CN102560888B - 负载水溶性维生素e的丝素蛋白纳米纤维膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种负载水溶性维生素E的丝素蛋白纳米纤维膜及其制备方法,纳米纤维膜包括丝素蛋白纳米纤维和负载于丝素蛋白纳米纤维中的水溶性维生素E。制备方法包括:(1)将水溶性维生素E加热至融化,搅拌均匀,随后于80~100℃加入去离子水,搅拌10-20min至透明的澄清液体,即水溶性维生素E溶液;(2)在上述水溶性维生素E溶液中加入丝素蛋白及去离子水至终浓度,搅拌至丝素蛋白完全溶解,得丝素蛋白-维生素E溶液;(3)将上述溶液移入注射器中进行静电纺丝,即得。本发明无污染,成本低,操作简单,本发明的负载有水溶性维生素E的纳米纤维可应用人工皮肤、医用敷料、止血材料、护肤产品等多个生物医药领域。

Description

负载水溶性维生素E的丝素蛋白纳米纤维膜及其制备方法
技术领域
本发明属于丝素蛋白纳米纤维膜及其制备领域,特别涉及一种负载水溶性维生素E的丝素蛋白纳米纤维膜及其制备方法。
背景技术
纳米纤维由于具有尺度小、比表面积大和物理性能优异等特点,在生物医学领域具有广阔的应用前景。纳米纤维膜有小的孔径和高的比表面积能促进止血反应而不用止血剂。纳米纤维膜多孔结构有利于细胞的呼吸而不引起伤口干燥,同时小的孔径有效阻止细菌侵入,又具有良好的透气透氧性能。换敷料带来干扰神经组织再生的几率。静电纺纳米纤维能给皮肤细胞更好的自我修复路径,从组织工程的观点出发,仿生的纳米纤维结构有好的细胞传导性和改善血液的相容性,使伤口更容易愈合和皮肤再生。由于丝素蛋白是一种自然界非常丰富的天然蛋白质,具有良好的生物相容性、生物可降解性、良好的透气、透湿性、无免疫原性等优异的性能,近年来被广泛应用于生物医药领域。
多种维生素被发现与皮肤健康有密切关系,在专利CN 101736430A中,就公布了一种负载有维生素C的丝素蛋白纳米纤维的制备方法,其纤维具有护肤功效。维生素E又称为抗不生育维生素或生育酚,是一种透明淡黄色粘稠油状物,不溶于水,溶于有机溶剂,酸碱氢化过程及高温均不会破坏维生素E。但它在空气中会缓慢氧化,紫外线照射可使其分解。它可以保护其他易被氧化的物质使其不被破坏,所以它是极有效的氧化剂,可以预防重金属、产生自由基的肝毒素和可以引起氧化剂致伤的各种药物损害。聚乙二醇维生素E琥珀酸酯(D-α-tocopherol polyethylene glycol succinate,TPGS,Vitamin E TPGS,Tocophersolan)是维生素E的水溶性衍生物,由维生素E琥珀酸酯(VES)的羧基与聚乙二醇(PEG)酯化而成,已载入《美国药典》。美国现已有TPGS(质量分数为20%的水溶液)产品上市(如MazuriTM),作为维生素E的营养补充剂,折合成维生素E效价约为77.4IU·g-1。此水溶性维生素E非常稳定,室温放置不水解,且几乎无味,可作为人维生素E补充剂,特别是那些对脂溶性维生素E吸收有障碍的人。在US 523469中,以亚洲象和非洲象作为受试动物,与服用脂溶性维生素E相比,口服质量分数为20%的TPGS溶液后,体内维生素E浓度增长快,较低剂量的水溶性维生素E就能达到较高的血药浓度。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种负载水溶性维生素E的丝素蛋白纳米纤维膜及其制备方法,该丝素蛋白纳米纤维膜应用人工皮肤、医用敷料、止血材料、护肤产品等多个生物医药领域,在本发明整个制备过程中,不涉及到任何对环境和人类健康不友好的物质,无污染,成本低,操作简单。
本发明的一种负载水溶性维生素E的丝素蛋白纳米纤维膜,所述纳米纤维膜包括丝素蛋白纳米纤维和负载于丝素蛋白纳米纤维中的水溶性维生素E,纳米纤维膜的直径为10-800nm。
所述水溶性维生素E为维生素E聚乙二醇琥珀酸酯。
所述纳米纤维膜的直径为200-600nm。
本发明的一种负载水溶性维生素E的丝素蛋白纳米纤维膜的制备方法,包括:
(1)将水溶性维生素E加热至融化,搅拌均匀,随后于80~100℃加入相对于维生素E质量4-9倍的去离子水,搅拌10-20min至透明的澄清液体,即维生素E溶液;
(2)在上述维生素E溶液中加入丝素蛋白及去离子水至终浓度,搅拌至丝素蛋白完全溶解,得丝素蛋白-维生素E溶液;其中,维生素E的终浓度为0.1-2wt%,丝素蛋白的终浓度为20-35wt%;
(3)将上述丝素蛋白-维生素E溶液移入注射器中进行静电纺丝,即得丝素蛋白纳米纤维膜。
所述步骤(2)中的丝素蛋白的制备方法为:将去蛹蚕茧在100℃的0.5wt%Na2CO3水溶液中煮2-5次,每次30min进行脱胶,得到丝素,用摩尔比为1∶2∶8的CaCl2、C2H5OH和H2O或用0.8g/ml LiBr水溶液在40-60℃溶解1-2h,用蒸馏水透析3-5天,冷冻干燥即得。
所述步骤(2)中的维生素E的终浓度为0.5-2wt%。
所述步骤(2)中的丝素蛋白的终浓度为25-30wt%。
所述步骤(3)中的静电纺丝的工艺条件为:静电压为16-20千伏,接受距离为80-220mm,纺丝速率为0.1-1.0毫升/小时。
脂溶性维生素E吸收有障碍人群中常出现的维生素E缺乏或吸收率较低的问题,本发明提供的纳米纤维膜,利用丝素蛋白作为天然高分子材料,通过静电纺丝,制备得纤维直径在10-800nm之间的纳米纤维膜。
有益效果
本发明可使维生素E及丝素蛋白同时溶解在水中,在本发明整个制备过程中,不涉及到任何对环境和人类健康不友好的物质,无污染,成本低,操作简单,并结合利用纳米纤维、维生素E和丝素蛋白的优良特点,本发明的负载有水溶性维生素E的纳米纤维可应用人工皮肤、医用敷料、止血材料、护肤产品等多个生物医药领域,且水溶性维生素E的加入,可以提高丝素蛋白纺丝液的可纺性,提高了以水做溶剂,静电纺丝得到丝素蛋白纳米纤维的效率。
附图说明
图1为实施例1所制得的纳米纤维膜材料的扫描电镜图;
图2为实施例2所制得的纳米纤维膜材料的扫描电镜图;
图3为实施例1所得的纳米纤维膜材料的纤维直径分布图;
图4为实施例2所得的纳米纤维膜材料的纤维直径分布图;
图5为维生素E丝素蛋白纳米纤维细胞增殖状态比较;
图6为负载维生素E纳米纤维支架细胞抗氧化性能比较;
图7为加入水溶性维生素E对纺丝效率的影响效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)将去蛹蚕茧在100℃的0.5wt%Na2CO3水溶液中煮2次,每次30min进行脱胶,得到丝素,用摩尔比为1∶2∶8的CaCl2、C2H5OH和H2O在60℃溶解1.5h,冷冻干燥得到疏松的多孔状固体丝素蛋白;
(2)准确称取0.16克TPGS,加热至融化,磁力搅拌均匀,随后加热1.44ml的90℃的去离子水,充分搅拌15min,撤去热源,搅拌至呈透明的、澄清液体,在水溶性维生素E溶液中加入1.0g丝素蛋白及去离子水,溶液的最终质量为4.0g,密封后继续搅拌至丝素蛋白完全溶解,随后静置数分钟后将纺丝液转移至注射器中,电压为18kV,注射泵推进速度为0.3ml/h,采用铝箔接收,接收距离为18cm,得负载水溶性维生素E的丝素蛋白纳米纤维膜,平均直径为388±114nm。
实施例2
(1)将去蛹蚕茧在100℃的0.5wt%Na2CO3水溶液中煮3次,每次30min进行脱胶,得到丝素,0.8g/ml LiBr水溶液在45℃溶解2h,冷冻干燥得到疏松的多孔状固体丝素蛋白。
(2)准确称取0.08克TPGS,加热至融化,磁力搅拌均匀,随后加热0.72ml的90℃的去离子水,充分搅拌15min,撤去热源,搅拌至呈透明的、澄清液体,在水溶性维生素E溶液中加入1.0g丝素蛋白及去离子水,溶液的最终质量为4.0g,密封后继续搅拌至丝素蛋白完全溶解,随后静置数分钟后将纺丝液转移至注射器中,电压为20kV,注射泵推进速度为0.3ml/h,采用铝箔接收,接收距离为18cm,得负载水溶性维生素E的丝素蛋白纳米纤维膜,平均直径为722±300nm。
实施例3
(1)将去蛹蚕茧在100℃的0.5wt%Na2CO3水溶液中煮5次,每次30min进行脱胶,得到丝素,用摩尔比为1∶2∶8的CaCl2、C2H5OH和H2O在60℃溶解2h,冷冻干燥得到疏松的多孔状固体丝素蛋白。
(2)准确称取0.32克TPGS,加热至融化,磁力搅拌均匀,随后加热1.5ml的90℃的去离子水,充分搅拌15min,撤去热源,搅拌至呈透明的、澄清液体,在水溶性维生素E溶液中加入1.0g丝素蛋白及去离子水,溶液的最终质量为4g,密封后继续搅拌至丝素蛋白完全溶解,随后静置数分钟后将纺丝液转移至注射器中,电压为20kV,注射泵推进速度为0.3ml/h,采用铝箔接收,接收距离为18cm,得负载水溶性维生素E的丝素蛋白纳米纤维膜,平均直径为384±161nm。
实施例4
(1)将去蛹蚕茧在100℃的0.5wt%Na2CO3水溶液中煮5次,每次30min进行脱胶,得到丝素,用摩尔比为1∶2∶8的CaCl2、C2H5OH和H2O在60℃溶解2h,冷冻干燥得到疏松的多孔状固体丝素蛋白。
(2)准确称取0.016克TPGS,加热至融化,磁力搅拌均匀,随后加热0.064ml的90℃的去离子水,充分搅拌15min,撤去热源,搅拌至呈透明的、澄清液体,在水溶性维生素E溶液中加入1.0g丝素蛋白及去离子水,溶液的最终质量为4.0g,密封后继续搅拌至丝素蛋白完全溶解,随后静置数分钟后将纺丝液转移至注射器中,电压为18kV,注射泵推进速度为0.4ml/h,采用铝箔接收,接收距离为18cm,得负载水溶性维生素E的丝素蛋白纳米纤维膜。
实施例5
(1)将去蛹蚕茧在100℃的0.5wt%Na2CO3水溶液中煮5次,每次30min进行脱胶,得到丝素,用摩尔比为1∶2∶8的CaCl2、C2H5OH和H2O在60℃溶解1h,冷冻干燥得到疏松的多孔状固体丝素蛋白。
(2)准确称取0.16克TPGS,加热至融化,磁力搅拌均匀,随后加热1.28ml的90℃的去离子水,充分搅拌15min,撤去热源,搅拌至呈透明的、澄清液体,在水溶性维生素E溶液中加入0.8g丝素蛋白及去离子水,溶液的最终质量为4.0g,密封后继续搅拌至丝素蛋白完全溶解,随后静置数分钟后将纺丝液转移至注射器中,电压为18kV,注射泵推进速度为0.5ml/h,采用铝箔接收,接收距离为12cm,得负载水溶性维生素E的丝素蛋白纳米纤维膜。
实施例6
(1)将去蛹蚕茧在100℃的0.5wt%Na2CO3水溶液中煮5次,每次30min进行脱胶,得到丝素,用摩尔比为1∶2∶8的CaCl2、C2H5OH和H2O在60℃溶解2h,冷冻干燥得到疏松的多孔状固体丝素蛋白。
(2)准确称取0.16克TPGS,加热至融化,磁力搅拌均匀,随后加热1.44ml的90℃的去离子水,充分搅拌15min,撤去热源,搅拌至呈透明的、澄清液体,在水溶性维生素E溶液中加入1.6g丝素蛋白及去离子水,溶液的最终质量为4.0g,密封后继续搅拌至丝素蛋白完全溶解,随后静置数分钟后将纺丝液转移至注射器中,电压为18kV,注射泵推进速度为0.4ml/h,采用铝箔接收,接收距离为18cm,得负载水溶性维生素E的丝素蛋白纳米纤维膜。
效果实施例1
生物相容性检测
(1)材料制备及处理
如前述实施例1,2,3方法配制溶液并采用实施例1,2,3方法中的其他纺丝参数,采用直径为14mm的圆形盖玻片接收静电纺纳米纤维,将纤维膜放置于真空干燥箱中干燥,置于75%(v/v)乙醇蒸汽中24h,进行材料的后处理及消毒灭菌,用于细胞培养。
其中:使用质量浓度为25%的纯丝素蛋白纺丝液,电压为20kV,注射泵推进速度为0.3ml/h,采用直径为14mm的圆形盖玻片接收静电纺纳米纤维,接收距离为18cm,作为对比实施例1中的纳米纤维组。采用14mm的圆形盖玻片,作为对比实施例2中的玻片组。
对照组同样置于75%(v/v)乙醇蒸汽中24h,进行材料的后处理及消毒灭菌,用于细胞培养。
(2)MTT实验
将104个/mL的成纤维细胞悬液接种于24孔培养板中经消毒的实施例1,2,3和对比实施例1,2,每孔接种细胞悬液200μL,每组3孔。分别培养1d、3d、5d和7d后,每组3孔换加不含血清的培养液360μL和MTT溶液(5mg/mL)40μL,培养箱培养3~4h,吸去孔内培养液,每孔加入400μL二甲基亚砜,振荡30min使结晶物溶解。每孔各取二甲基亚砜溶解液100μL加入96孔酶标板中,然后在酶标仪上用492nm波长段测OD值。每组设3复孔,并重复实验3次。结果如附图5所示:
MTT效果:
附图5为成纤维细胞在不同维生素E浓度下的纳米纤维支架上培养1、3、5、7天的增殖情况。与玻片相比(对比实施例2),细胞在静电纺纳米纤维支架上都有更好的增殖。培养7天后,细胞在负载有维生素E及纯丝素纳米纤维支架上(实施例1,2以及对比实施例1)的增殖明显快于玻片组,存在显著性差异(P<0.05)。由此可知,负载维生素的丝素蛋白复合纳米纤维具有优良的生物相容性。
效果实施例2
抗氧化性能:
细胞按实验室常规操作接种至材料上培养至融合度达到90%(生长面积覆盖约90%),加入不同浓度的氧化剂t-BHP(50,100,200,400μM),共同培养24小时,随后使用PBS缓冲液洗3遍,每孔加入预热的DMEM培养基360μL,然后加入预热的MTT 40μL继续培养4小时,吸出培养基,每孔加入DMSO 400μL,在37℃摇床中溶解20min,形成紫色溶液,然后用移液枪吸取溶液加入96孔培养板中,每孔100μL,测定吸光值。
抗氧化结果:
t-BHP可以诱导成纤维细胞的细胞损伤及凋亡,常用作氧化损伤模型,本实施例考察负载维生素的丝素蛋白纳米纤维支架是否有助于皮肤细胞对抗t-BHP造成的氧化损伤。从附图6中可以看出,玻片对照组(对比实施例2)上的皮肤成纤维细胞活力随着t-BHP浓度的增大呈现显著递减趋势。而在混纺维生素E的丝素蛋白纳米纤维组中,低浓度的t-BHP(50-100μM)并未对其细胞活性造成影响,反而轻微地增加了其活性(与未添加t-BHP的纯培养基组相比),t-BHP浓度增加至200μM以上时,细胞的活性也保持在85%左右(与未添加t-BHP的纯培养基组相比)。而在纯丝素纳米纤维组中(对比实施例1),当培养基中的t-BHP浓度增加为400μM时,细胞的活性仅为72%左右,其抗氧化效果不及添加有维生素E的纳米纤维组。在混纺维生素E的丝素蛋白纳米纤维组间并没有观察到显著性的差异。维生素E的抗氧化作用早已为人们所知晓,而TPGS中的维生素E的含量大约为25%,且有研究表明,TPGS清除活性氧效果要优于TOS(维生素E琥珀酸酯)。上述结果表明,混纺维生素E的丝素蛋白纳米纤维有助于皮肤成纤维细胞对抗氧化损伤。
对比实施例3
加入水溶性维生素E对纺丝效率的影响:
如实施例1方法配制溶液。
对比实施例1:不加入维生素E,但其他物质的配比均参考实施例1中的方法配制溶液。
将实施例1与对比实施例1的溶液,采用实施例1中的纺丝参数,经10分钟的静电纺丝后,取下用于接受的金属薄膜,将它进行SEM的表征,结果如附图7所示:
从图中可知,加入水溶性维生素E的溶液,其成丝效率更高,对比实施例1中仅仅为一些稀疏的纤维,而在实施例1的电镜照片中,纤维则多得多。说明加入水溶性维生素E带来了意想不到的技术效果,大大提高了使用水溶液静电纺丝得到丝素蛋白纳米纤维。

Claims (5)

1.一种负载水溶性维生素E的丝素蛋白纳米纤维膜的制备方法,包括:
(1)将水溶性维生素E加热至融化,搅拌均匀,随后于80~100℃加入相对于维生素E质量4-9倍的去离子水,搅拌10-20min至透明的澄清液体,即维生素E溶液;
(2)在上述维生素E溶液中加入丝素蛋白及去离子水至终浓度,搅拌至丝素蛋白完全溶解,得丝素蛋白-维生素E溶液;其中,维生素E的终浓度为0.1-2wt%,丝素蛋白的终浓度为20-35wt%;
(3)将上述丝素蛋白-维生素E溶液移入注射器中进行静电纺丝,即得丝素蛋白纳米纤维膜。
2.根据权利要求1所述的一种负载水溶性维生素E的丝素蛋白纳米纤维膜的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中的丝素蛋白的制备方法为:将去蛹蚕茧在100℃的0.5wt%Na2CO3水溶液中煮2-5次,每次30min进行脱胶,得到丝素,用摩尔比为1:2:8的CaCl2、C2H5OH和H2O或用0.8g/ml LiBr水溶液在40-60℃溶解1-2h,用蒸馏水透析3-5天,冷冻干燥即得。
3.根据权利要求1所述的一种负载水溶性维生素E的丝素蛋白纳米纤维膜的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中的维生素E的终浓度为0.5-2wt%。
4.根据权利要求1所述的一种负载水溶性维生素E的丝素蛋白纳米纤维膜的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中的丝素蛋白的终浓度为25-30wt%。
5.根据权利要求1所述的一种负载水溶性维生素E的丝素蛋白纳米纤维膜的制备方法,其特征在于:所述步骤(3)中的静电纺丝的工艺条件为:静电压为16-20千伏,接受距离为80-220mm,纺丝速率为0.1-1.0毫升/小时。
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