搅拌使溶解，减压的条件下将乙醇挥去，得到脂质体膜。
（2）取去离子水50ml于小烧杯中，加入100μg质粒DNA，置于65℃水浴中保温待用。
（3）将步骤（2）的产物加至步骤（1）中的小烧杯中，65℃水浴中搅拌水化10min。随后将小烧杯置于磁力搅拌器上，室温，搅拌60min，如果溶液体积减少，可补加去离子水，混匀。
（4）将步骤（3）的产物进行超声，得到粒径均匀的脂质体悬液。
（5）将步骤（4）中的产物作为溶剂配置质量百分比为25%的丝素-脂质体纺丝液，加脂质体的量相对于丝素的质量为11.2%。用注射器吸取该溶液，调节电压为20kV，推进速度为0.3mL/h，接收距离为20cm，制得负载有质粒DNA的丝素-脂质体复合纳米纤维。
（6）所得纳米纤维在75%乙醇蒸汽中熏蒸交联20h，既可以达到消毒除菌的效果还可以进行交联，使所得复合纳米纤维从原来的超亲水性转变为疏水性支架。
实施例4
负载脂质体的丝素蛋白纳米纤维支架
（1）采用薄膜分散法制备脂质体微球。称取卵磷脂0.3g、胆固醇0.15g、十八胺0.02g于50mL小烧杯中，加无水乙醇1.5mL，置于65℃水浴中，搅拌使溶解，减压的条件下将乙醇挥去，得到脂质体膜。
（2）取去离子水50ml于小烧杯中，加入0.2mg阿霉素置于65℃水浴中保温待用。
（3）将步骤（2）的产物加至步骤（1）中的小烧杯中，65℃水浴中搅拌水化10min。随后将小烧杯置于磁力搅拌器上，室温，搅拌60min，如果溶液体积减少，可补加去离子水，混匀。
（4）将步骤（3）的产物进行超声，得到粒径均匀的脂质体悬液。
（5）将步骤（4）中的产物作为溶剂配置质量百分比为25%的丝素-脂质体纺丝液，加脂质体的量相对于丝素的质量为11.2%。用注射器吸取该溶液，调节电压为20kV，推进速度为0.3mL/h，接收距离为20cm，制得负载脂质体的丝素复合纳米纤维。
（6）所得纳米纤维在75%乙醇蒸汽中熏蒸交联20h，既可以达到消毒除菌的效果还可以进行交联，使所得复合纳米纤维从原来的超亲水性转变为疏水性支架。
Claims (8)
1.一种基于静电纺丝技术制备天然材料-脂质体复合纳米纤维方法，包括：
（1）将卵磷脂0.2-0.5g、胆固醇0.1-0.3g和十八胺0.01-0.05g加入到反应容器中，再加无水乙醇1-2mL，于65-70℃搅拌溶解，最后减压去除乙醇，得到脂质体膜；
（2）将50-70℃的去离子水30-50mL加入到含有上述脂质体膜的反应容器中，于50-70℃搅拌10-30min，随后室温搅拌30-60min；然后进行超声，得到粒径均匀的脂质体悬液；
（3）采用上述脂质体悬液作为溶剂，配制含有天然材料的纺丝液，然后进行静电纺丝，得纳米纤维；其中天然材料为明胶、丝素蛋白、壳聚糖、胶原蛋白、海藻酸钠中的一种或几种；
（4）将上述纳米纤维在质量百分比为0.5-2%的京尼平溶液的蒸汽或者体积百分比为75%的乙醇蒸汽中熏蒸交联0.5-48h，即可。
2.根据权利要求1所述的一种基于静电纺丝技术制备天然材料-脂质体复合纳米纤维方法，其特征在于：步骤（2）中所述的去离子水中溶解或分散有染料分子、生物活性因子中的一种或几种。
3.根据权利要求2所述的一种基于静电纺丝技术制备天然材料-脂质体复合纳米纤维方法，其特征在于：所述的染料分子包括异硫氰酸荧光素、尼罗红；所述的生物活性因子包括生长因子、生物酶、基因、活性药物。
4.根据权利要求3所述的一种基于静电纺丝技术制备天然材料-脂质体复合纳米纤维方法，其特征在于：所述的生长因子包括磷酸鞘氨醇、血管内皮生长因子、神经生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子；所述的生物酶包括果胶酶、蛋白酶、脂肪酶、过氧化氢酶和淀粉酶；所述的基因包括基因片段、基因表达载体、MicroRNA、siRNA、mRNA、tRNA和rRNA；所述的活性药物包括阿霉素、地塞米松、洛莫司汀、丹参酮、卡莫司汀、右雷佐生、磷酸氟达拉滨、卡培他滨、紫杉醇、替吉奥、奥沙利铂、多西他赛、长春瑞滨、榄香烯、羟基喜树碱、荧光素钠。
5.根据权利要求1所述的一种基于静电纺丝技术制备天然材料-脂质体复合纳米纤维方法，其特征在于：步骤（2）中所述的脂质体悬液中脂质体的粒径为100-500nm。
6.根据权利要求1所述的一种基于静电纺丝技术制备天然材料-脂质体复合纳米纤维方法，其特征在于：步骤（3）中所述的纺丝液中天然材料的质量百分比为10-30%。
7.根据权利要求1所述的一种基于静电纺丝技术制备天然材料-脂质体复合纳米纤维方法，其特征在于：步骤（3）中所述的纺丝液中脂质体占天然材料的质量分数为1-15%。
8.根据权利要求1所述的一种基于静电纺丝技术制备天然材料-脂质体复合纳米纤维 方法，其特征在于：步骤（3）中所述的静电纺丝的工艺参数为：电压为8-20kV，推进速度为0.3-1.0mL/h，接收距离为15-20cm，温度为20-40℃，湿度为30-60%。
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