CN103724434B - 用于猪繁殖与呼吸综合征病毒检测的重组蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于猪繁殖与呼吸综合征病毒检测的重组蛋白，由抗人红细胞表面H抗原单链抗体基因和抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单链抗体基因拼接而成的融合基因所编码。该重组蛋白具有双功能特性，它既能够与人红细胞结合但不会发生凝集，又能够与猪繁殖与呼吸综合征病毒结合，在病毒桥联作用下发生肉眼可观察到的凝集现象。本发明获得的重组蛋白可用于猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测，操作简单、灵敏度高且特异性强，满足了基层现场使用快速、简便的要求。
Description
技术领域
本发明属于重组蛋白技术领域，尤其涉及一种用于猪繁殖与呼吸综合征病毒检测的重组蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)，又称“猪蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起猪的一种急性、高度接触性传染病，临床上主要表现为妊娠母猪晚期流产、早产、产死胎、木乃伊胎等繁殖障碍和各种年龄猪特别是仔猪的严重呼吸道疾病。该病于1987年最早发生在美国,此后相继在各主要养猪国家发生,现已呈世界性分布，给养猪业造成严重危害。我国于1996年首次分离到PRRSV，此后在我国广泛流行，特别是2006年5月以来我国又新发生一种以高热和急性发病死亡为主要临床特征的“高致病性猪蓝耳病”（H-PRRS），该病的发病率可高达50%-100%，死亡率为20%-100%，已成为当前危害我国养猪业的头号疫病。
及时、准确的对PRRSV进行检测，是诊断、预防和控制PRRS的前提。目前PRRSV的检测技术包括病毒分离鉴定、病毒中和试验、免疫过氧化物酶单层试验、间接免疫荧光抗体试验、免疫组织化学法、酶联免疫吸附试验、反转录-聚合酶链反应、实时荧光定量反转录-聚合酶链反应、原位杂交技术、基因芯片技术、反转录-环介导等温扩增技术等，但是这些检测方法要求较高，需要配备专门的仪器和专业技术人员，检测成本昂贵，而且耗时相对较长，这极大地限制了其在基层单位的应用。我国仍然以农村中小规模猪场为主体，这些猪场由于受经济、技术条件的限制，无法建立自己的检测实验室，因此急需建立一种快速、简便、成本低，不需要特殊仪器设备，适合基层和现场使用的PRRSV检测试剂和方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用于猪繁殖与呼吸综合征病毒检测的重组蛋白及其制备方法和应用，以便于实现基层现场快速、简便检测PRRSV的目的。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：用于猪繁殖与呼吸综合征病毒检测的重组蛋白，由抗人红细胞表面H抗原单链抗体基因和抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单链抗体基因拼接而成的融合基因所编码。
融合基因具有序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列。
上述重组蛋白具有序列表SEQ.ID.No.2的氨基酸序列。
上述重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
<1>分别从分泌抗人红细胞H抗原单克隆抗体和抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA作为RT-PCR反应的模板，扩增出重链可变区基因和轻链可变区基因；
<2>采用SOE-PCR方法将步骤<1>获得的两组重链可变区基因和轻链可变区基因分别拼接成单链抗体基因；
<3>将步骤<2>获得的两个单链抗体基因通过SOE-PCR方法拼接成融合基因；
<4>将步骤<3>获得的融合基因插入到原核表达载体中构建重组质粒，转化入大肠杆菌表达菌株，在IPTG的诱导下表达出重组蛋白。
步骤<2>中的单链抗体基因是在重链可变区基因和轻链可变区基因之间插入一段Linker连接序列而得，Linker连接序列具有序列表SEQ.ID.No.3的碱基序列。
步骤<3>中的两个单链抗体基因分别具有序列表SEQ.ID.No.4和SEQ.ID.No.5的碱基序列，融合基因具有序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列。
上述的制备方法，还包括以下步骤：
<5>将步骤<4>获得的重组蛋白经纯化、复性后得具有生物学活性的重组蛋白。
上述重组蛋白在制备检测猪繁殖与呼吸综合征病毒试剂方面的应用。
1988年，Kemp等首先报道了建立检测HIV抗体的自体红细胞凝集试验快速检测方法，只需采集待检人一滴血，5min内即可得到结果，操作程序简单，目测诊断结果，无需昂贵的特殊仪器和专门技术人员。其基本原理是：以红细胞作为指示剂，利用重组双功能融合蛋白既能与红细胞结合又能与被检抗体/抗原结合的性质，通过被检样品中抗体/抗原的桥联作用，使红细胞发生肉眼可见的凝集，根据红细胞的凝集情况即可快速进行结果判定。
基于前述原理，发明人构建了具有双功能特性的重组蛋白，它既能够与人红细胞结合但不会发生凝集，又能够与猪繁殖与呼吸综合征病毒结合，在病毒桥联作用下发生肉眼可观察到的凝集现象。该重组蛋白由抗人红细胞表面H抗原单链抗体基因和抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单链抗体基因拼接而成的融合基因所编码，具体制备按以下操作：分别从分泌抗人红细胞H抗原单克隆抗体和抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA作为RT-PCR反应的模板，扩增出重链可变区基因和轻链可变区基因，用SOE-PCR方法分别将两组重链、轻链可变区基因拼接成单链抗体基因，然后将两个单链抗体基因通过SOE-PCR方法拼接成融合基因，将其经克隆、转化大肠杆菌后获得重组菌，并按常规方法诱导表达，表达产物经纯化、复性后即得。本发明获得的重组蛋白可用于猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测，操作简单、灵敏度高且特异性强，满足了基层现场使用快速、简便的要求。
具体实施方式
一、抗人红细胞H抗原单链抗体基因的构建
1.抗体可变区基因的克隆
1.1引物设计
根据单克隆抗体可变区基因序列设计并合成引物（表1）。
表1单克隆抗体可变区基因扩增引物
引物由北京博迈德生物公司合成。其中，引物VH-F、VH-R用于扩增抗体重链可变区基因，引物VL-F、VL-R用于扩增抗体轻链可变区基因。
1.2CDNA的制备
在细胞培养瓶中培养分泌抗人红细胞H抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞（1×106），采用TRIzol法提取细胞总RNA,再以总RNA为模板，oligo（dT）18为引物，按照反转录酶说明书进行反转录，获得CDNA。
1.3目的基因的扩增
以CDNA为模板，用引物VH-F、VH-R扩增抗体重链可变区基因，引物VL-F、VL-R扩增抗体轻链可变区基因。PCR扩增条件均为：95℃预变性2min；94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，进行30个循环；最后72℃延伸10min。
1.4目的基因的克隆
用DNA凝胶回收试剂盒纯化回收PCR产物，将回收产物与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒，经PCR和双酶切鉴定阳性克隆后送生物公司测序。
2.单链抗体基因的构建
2.1引物设计
根据克隆所得到的抗人红细胞H抗原单克隆抗体的轻、重链可变区基因序列，设计并合成单链抗体基因扩增引物（表2）。
表2单链抗体基因扩增引物
引物由北京博迈德生物公司合成。其中，引物P1、P2用于扩增抗体重链可变区基因，引物P3、P4用于扩增抗体轻链可变区基因。P2、P3下划线部分为引入的互补连接肽序列（Linker）。
2.2单链抗体基因的扩增
以含抗体轻、重链可变区基因的阳性质粒为模板，用引物P1、P2扩增抗体重链可变区基因，用引物P3、P4扩增抗体轻链可变区基因。PCR扩增条件均为：95℃预变性2min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，进行30个循环；最后72℃延伸10min。
2.3单链抗体基因的拼接及克隆
用DNA凝胶回收试剂盒纯化回收PCR产物，取回收的轻、重链可变区基因片段各2μL互为引物和模板，采用SOE-PCR方法进行拼接，扩增条件为：95℃预变性2min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，进行7个循环；然后加入引物P1、P4，扩增条件不变，继续进行28个循环；最后72℃延伸10min。将PCR产物纯化回收后与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒，经PCR和双酶切鉴定阳性克隆后送生物公司测序（序列表SEQ.ID.No.4，对应氨基酸序列见序列表SEQ.ID.No.6）。
二、抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单链抗体基因的构建
1.抗体可变区基因的克隆
1.1引物设计
根据单克隆抗体可变区基因序列设计并合成引物（表3）。
表3单克隆抗体可变区基因扩增引物
引物由北京博迈德生物公司合成。其中，引物VH-F、VH-R用于扩增抗体重链可变区基因，引物VL-F、VL-R用于扩增抗体轻链可变区基因。
1.2CDNA的制备
在细胞培养瓶中培养分泌抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞（1×106），采用TRIzol法提取细胞总RNA,再以总RNA为模板，oligo（dT）18为引物，按照反转录酶说明书进行反转录，获得CDNA。
1.3目的基因的扩增
以CDNA为模板，用引物VH-F、VH-R扩增抗体重链可变区基因，引物VL-F、VL-R扩增抗体轻链可变区基因。PCR扩增条件均为：94℃预变性4min；95℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s，进行30个循环；最后72℃延伸10min。
1.4目的基因的克隆
用DNA凝胶回收试剂盒纯化回收PCR产物，将回收产物与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒，经PCR和双酶切鉴定阳性克隆后送生物公司测序。
2.单链抗体基因的构建
2.1引物设计
根据克隆所得到的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的轻、重链可变区基因序列，设计并合成单链抗体基因扩增引物（表4）。
表4单链抗体基因扩增引物
引物由北京博迈德生物公司合成。其中，引物P1、P2用于扩增抗体重链可变区基因，引物P3、P4用于扩增抗体轻链可变区基因。P2、P3下划线部分为引入的互补连接肽序列（Linker）。
2.2单链抗体基因的扩增
以含抗体轻、重链可变区基因的阳性质粒为模板，用引物P1、P2扩增抗体重链可变区基因，用引物P3、P4扩增抗体轻链可变区基因。PCR扩增条件均为：94℃预变性4min；95℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸45s，进行30个循环；最后72℃延伸10min。
2.3单链抗体基因的拼接及克隆
用DNA凝胶回收试剂盒纯化回收PCR产物，取回收的轻、重链可变区基因片段各2μlL互为引物和模板，采用SOE-PCR方法进行拼接，扩增条件为94℃预变性4min；95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，进行7个循环；然后加入引物P1、P4，扩增条件不变，继续进行28个循环；最后72℃延伸10min。将PCR产物纯化回收后与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒，经PCR和双酶切鉴定阳性克隆后送生物公司测序（序列表SEQ.ID.No.5，对应氨基酸序列见序列表SEQ.ID.No.7）。
三、重组蛋白的制备
1.重组PCR引物设计与合成
根据SOE-PCR的原理和抗人红细胞H抗原单链抗体与抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单链抗体基因序列，设计4条重组PCR引物(表5)。其中引物P1、P2用于扩增抗人红细胞H抗原单链抗体基因，引物P3、P4用于扩增抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单链抗体基因。P23′末端15个碱基和P35′端15个碱基为互补序列(下划线部分)用于基因的拼接。
P1和P4中的下划线部分为便于克隆分别引入的BamHI、NheI酶切位点。引物均由北京博迈德生物公司合成。
表5重组PCR引物
2.融合基因原核表达载体的构建及鉴定
分别以含抗人红细胞H抗原单链抗体基因和抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单链抗体基因的阳性质粒为模板，用引物P1、P2扩增抗人红细胞H抗原单链抗体基因，用引物P3、P4扩增抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单链抗体基因。PCR扩增条件均为：95℃预变性5min；95℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，进行30个循环；最后72℃延伸10min。以纯化后的上述2种单链抗体基因片段互为引物和模板，采用SOE-PCR方法拼接成融合基因。第一轮PCR反应体系为：2种单链抗体基因各0.5μL、10×Buffer2.5μL、5U/μLkod-plus高保真酶0.5μL，10mmol/LdNTPs2.5μL、用灭菌双蒸水加至总体积25μL。PCR反应条件为：95℃5min，95℃1min，58℃1min，72℃2min，7个循环。反应结束后，在反应体系中加入引物P1和P4各0.5μL，然后95℃5min；95℃1min，58℃1min，72℃2min，30个循环；最后72℃10min。将PCR产物纯化回收后与pMD18-TSimple载体连接，转化DH5α感受态细胞，提取质粒，经PCR及BamHI、NheI双酶切鉴定后送生物公司测序（序列表SEQ.ID.No.1）。测序正确后将融合基因亚克隆至原核表达载体pET-DsbA中。
3.融合基因的诱导表达
将鉴定正确的原核表达质粒转化入BL21(DE3)PlysS中进行IPTG诱导表达，在诱导表达的200mL菌液中加入溶菌酶，30℃作用30min，用细胞破碎仪破碎处理，收集沉淀，沉淀分别用1mol/LNaCl和5.0g/LTritonx-100洗涤两遍，最后用8mol/L尿素溶解12h，12000rpm离心15min，得到20mL上清液。
4.重组蛋白的纯化与复性
将20mL上清液采用Ni+亲和层析法和谷胱甘肽再氧化法对融合蛋白进行纯化和复性，复性24h后，用20mmol/LTris-HCl(pH8.5)透析48h，每6h换液一次，用PEG20000浓缩复性后蛋白，最终获得2mL重组蛋白（序列表SEQ.ID.No.2），用BCA蛋白定量试剂盒测定重组蛋白浓度为1.2mg/mL。
四、重组蛋白双功能特性的验证
分别取PRRSV抗原阴、阳性血清各5份，每孔取50μL滴加于血凝板中，再滴加50μL/孔复性后重组蛋白（0.3μg/μL），最后每孔加入20μL2％醛化O型人红细胞进行红细胞凝集试验，结果显示5份PRRSV抗原阳性血清均可观察到强凝集现象，而5份PRRSV抗原阴性血清未观察到凝集现象。同时用50μL/孔重组蛋白（0.3μg/μL）分别与2％醛化O、A、B、AB型人红细胞(20μL/孔)均匀混合后加入PRRSV抗原阳性血清，30min后观察，结果显示各种血型均可观察到强凝集现象。
结论：经红细胞凝集试验证实该重组蛋白既能够与人不同血型红细胞结合，又能够与PRRSV反应，具有双功能特性。
五、重组蛋白特异性验证
分别取猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、PRRSV抗原阳性血清、PRRSV抗原阴性血清各50μL滴加于血凝板中，再滴加50μL/孔复性后重组蛋白（0.3μg/μL），最后每孔加入20μL2％醛化O型人红细胞进行红细胞凝集试验，结果显示仅PRRSV抗原阳性血清出现强凝集现象，其余血清均未观察到凝集现象。结果表明：重组蛋白特异性强，与其它引起猪繁殖障碍性疾病的病毒无交叉反应性。
六、重组蛋白红细胞凝集试验方法与RT-PCR方法符合率验证
利用重组蛋白和2％醛化O型人红细胞建立红细胞凝集试验方法用于PRRSV抗原检测，与RT-PCR方法同时检测50份临床血清样品。结果显示红细胞凝集试验检测出PRRSV阳性样品16份，阴性样品34份；RT-PCR方法检测出PRRSV阳性样品19份，阴性样品31份。阴性符合率为100%，阳性符合率为84.2%，总符合率为94%。结果表明：利用重组蛋白建立的红细胞凝集试验方法与RT-PCR方法的检测结果一致性较好，符合率高。
Claims (6)
1.一种用于猪繁殖与呼吸综合征病毒检测的重组蛋白，其特征在于由抗人红细胞表面H抗原单链抗体基因和抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单链抗体基因拼接而成的融合基因所编码；所述重组蛋白为序列表SEQ.ID.No.2的氨基酸序列，所述融合基因为序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列。
2.根据权利要求1所述重组蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
<1>分别从分泌抗人红细胞H抗原单克隆抗体和抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA作为RT-PCR反应的模板，扩增出重链可变区基因和轻链可变区基因；
<2>采用SOE-PCR方法将步骤<1>获得的两组重链可变区基因和轻链可变区基因分别拼接成单链抗体基因；
<3>将步骤<2>获得的两个单链抗体基因通过SOE-PCR方法拼接成融合基因；
<4>将步骤<3>获得的融合基因插入到原核表达载体中构建重组质粒，转化入大肠杆菌表达菌株，在IPTG的诱导下表达出重组蛋白。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤<2>中的单链抗体基因是在重链可变区基因和轻链可变区基因之间插入一段Linker连接序列而得，Linker连接序列为序列表SEQ.ID.No.3的碱基序列。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤<3>中的两个单链抗体基因分别为序列表SEQ.ID.No.4和SEQ.ID.No.5的碱基序列，融合基因为序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于还包括以下步骤：
<5>将步骤<4>获得的重组蛋白经纯化、复性后得具有生物学活性的重组蛋白。
6.权利要求1所述重组蛋白在制备检测猪繁殖与呼吸综合征病毒试剂方面的应用。
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