CN103728383A

CN103728383A - 一种药物组合物的质量检测方法

Info

Publication number: CN103728383A
Application number: CN201310715417.1A
Authority: CN
Inventors: 陈晓军; 廖厚知; 黄园; 阮碧芳; 莫少红; 梁月钊; 梁霞; 廖九明
Original assignee: BOKE PHARMACEUTICAL Co Ltd GUANGXI
Current assignee: BOKE PHARMACEUTICAL Co Ltd GUANGXI
Priority date: 2013-12-23
Filing date: 2013-12-23
Publication date: 2014-04-16

Abstract

本发明公开了一种药物组合物的质量检测方法，该药物组合物的原料药材中含有三七，该质量检测方法采用高效液相色谱法测定药物组合物中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量。本发明是一种分离度好、成本低、可操作性强的质量检测方法，可用于含三七药物组合物，以控制药物组合物中三七的加入量，有效地保证产品的质量，同时更有利于工业化生产的应用。

Description

一种药物组合物的质量检测方法

技术领域

本发明属于药物的质量检测技术领域，具体涉及一种药物组合物中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的质量检测方法。

背景技术

三七，为五加科植物三七Panax notoginseng (Burk．)F．H．Chen的干燥根和根茎，具有散瘀止血、消肿定痛的功效，可用于咯血、吐血、衄血、便血、崩漏、外伤出血、胸腹刺痛、跌扑肿痛，为常用名贵中药，很多药物组合物中含有此药材。之前，我公司已获得“一种药物组合物及其制备方法”的发明专利，专利号为“ZL 2009 1 0113826.8”，该药物组合物含有三七，具有散寒除湿，活血止痛的作用，临床用于寒湿阻络所引起的肩痛症的辅助治疗。为确保该药物组合物的质量，需对其中的三七有效成分进行检测，在现有技术中，方法主要有：薄层色谱扫描法，高效液相色谱法等。由于薄层色谱法存在检测灵敏度较低，重复性差，偏差大，方法较复杂等缺点，我们选择并建立了分离度好、简单易行、成本低廉的高效液相色谱法对该药物组合物中三七所含有效成分进行检测。《中国药典》2010年版中对三七药材采用高效液相色谱法测定人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的总量，但采用该方法制备的供试品溶液，杂质多、分离度不好、干扰很大，无法准确测定该药物组合物中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种分离度好、简单易行，成本低廉，能同时对人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1进行质量检测的方法，进而更好的确保产品的质量和功效，同时更有利于工业化生产的应用。

本发明以如下方案解决上述技术问题：

一种药物组合物的质量检测方法，该药物组合物的原料药材中含有三七，该药物组合物质量检测方法如下：

用高效液相色谱法测定药物组合物中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量；

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水为流动相，其中乙腈为流动相A，水为流动相B，按流动相梯度洗脱表进行洗脱；流动相速度1.0ml/min；检测波长为203nm；

流动相梯度洗脱表：

时间(分钟)	流动相A(%)	流动相B(%)
			0～12	19	81
12～60	19→36	81→64

对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品和三七皂苷R1对照品适量，加甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg10.4mg、人参皂苷Rb10.4mg和三七皂苷R10.1mg的混合溶液；

供试品溶液的制备：精密量取本品适量，置水浴上蒸至近干，加水使溶解，滤过，置分液漏斗中，用少量水洗涤滤器，洗液并入分液漏斗中，加氨试液适量，摇匀，用乙醚振摇提取，弃去乙醚液，水溶液再用水饱和的正丁醇提取4～5次，正丁醇提取液依次用同一正丁醇饱和的氨试液洗涤，弃去氨试液洗涤液，合并正丁醇液，蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定：在色谱条件下，分别进对照品溶液、供试品溶液5～20μl；以相对保留时间定性，以峰面积定量。

以上所述供试品溶液的制备方法，可以优化为：精密量取本品5～20ml，置水浴上蒸至近干，加水20～100ml使溶解，滤过，置分液漏斗中，用少量水洗涤滤器，洗液并入分液漏斗中，加氨试液2～10ml，摇匀，用乙醚振摇提取1～3次，每次50ml，弃去乙醚液，水溶液再用水饱和的正丁醇提取5次，每次20～50ml，正丁醇提取液依次用同一正丁醇饱和的氨试液20～50ml洗涤，弃去氨试液洗涤液，合并正丁醇液，蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

以上所述供试品溶液的制备方法，进一步优化为：精密量取本品5ml，置水浴上蒸至近干，加水30ml使溶解，滤过，置分液漏斗中，用少量水洗涤滤器，洗液并入分液漏斗中，加氨试液5ml，摇匀，用乙醚振摇提取2次，每次50ml，弃去乙醚液，水溶液再用水饱和的正丁醇提取5次，每次20ml，正丁醇提取液依次用同一正丁醇饱和的氨试液20ml洗涤，弃去氨试液洗涤液，合并正丁醇液，蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

以上所述药物组合物的质量检测方法，是针对同时含有人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1 3种成分药物组合物制定的，该药物组合物的阴性样品在相应位置没有干扰并经方法学验证合格，均可采用。中药三七中同时含有人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1 3种成分，可通过这3种成分的测定，来控制药物组合物中三七的加入量，确保药品质量。

本发明药物组合物所含成分人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的质量检测方法，通过大量试验研究对比，是一种分离度好、成本低、可操作性强的质量检测方法，可更有效地保证产品的质量，同时更有利于工业化生产的应用。

通过阅读下面的描述和所附的权利要求书，可更好地理解本发明的这些和其他的特征、方面和优点。

具体实施方式

虽然本说明书通过特别指出并清楚要求保护本发明的权利要求书作出结论，但应该相信下列说明将更好地理解本发明。

本文所述的“药物组合物”是指含有三七的药物组合物，如之前我公司向国家知识产权局申请并获得授权的专利号为 “ZL 2009 1 0113826.8”，名称为“一种组合物及其制备方法”发明专利，该药物组合物由如下原料药制成：羌活35-50重量份、独活25-40重量份、伸筋草35-60重量份、两面针15-40重量份、威灵仙15-40重量份、秦艽5-30重量份、桂枝5-30重量份、木瓜5-30重量份、鸡血藤30-70重量份、三七20-50重量份、当归20-50重量份、红花5-30重量份、川芎5-30重量份。双活止痛酊为该药物组合物的酊剂剂型，其制法是：取方中各药味，粉碎成粗粉，照流浸膏剂与浸膏剂项下的渗漉法（中国药典2010年版一部附录I O），用60%乙醇作溶剂，浸渍24小时后，渗漉，收集渗漉液至药材总量的5倍量，搅匀，滤过，灌装，即得。

除非另外指明，下文中所用的所有百分比和比率均按《中国药典》2010版一部执行。除非另外指明，本文中所涉及成分的所有百分比、比率和含量均基于该成分的实际含量，而不包括在市售产品中可以与这些成分结合在一起的溶剂、填料或其它物质。

本发明药物组合物的质量检测方法方法学研究如下：

仪器：Waters 2695高效液相色谱仪；Waters 2487紫外检测器；十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(岛津VP-ODS柱，4.6×150mm)，保护柱：YWG C₁₈ 10×4.6mm；Empower色谱工作站；岛津UV-2450分光光度仪；梅特勒-托利多AB265-S电子天平。

试药：人参皂苷Rg1化学对照品（含量测定用，批号：110703-200424），人参皂苷Rb1化学对照品（含量测定用，批号：110704-200318），三七皂苷R1化学对照品（含量测定用，批号：110745-200312），均购于中国药品生物制品检定研究院，纯度检查符合含量测定用化学对照品的技术要求，含量分别为98.50%，98.73%，98.42%；乙腈（色谱纯），水（自制双蒸水）。

样品：双活止痛酊及缺三七的阴性对照样品，由广西博科药业有限公司提供。

对照品溶液的制备精密称取人参皂苷Rg1对照品10.02mg，置5ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀（储备液A）；精密称取人参皂苷Rb1对照品10.01mg，置5ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀（储备液B）；精密称取三七皂苷R1对照品10.19mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀（储备液C）。分别精密量取储备液A 2ml、储备液B 2ml、储备液C 1ml置10ml量瓶中,加甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg10.4008mg、人参皂苷Rb10.4004mg 和三七皂苷R10.1019mg的混合溶液，即得。

供试品溶液的制备精密量取本品5ml，置水浴上蒸至近干，加水30ml使溶解，滤过，置分液漏斗中，用少量水洗涤滤器，洗液并入分液漏斗中，加氨试液5ml，摇匀，用乙醚振摇提取2次，每次50ml，弃去乙醚液，水溶液再用水饱和的正丁醇提取5次，每次20ml，正丁醇液依次用同一正丁醇饱和的氨试液20ml洗涤，合并正丁醇液，蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性样品溶液的制备阴性样品溶液是按处方比例称取除三七外的药味，按制法制成三七阴性制剂，再取此阴性制剂按上述“供试品溶液的制备”方法制备不含三七的阴性样品溶液。

试验条件十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(岛津VP-ODS柱，4.6×150mm)，保护柱：YWG C₁₈ 10×4.6mm。流动相见表1；流速：1.0ml/min，柱温：室温；检测波长203nm。

表1 流动相表

时间(分钟)	流动相A(%)	流动相B(%)
			0～12	19	81
12～60	19→36	81→64

分别吸取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的混合溶液对照品溶液、供试品溶液及不含三七的阴性样品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。此条件下三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1与其它组分基本达到基线分离，分离度R>1.5。理论板数按三七皂苷R1峰计算应不低于4000，三七皂苷R1保留时间约为22分钟，人参皂苷Rg1保留时间约为26分钟、人参皂苷Rb1保留时间约为53分钟。阴性样品溶液色谱在相应位置无吸收峰，可见阴性无干扰。

供试品溶液的制备中考察了直接滤过进样，但色谱杂质峰多，与主峰不能分离；采用乙醚进行除杂时，结果萃取过程较易乳化，加氨试液后乳化得以消除；考察了水饱和正丁醇的提取次数，结果提取第6次时色谱图中已无相应色谱峰出现，说明提取5次即可保证提取完全；考察了正丁醇提取液的洗涤方法，曾试验采取合并正丁醇液后用正丁醇饱和的氨试液一次洗涤，结果洗涤液中含有主成分，而采用同一正丁醇饱和的氨试液依次洗涤的方法，洗涤液中不含有主成分，故采用。

方法学验证结果对照品纯度检查：以峰面积归一化法计算，人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1含量分别为100%，98.72%，98.66%，符合含量测定要求，计算时均按100%计算。线性关系考察：三七皂苷R1的回归方程：A =2.98×10⁵C-2.36×10³,r=0.9999，表明三七皂苷R1进样量在0.259～2.072μg范围内线性关系良好，并且直线通过原点，可用单点外标法进行测定和计算；人参皂苷Rg1的回归方程：A =3.39×10⁵C-1.50×10³,r=0.9999，表明人参皂苷Rg1进样量在1.015～8.12μg范围内线性关系良好，并且直线通过原点，可用单点外标法进行测定和计算；人参皂苷Rb1的回归方程：A =2.59×10⁵C+2.69×10⁴,r=0.9999，表明人参皂苷Rb1进样量在1.001～8.008μg范围内线性关系良好，并且直线通过原点，可用单点外标法进行测定和计算。精密度试验：三七皂苷R1的平均值为304707，RSD为0.35%，人参皂苷Rg1的平均值为1385556，RSD为0.96%，人参皂苷Rb1的平均值为1052101，RSD为0.08%，表明精密度均较好。稳定性试验：考察了供试品溶液在24小时内的稳定性，结果三七皂苷R1的峰面积平均值为278558，RSD为1.25%，人参皂苷Rg1的峰面积平均值为1515688，RSD为1.12%，人参皂苷Rb1的峰面积平均值为1048600，RSD为0.87%，表明供试品溶液在24h内稳定性均好。重复性试验：取同一批样品平行检测6次，结果三七皂苷R1的含量平均值为0.1954 mg/ml，RSD为1.40%，人参皂苷Rg1的含量平均值为0.892 mg/ml，RSD为1.60%，人参皂苷Rb1的含量平均值为0.806 mg/ml，RSD为1.26%，表明方法重复性均较好。加样回收率试验：三七皂苷R1的平均回收率为97.6%，RSD为1.76%，人参皂苷Rg1的平均回收率为102.6%，RSD为1.59%，人参皂苷Rb1的平均回收率为100.0%，RSD为1.88%，表明方法回收率均较好。

具体实施例如下：

实施例1：

色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水为流动相，其中乙腈为流动相A，水为流动相B，按流动相梯度洗脱表进行洗脱；流动相速度1.0ml/min；检测波长为203nm；理论板数按三七皂苷R1计算应不低于4000；

流动相梯度洗脱表：

时间(分钟)	流动相A(%)	流动相B(%)
			0～12	19	81
12～60	19→36	81→64

对照品溶液的制备精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品和三七皂苷R1对照品适量，加甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg10.4mg、人参皂苷Rb10.4mg和三七皂苷R10.1mg的混合溶液，即得；

供试品溶液的制备精密量取本品5ml，置水浴上蒸至近干，加水30ml使溶解，滤过，置分液漏斗中，用少量水洗涤滤器，洗液并入分液漏斗中，加氨试液5ml，摇匀，用乙醚振摇提取2次，每次50ml，弃去乙醚液，水溶液再用水饱和的正丁醇提取5次，每次20ml，正丁醇提取液依次用同一正丁醇饱和的氨试液20ml洗涤，弃去氨试液洗涤液，合并正丁醇提取液，蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定在色谱条件下，分别进对照品溶液、供试品溶液10μl；以相对保留时间定性，以峰面积定量。

实施例2：

流动相梯度洗脱表：

时间(分钟)	流动相A(%)	流动相B(%)
			0～12	19	81
12～60	19→36	81→64

供试品溶液的制备精密量取本品10ml，置水浴上蒸至近干，加水20ml使溶解，滤过，置分液漏斗中，用少量水洗涤滤器，洗液并入分液漏斗中，加氨试液2ml，摇匀，用乙醚30ml振摇提取，弃去乙醚液，水溶液再用水饱和的正丁醇提取4次，每次20ml，正丁醇提取液依次用同一正丁醇饱和的氨试液30ml洗涤，弃去氨试液洗涤液，合并正丁醇提取液，蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定在色谱条件下，分别进对照品溶液、供试品溶液5μl；以相对保留时间定性，以峰面积定量。

实施例3：

流动相梯度洗脱表：

时间(分钟)	流动相A(%)	流动相B(%)
			0～12	19	81
12～60	19→36	81→64

供试品溶液的制备精密量取本品20ml，置水浴上蒸至近干，加水100ml使溶解，滤过，置分液漏斗中，用少量水洗涤滤器，洗液并入分液漏斗中，加氨试液5ml，摇匀，用乙醚振摇提取3次，每次50ml，弃去乙醚液，水溶液再用水饱和的正丁醇提取5次，每次50ml，正丁醇提取液依次用同一正丁醇饱和的氨试液50ml洗涤，弃去氨试液洗涤液，合并正丁醇提取液，蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定在色谱条件下，分别进对照品溶液、供试品溶液20μl；以相对保留时间定性，以峰面积定量。

Claims

1.一种药物组合物的质量检测方法，其特征在于，该药物组合物的原料药材中含有三七，该药物组合物质量检测方法如下：

流动相梯度洗脱表：

时间(分钟) 流动相A(%) 流动相B(%) 0～12 19 81 12～60 19→36 81→64

2.根据权利要求1所述药物组合物的质量检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法为：精密量取本品5～20ml，置水浴上蒸至近干，加水20～100ml使溶解，滤过，置分液漏斗中，用少量水洗涤滤器，洗液并入分液漏斗中，加氨试液2～10ml，摇匀，用乙醚振摇提取1～3次，每次50ml，弃去乙醚液，水溶液再用水饱和的正丁醇提取5次，每次20～50ml，正丁醇提取液依次用同一正丁醇饱和的氨试液20～50ml洗涤，弃去氨试液洗涤液，合并正丁醇液，蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.根据权利要求1或2所述药物组合物的质量检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法为：精密量取本品5ml，置水浴上蒸至近干，加水30ml使溶解，滤过，置分液漏斗中，用少量水洗涤滤器，洗液并入分液漏斗中，加氨试液5ml，摇匀，用乙醚振摇提取2次，每次50ml，弃去乙醚液，水溶液再用水饱和的正丁醇提取5次，每次20ml，正丁醇提取液依次用同一正丁醇饱和的氨试液20ml洗涤，弃去氨试液洗涤液，合并正丁醇液，蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4.根据权利要求1所述药物组合物的质量检测方法，其特征在于，所述药物组合物的原料药材中还含有：羌活、独活、伸筋草、两面针、威灵仙、秦艽、桂枝、木瓜、鸡血藤、当归、红花、川芎。

5.根据权利要求4所述药物组合物的质量检测方法，其特征在于，所述药物组合物的原料药材的重量份分别为：羌活35-50份、独活25-40份、伸筋草35-60份、两面针15-40份、威灵仙15-40份、秦艽5-30份、桂枝5-30份、木瓜5-30份、鸡血藤30-70份、三七20-50份、当归20-50份、红花5-30份、川芎5-30份。

6.根据权利要求1-4中任一所述药物组合物的质量检测方法，其特征在于，该质量检测方法在含三七药物组合物质量研究中的应用。