CN103687593A

CN103687593A - 组织蛋白酶k抑制用于治疗和/或预防肺动脉高压和/或心力衰竭的用途

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Publication number: CN103687593A
Application number: CN201280035300.2A
Authority: CN
Inventors: S.戈尔茨; M.德尔贝克; H.迈尔; A.格尔茨; T.蒙德里茨基; H.特吕贝尔
Original assignee: Bayer Pharma AG
Current assignee: Bayer Pharma AG; Bayer Intellectual Property GmbH
Priority date: 2011-05-16
Filing date: 2012-05-11
Publication date: 2014-03-26
Anticipated expiration: 2032-05-11
Also published as: KR20140034821A; RU2013155509A; CN103687593B; ZA201308391B; JP2014518868A; EP2709602A1; JP6000340B2; CA2835913A1; MX2013013281A; US20140155383A1; EP2709602B1; ES2648819T3; WO2012156311A1; BR112013029672A2; AU2012257779A1; SG194842A1; US9943522B2; IL229312A0

Abstract

组织蛋白酶K抑制用于治疗和/或预防肺动脉高压和/或心力衰竭的用途。摘要：本发明涉及组织蛋白酶K和/或组织蛋白酶S抑制剂在用于治疗和/或预防肺动脉高压和/或心力衰竭的方法中的用途。

Description

组织蛋白酶K抑制用于治疗和/或预防肺动脉高压和/或心力衰竭的用途

本发明涉及组织蛋白酶K和/或组织蛋白酶S抑制剂在用于治疗和/或预防肺动脉高压和/或心力衰竭的方法中的用途。

发明背景

组织蛋白酶蛋白酶

组织蛋白酶(Cathepsins，古希腊语kata-“下”和hepsein“煮”；缩写CTS)是蛋白酶：分裂其他蛋白的蛋白，其见于很多类型的细胞，包括所有哺乳动物中的细胞。该家族有大约12个成员，其通过它们的结构、催化机制和它们切割的蛋白而有所区别。大部分成员在见于溶酶体中的低pH下变为活化的。因此，该家族的活性几乎完全存在于那些细胞器内。组织蛋白酶在哺乳动物细胞周转例如骨吸收中具有极其重要的作用。它们降解多肽并且通过它们的底物特异性而有所区别。

人基因组的完整序列发表于2003年，编码了总计11个半胱氨酸组织蛋白酶(B、H、L、S、C、K、O、F、V、X和W)。这些也被称为溶酶体蛋白酶，属于木瓜蛋白酶类蛋白酶家族。

组织蛋白酶描述为参与：癌、中风、阿尔茨海默病、关节炎、埃博拉病毒(已经发现组织蛋白酶L和在较小程度上组织蛋白酶B对于病毒进入宿主细胞是必需的)、COPD、慢性牙周炎以及几种眼病症：圆锥角膜、视网膜脱离、年龄相关性黄斑变性、青光眼及其他。

组织蛋白酶 K (CTSK)

组织蛋白酶K (genbank检索号：NM_000396.3 (多核苷酸)和NP_000387.1 (多核苷酸))缩写为CTSK，是在人中由CTSK基因编码的酶。由该基因编码的蛋白是参与骨重建和骨吸收的溶酶体半胱氨酸蛋白酶。该蛋白是肽酶C1蛋白家族的成员，主要表达于破骨细胞中。

人组织蛋白酶K由大约12.1 kb的基因组DNA编码，并且定位至染色体1q21。基因组DNA序列的分析表明八个外显子和七个内含子位于该基因中。转录产物为1.7 kb长。在转录起始开始的50端没有发现TATA/CAAT盒，但在启动子区中鉴定到作为潜在的调节元件的两个一致性Sp1结合位点和一个富含GtC区域(42.5%)。引物延伸分析表明转录起始位点位于甲硫氨酸的上游58 bp处。转录起始可以通过几个推定的转录调节元件来增强：AP1、AP3、H-APF-1、PU.1、ETS-1、PEA3、Mitf、TFE3。组织蛋白酶K作为无活性的前酶原合成，该前酶原包含329个氨基酸(aa)，具有分子量38 ku。它包括15个氨基酸的信号序列、99个氨基酸的前肽和催化部位的全部组成。催化部位由两个共同折叠的结构域组成以产生“V”-形的活性部位裂缝构型(cleft configuration)。中心螺旋是左结构域的最显著的特征，而右结构域主要由b-桶基序占主要地位。活性部位位于两个结构域之间的界面上。前肽包含保守的N-糖基化位点，其可以经甘露糖6-磷酸受体途径将无活性的酶原靶向溶酶体。99 aa的前肽在Arg114和Ala115之间切割成为215个氨基酸的成熟形式[1]。半胱氨酸组织蛋白酶并非严格为溶酶体的，该蛋白酶在吞噬体、内体和溶酶体之间运输，并且在特定生理环境下个别的酶可以在某些细胞器中积累。在由外源氧化剂(活性氧类)导致的溶酶体泄漏后，半胱氨酸组织蛋白酶还被释放进入细胞质中。

组织蛋白酶K是由其对激肽的高特异性所定义的蛋白酶，其参与骨吸收。该酶分解代谢弹性蛋白、胶原和明胶的能力允许其分解骨和软骨。该分解代谢能力还是造成肺气肿中肺弹性和回缩(recoil)的丧失的部分原因。组织蛋白酶K抑制剂，诸如奥达卡替(odanacatib)，在治疗骨质疏松中显示出巨大潜力。组织蛋白酶K还在显著分数的人乳腺癌中表达，其中它能够有助于肿瘤侵袭力。该基因中的突变是致密性成骨不全症的原因，致密性成骨不全症是由骨硬化和身材矮小所表征的常染色体隐性疾病。组织蛋白酶K表达受到在组织伤害后释放的炎性细胞因子的刺激。

CTSK的调节

在破骨细胞分化过程中，成骨细胞/基质细胞产生细胞因子，包括诱导并调节前体向成熟的破骨细胞生长和分化的巨噬细胞菌落刺激因子(M-CSF)和NF-jB配体的受体激活物(RANKL)。通过它与RANKL的相互作用产生的胞内RANK信号转导诱导了细胞质肿瘤坏死因子受体相关的因子(TRAFs)的募集和活化，导致多种信号转导级联，诸如MAPK、NF-jB、Src和Akt的活化。RANKL能够以剂量和时间依赖的方式刺激CTSK表达和启动子活性。调节成骨细胞和基质细胞的RANKL产生的大量试剂也能够调节组织蛋白酶K的表达。刺激物包括维生素D、甲状旁腺激素、TNF-a、糖皮质激素、IL-1、IL-11、甲状腺激素、前列腺素E2、脂多糖、成纤维细胞生长因子-2、组胺、胰岛素样生长因子-1、组胺和低重力。RANKL表达的抑制剂包括雌激素和转化生长因子-b。RANKL看起来经多种机制刺激组织蛋白酶K的转录。RANKL介导的信号转导中的早期和邻近事件涉及TRAF6的活化，其是RANKL的同源受体的关键衔接分子。TRAF6的过表达刺激组织蛋白酶K启动子活性，并且组织蛋白酶K启动子活性的RANKL刺激被显性阴性的TRAF6的过表达抑制。RANKL对组织蛋白酶K的活化还能够被显性阴性的c-fos抑制。JunB单独刺激基础组织蛋白酶K启动子活性，而单独的c-jun、JunD或c-fos则不会。然而，任何这些jun家族成员与c-fos (AP-1)的共转染显著增加组织蛋白酶K启动子表达。靶向c-jun或junB的siRNA抑制RANKL介导的组织蛋白酶K表达。因此，AP-1帮助调节组织蛋白酶K基因表达的基础刺激和RANKL介导的刺激。在信号转导途径中更远侧，RANKL能够导致通过p38的NFAT2的磷酸化，由此诱导NFAT2向细胞核的易位和随后人组织蛋白酶K启动子的反式激活。NFAT2的这种磷酸化与经典范例相反，在经典范例中，钙依赖磷酸酶使NFAT1和NFAT2二者去磷酸化，导致核易位和随后一系列基因的启动子激活。然而，NFAT2的不同部分的去磷酸化和磷酸化都可以诱导易位和随后转录的反式激活。细胞的RANKL处理还诱导经p38的小眼转录因子(Mitf)的磷酸化。Mitf能够结合人组织蛋白酶K启动子中的三个E盒基序。在培养的破骨细胞中野生型Mitf的过表达显著增强组织蛋白酶K表达。在骨生理学中有活性的其他试剂也能够刺激组织蛋白酶K表达，诸如视黄酸、间歇性机械牵张和胞外基质蛋白(I型胶原、纤连蛋白、玻连蛋白、骨桥蛋白)。破骨细胞分化和活化的生理抑制剂，诸如OPG、IL-6、INF-c，也能够直接抑制组织蛋白酶K表达[1]。

人 CTSK 多态性

组织蛋白酶K在破骨细胞功能中的重要作用首先由在该基因中的突变能够导致致密性成骨不全症这一发现所表明。人病症致密性成骨不全症是由组织蛋白酶K中的突变导致的罕见的、常染色体的、隐性的骨骼病症。目前，本发明人已经在人中鉴定到六种不同的突变：(1) 在cDNA位置1095处A-G转变；(2) 在核苷酸541处G-C转变；(3) 在核苷酸处C-T转变；(4) 在核苷酸935处C-T转变；(5) 在核苷酸236处G-A转变；(6) 在核苷酸926处T-C转变。这些基因中的突变影响骨骼系统的代谢，导致骨吸收和骨重建中的缺陷。在临床中，致密性成骨不全症表征为身材矮小、骨硬化、肢端骨质溶解、椎骨解离、具有开放卤门的分离的颅缝、骨脆性和下颌角缺失。组织蛋白酶K突变导致独特的致密性成骨不全症病症而不是如在与破骨细胞基因(诸如c-src或Atp6i)相关的其他疾病中所见的单纯的骨硬化。组织蛋白酶K突变的这个特征，连同在多种组织包括骨、卵巢、心、胎盘、肺、骨骼肌、结肠和小肠中的组织蛋白酶K mRNA检测一起，表明组织蛋白酶K可构成除可以导致致密性成骨不全症的独特表型的基质蛋白降解之外的其他功能[1]。

催化机制

组织蛋白酶K的催化三联体(Cys25、His159、Asn175，木瓜蛋白酶编号)典型地位于分隔两个结构域的裂缝中，并且Cys25位于左结构域的长的、保守的、N末端螺旋中，而His159在另一个结构域中。认为Cys25和His159作为硫醇-咪唑鎓盐(thiolateeimidazolium)离子对存在，其通过Asn175经与His159的氢键来稳定。半胱氨酸巯基是造成低pKa (w3.7)的部分原因。简述之，硫醇阴离子攻击待分裂的底物键的羰基碳以形成四面体中间体。该中间体首先由氧阴离子空穴稳定，并随后转化为酰基酶，并释放质子化的离去胺(leaving amine)。由水分子的亲核攻击导致形成第二个四面体中间体。这最后分裂以产生游离酶和底物的第二部分(R-COOH)[2]。

底物特异性

大部分Cl半胱氨酸组织蛋白酶是内肽酶(L、S、K、V、F)，而组织蛋白酶X是羧肽酶并且组织蛋白酶B、C和H具有内肽酶和外肽酶活性二者。半胱氨酸组织蛋白酶的底物结合区定义为在易裂开的键的两侧(N-和C-)上对肽底物氨基酸(PeP0)的结合亚位点(binding subsite; SeS0)的排列，包括木瓜蛋白酶的S4至S30七个位点的延伸段。由于许多底物类似物抑制剂的晶体结构是可用的，因此已经修订并重新定义了所述定义，限制底物残基结合至亚位点S2eS10，主链和侧链原子均参与其中。然而，近期研究已经显示组织蛋白酶K位点S3对确定底物特异性的重要性。尽管S2结合位点是真正的深口袋，但其他位点提供了结合表面。此外，尽管S2和S10位点是特异性的主要决定因素，但S1对底物的亲和力和有效催化是重要的。如同在亚位点S20中，P3残基在位点S3中的定位仅由侧链接触在相对宽的范围内介导。组织蛋白酶K、L、S和V具有部分重叠的特异性，使得在体内难以在它们之间进行区分。与组织蛋白酶L和V (此二者比较接受疏水残基，优选为Phe)不同，组织蛋白酶K攻击具有脂肪族氨基酸(Leu、Ile、Val)的位点，并且还在S2亚位点中容纳Pro。组织蛋白酶K在半胱氨酸组织蛋白酶中的独特之处在于它能够切割在P2位置中具有Pro的底物，尽管已经报道了具有与组织蛋白酶K类似的氨基酸序列(65％的同源性)和生物化学性质的来自刚果锥虫(Trypanosoma congolense)的半胱氨酸蛋白酶congopain也这样做。组织蛋白酶K的另一个特征是它对P3位置处的Gly的偏好[2]。

组织和细胞分布

半胱氨酸组织蛋白酶并非严格为溶酶体的，该蛋白酶在吞噬体、内体和溶酶体之间运输，并且在特定的生理环境下个别的酶可以积累在某些细胞器中。在由外源氧化剂(活性氧类)导致的溶酶体泄漏后，半胱氨酸组织蛋白酶还被释放进入细胞质中。单核细胞来源的巨噬细胞、肺巨噬细胞和破骨细胞的细胞外周空间的酸化增强组织蛋白酶K的释放，以促进胞外蛋白水解。Hþ-ATPase泵可以通过从胞质空间向胞外空间转移质子而参与形成酸性的亚细胞空间。免疫定位、原位杂交和荧光显微镜研究已经显示在沿骨吸收陷窝的破骨细胞中，组织蛋白酶K的丰度远高于比组织蛋白酶B、L和S。已经在多种组织包括骨、卵巢、心、胎盘、肺、骨骼肌、结肠和小肠中检测到组织蛋白酶K mRNA。高浓度的组织蛋白酶K已经发现于破骨细胞、破骨细胞类细胞(多核巨细胞)中，并且还在滑液成纤维细胞中和类风湿关节炎的关节(其与关节软骨的病理性侵蚀相关)中，以及器官系统(如肺和甲状腺)的上皮样细胞中。组织蛋白酶K还发现于主动脉平滑肌细胞、巨噬细胞中、支气管肺泡液中，并且通过巨噬细胞分泌，其能够对细胞外基质的重建非常重要[2]。

组织蛋白酶 S (CTSS)

组织蛋白酶S，也称作CTSS，是在人中由CTSS基因(基因ID: 1520)编码的蛋白。由该基因编码的蛋白是肽酶C1家族的成员，是溶酶体半胱氨酸蛋白酶，其可以参与抗原蛋白至用于在MHC II类分子上呈递的肽的降解。编码的蛋白可以在肺泡巨噬细胞中作为弹性蛋白酶在宽的pH范围内起作用。对于该基因，存在利用可变多腺苷酸化信号的转录物变体。已经显示组织蛋白酶S对于患有IV型星形细胞瘤(多形性胶质母细胞瘤)的患者是重要的预后因素，并且已经显示出组织蛋白酶S的抑制使存活时间中平均为5个月的改善。这是由于半胱氨酸酶无法再与其他蛋白酶一同作用来分解脑细胞外基质。因此，肿瘤的蔓延停止。

　　 CTSK 抑制剂

组织蛋白酶K抑制剂在文献中被广泛描述，但并不限于骨疾病的治疗。

WO 2004/007477描述了酰基肼基噻吩衍生物作为尤其是对代谢酶(尤其是组织蛋白酶K)的抑制剂用于治疗心血管疾病。WO 2006/076796提及了组织蛋白酶K抑制剂可以用于治疗肥胖症和相关病症。

选择性组织蛋白酶K抑制剂奥达卡替及其用于治疗骨质疏松的用途描述于J. Bone Miner. Res. 25 (5) 937-947 (2010)。

本发明涉及组织蛋白酶K抑制剂，优选选择性组织蛋白酶K抑制剂，在治疗和/或预防肺动脉高压和心力衰竭中的用途，以及其在治疗和/或预防肺动脉高压和/或急性和/或慢性心力衰竭中的用途。

更具体而言，本发明涉及式(I)至(XV)的化合物，

。

MIV 701 (X)、Ono 5334 (XI)、RO 4383315 (XII)、SAR-114137 (XIII)、MIV 710 (XIV)或MIV 711 (XV)，其用于治疗和/或预防肺动脉高压、心力衰竭和/或其组合。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物，

其用于治疗和/或预防肺动脉高压和/或急性或慢性心力衰竭的方法中。

在一个更优选的实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物，

其用于治疗和/或预防肺动脉高压的方法中。

根据取代方式，式(I)的化合物能够以立体异构形式存在，其表现为像和镜像(对映体)或其不表现为像和镜像(非对映体)。本发明涉及对映体或非对映体的用途以及它们各自的混合物。就像非对映体一样，外消旋形式能够以已知的方式分成在立体异构上均一的成分。同样地，本发明还涉及式(I)的化合物的其他互变异构体和它们的盐的用途。

式(I)的化合物的盐可以是本发明的物质与无机酸、羧酸或磺酸的生理学上可接受的盐。尤其优选的盐是，例如与盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸、三氟乙酸、乙酸、丙酸、乳酸、酒石酸、柠檬酸、富马酸、马来酸或苯甲酸的盐。

本发明的化合物优选表现为盐酸盐或三氟乙酸盐。

可以提及的盐还有与常见碱的盐，诸如例如，碱金属盐(例如钠盐或钾盐)、碱土金属盐(例如钙盐或镁盐)或铵盐，其来源于氨或有机胺，诸如例如，二乙胺、三乙胺、乙基二异丙胺、普鲁卡因、二苄胺、N-甲基吗啉、二氢枞胺、1-二苯羟甲胺或甲基哌啶。

根据本发明将水合物或溶剂合物指定为式(I)的化合物的那些形式，其以固态或液态通过与水的水合作用或与溶剂分子的配位作用形成分子化合物或配合物。水合物的实例为倍半水合物、单水合物、二水合物或三水合物。同样地，本发明化合物的盐的水合物或溶剂合物也是适合的。

动物模型

在豚鼠中低氧诱导的肺动脉高压

慢性低氧是文献描述的且公认的肺动脉高压的动物模型，并且对不同物种进行了描述

。急性低氧通过肺动脉收缩增加肺动脉压。慢性低氧通过血管结构改变和血液中血细胞比容(Hct)增加导致更加严重的肺动脉高压。结构改变包括肌肉肺动脉中的中间增厚和在之前无肌组织化或部分肌组织化的小动脉中出现新的中膜平滑肌。该后一种现象称为肌肉延展。这些改变归因于血管平滑肌细胞或平滑肌前体细胞诸如周皮细胞的肥大、增生和远端迁移。Thompson等在豚鼠模型中显示了那些作用(包括右心室重的增加)

。

犬中起搏诱导的心力衰竭

犬中由快速心室起搏诱导的实验性心力衰竭导致低输出心肌病状态。发生心肌重建和室膨胀以抵消增加的壁应力。伴随这些改变，存在降低的心室收缩性。这些变化与在人和天然发生的犬扩张型心肌病(DCM)中观察的那些是相似的。心肌病与遍及心室壁和乳头肌中的肌细胞的逐步丧失是相关的。(Cardiovascular Research 49 (2001) 127-134)。

肺动脉高压豚鼠模型中的CTST抑制剂(奥达卡替)

如实施例部分中所描述，在肺动脉高压的豚鼠模型中检测了CTSK抑制剂奥达卡替。将称重约250 g的雄性Dunkin Hartley豚鼠随机分为三个不同的处理组(n=7-8只动物/组；对照 + 安慰剂、低氧 + 安慰剂、低氧 + 奥达卡替)。对于慢性低氧的暴露，将豚鼠在通风橱中常压性低氧(为10% O₂)下饲养28天。将对照动物饲养于室内空气中。无限制地提供食物和水。通过植入渗透微泵经持续输注使豚鼠从第0天直到第28天接受奥达卡替或安慰剂。在第28天，将动物放血并切出心。将心切开，并计算右心室与左心室加隔的重量比例(RV/LV + S)作为右心室肥大的指标。将右心室在干冰上快速冷冻用于RNA提取和实时定量聚合酶链反应。低氧4周后，RV/LV+S比例从0.28 ± 0.01 (平均值±SEM，含氧量正常的对照组)增加至0.37 ± 0.01 (平均值±SEM，含氧量低的安慰剂组)。用奥达卡替处理显著地且令人惊讶地将RV/LV+S比例降低为0.30 ± 0.01 (平均值±SEM)。结果显示于图24中。对照：含氧量正常下心右心室重量相对于包括隔的左心室重量的比例；安慰剂：低氧下心右心室重量相对于包括隔的左心室重量的比例；奥达卡替：低氧和奥达卡替处理下心右心室重量相对于包括隔的左心室重量的比例。显著改变用星号标记出。

为了分析动物的疾病状况并确定奥达卡替处理的效力，进行了标记基因的表达。ANP的表达在来自低氧饲养的动物的心中增加，而奥达卡替处理导致低氧下显著降低的表达(相比于安慰剂组)。结果显示于图25中。LTBP2的表达在来自低氧饲养的动物的心中增加，而奥达卡替处理导致低氧下显著降低的表达(相比于安慰剂组)。结果显示于图26中。CTSK的表达在来自低氧饲养的动物的心中增加，而奥达卡替处理导致低氧下显著降低的表达(相比于安慰剂组)。结果显示于图27中。由于已知增加的ANP水平与心力衰竭患者和动物模型中疾病阶段的关联，因此CTSK增加的表达看来与肺动脉高压相关。用奥达卡替治疗低氧引起的肺动脉高压动物导致相比于安慰剂处理的动物右心室重量的降低。本文中本发明人显示奥达卡替和其他本发明中呈现的CTSK抑制剂可用于治疗肺动脉高压。

犬中起搏诱导的心力衰竭中的CTSK表达

进行来自起搏诱导的心力衰竭犬的心样品中CTSK的表达以分析心力衰竭中CTSK的关联性。如实施例部分(实施例动物模型A-4)所描述进行实验。

如实施例部分所描述，对左心房、右心房、左心室和右心室进行ANP和CTSK的表达分析。图28中显示CTSK表达的结果并且图29中显示ANP表达的结果。相比于来自未起搏的犬的组织，CTSK的表达在起搏的犬的左心房、右心房、左心室和右心室中增加。相比于来自未起搏的犬的组织，ANP的表达在起搏的犬的左心房和右心房中增加。由于已知增加的ANP水平与心力衰竭患者和动物模型中疾病阶段的关联，因此CTSK增加的表达看来与心力衰竭相关。本文中本发明人显示CTSK表达在心力衰竭中上调，并且通过如但不限于奥达卡替的抑制剂(本发明中呈现的)抑制CTSK可用于治疗心力衰竭。

适应症

急性低氧引起强烈的肺动脉血管收缩并且增加肺动脉压[5]。这种所谓的Euler-Liljestrand机制描述了肺的通气和血液循环(灌注)之间的联系，并且也被称作低氧性肺血管收缩[6]。慢性低氧导致广泛的血管重建、肺动脉高压和肺源性心脏病[7]。血管重建过程在这些条件下主要影响肺动脉的远端分支：血管平滑肌细胞(VSMC)和外膜成纤维细胞增生二者[8]。

肺动脉高压(肺动脉高压的临床分类，Dana Point 2008)是进行性肺病症，其可以具有多种原因并且不治疗的情况导致死亡。其与右心上的过载以及右心衰竭发展为泵衰竭相关，其可以导致死亡。通过定义，在慢性肺动脉高压中，平均肺动脉压(mPAP)为平静时>25 mmHg并且运动过程中>30 mmHg (正常值<20 mmHg)。肺动脉血管收缩和肺血管的结构重建均是在该疾病中促成升高的肺动脉压的病理学过程的组成特征。将重建表征为新肌组织化(neomuscularization)、中间肥大和外膜增厚。肺循环的这种增加的管腔闭合导致右心上进行性应力，致使由右心输出减少并最后以右心衰竭告终。

没有可识别的原因而发生的所谓特发性肺动脉高压(PAH)是极其罕见的病症，患病率为每百万人中1-2人[3]。已经估计患者的平均年龄为36岁，并且仅有10％的患者年龄超过60岁。患病的女性明显多于男性。与其潜在病因的多样性一致，肺动脉高压的继发性形式显示出不同的病程，但在每种情况下，它都是具有高死亡率的严重病症。

尽管在肺动脉高压的治疗中的所有进展，但至今仍没有治愈这种严重的病症的希望。然而，市场上可获得的用于肺动脉高压的特异性疗法(例如前列环素类似物、内皮素受体拮抗剂、磷酸二酯酶抑制剂)能够改善患者的生活质量、运动耐量和预后。然而，这些药物的可用性受限于在某些情况下严重的副作用和/或复杂的施用形式。患者的临床表现能够用特异性疗法改善或稳定的时期是受限的。最后，疗法逐步增强并且因此应用组合疗法，其中必须同时给予多种药物。新的组合疗法是治疗肺动脉高压的最有希望的未来治疗选项之一[4]。对于新疗法而言，能够与已知疗法组合并且不产生任何与新陈代谢相关的问题(例如仅在非常小的程度上抑制或根本不抑制P450 CYP酶)(比较与使用波生坦和华法林的组合疗法相关的药物相互作用)的新疗法的开发愈加重要。

术语“肺动脉高压”包括由Clinical Classification of Pulmonary Hypertension, Dana Point 2008详细说明的肺动脉高压的具体形式。可以提及的实例为肺动脉高压、与左心病症相关的肺动脉高压、与肺疾病和/或低氧相关的肺动脉高压、由于慢性血栓栓塞的肺动脉高压(CTEPH)和/或具有不清楚的多因素机制的肺动脉高压。

“肺动脉高压”包括特发性肺动脉高压(IPAH，之前也称为原发性肺动脉高压)、可遗传肺动脉高压、药物和毒素诱导的肺动脉高压和相关性肺动脉高压(APAH)，其与结缔组织疾病、先天性心脏病、门静脉高压、HIV感染、血吸虫病、慢性溶血性贫血相关，与涉及重要的静脉/毛细血管的病症诸如肺静脉闭塞性疾病和肺毛细血管血管瘤生成、和/或新生儿的持续性肺动脉高压相关。

与左心病症相关的肺动脉高压病症包括具有收缩期功能障碍、舒张期功能障碍的病症和心瓣膜病。与肺疾病和/或低氧相关的肺动脉高压包括慢性阻塞性肺疾病、间质性肺疾病、具有混合的限制性和阻塞性模式的其他肺疾病、睡眠呼吸暂停综合征、肺泡通气不足、慢性高空病和体质异常。由于慢性血栓栓塞的肺动脉高压(CTEPH)包括近端肺动脉的血栓栓塞阻塞、远端肺动脉的血栓栓塞阻塞和/或非血栓形成的肺栓塞(肿瘤、寄生物、异物)。

具有不清楚的多因素机制的肺动脉高压包括血液系统病症(骨髓增生性病症、脾切除)、全身病症(结节病、肺朗格汉斯细胞组织细胞增生症、淋巴管平滑肌瘤、神经纤维瘤、血管炎)、代谢病症(甲状腺病症、糖原贮积病、戈谢病)和/或其他病症如肿瘤阻塞、纤维性纵隔炎、透析的慢性肾功能衰竭。

术语“心力衰竭”包括心力衰竭的具体形式。可以提及的实例为急性失代偿性心力衰竭、右心衰竭、左心衰竭、双心室衰竭、缺血性心肌病、扩张型心肌病、肥厚型心肌病、特发性心肌病、先天性心脏病、舒张期心力衰竭、收缩期心力衰竭、充血性心力衰竭和/或与心瓣膜病、二尖瓣狭窄、二尖瓣关闭不全、主动脉瓣狭窄、主动脉瓣关闭不全、三尖瓣狭窄、三尖瓣关闭不全、肺动脉瓣狭窄、肺动脉瓣关闭不全、联合心瓣膜病、心肌炎、急性心肌炎、慢性心肌炎、病毒性心肌炎、糖尿病(diabetis)、药物诸如酒精和可卡因的滥用、医疗用药诸如化学治疗剂、结缔组织病、HIV和积贮病相关的心力衰竭。

组合疗法

本发明进一步涉及包含本发明的化合物及一种或多种进一步的活性组分的药物，其尤其用于治疗和/或预防上述病症。可以优选提及的合适的组合活性组分的实例是：

● 　降脂剂，尤其是HMG-CoA (3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A)还原酶抑制剂；

● 　冠状动脉治疗剂/血管扩张剂，尤其是ACE (血管紧张素转化酶)抑制剂、AII (血管紧张素II)受体拮抗剂；β-肾上腺素受体拮抗剂；α-1肾上腺素受体拮抗剂；利尿剂；钙通道阻滞剂；内皮素受体拮抗剂、盐皮质激素受体拮抗剂、肾素抑制剂(rennin-inhibitor)、rho-激酶-抑制剂和引起环鸟苷酸(cGMP)升高的物质，诸如例如，可溶性鸟苷酸环化酶的刺激物或激活剂；

● 　纤溶酶原激活剂(溶栓剂/纤维蛋白溶解剂)和提高溶栓/纤维蛋白溶解作用的化合物，诸如纤溶酶原激活剂抑制剂的抑制剂(PAI抑制剂)、凝血酶激活的纤维蛋白溶解作用抑制剂的抑制剂(TAFI抑制剂)和因子Xa抑制剂；

● 　具有抗凝血活性的物质(抗凝血剂)；

● 　血小板聚集抑制物质(血小板聚集抑制剂)；

● 　血纤蛋白原受体拮抗剂(糖蛋白IIb/IIIa拮抗剂)；

● 　抗心律不齐药；

● 　激酶抑制剂；

● 　可溶性鸟苷酸环化酶的刺激物或激活剂；

● 　前列环素类似物；

● 　内皮素受体拮抗剂；

● 　弹性蛋白酶抑制剂

● 　和磷酸二酯酶抑制剂

● 　基质金属蛋白酶抑制剂

● 　5-羟色胺受体拮抗剂

● 　利尿剂

● 　有机硝酸盐和NO供体

● 　正性肌力药，例如洋地黄糖苷(地高辛)、多巴胺、多巴酚丁胺和多巴胺能激动剂、β-肾上腺素能激动剂、肾上腺素、去甲肾上腺素

● 　利钠肽

● 　钙增敏剂，例如左西孟旦

● 　CTSS抑制剂

● 　支气管扩张剂，例如沙丁胺醇、奥西那林、特布他林、沙美特罗、福莫特罗、班布特罗

● 　消炎药，例如糖皮质激素。

本发明进一步涉及用于在人和动物中治疗和/或预防肺动脉高压的方法，其通过施用有效量的至少一种式(I)至(XV)的选择性组织蛋白酶K抑制剂，或包含与惰性的、非毒性的、药学上合适的赋形剂组合的至少一种选择性组织蛋白酶K抑制剂的药物。

本发明进一步涉及用于在人和动物中治疗和/或预防肺动脉高压的方法，其通过施用有效量的式(I)的化合物，或包含与惰性的、非毒性的、药学上合适的赋形剂组合的至少一种本发明的化合物的药物。

将按照本发明的用途制造的药物或将根据本发明使用的药物包含通常与一种或多种惰性的、非毒性的、药学上合适的赋形剂一起的至少一种本发明的化合物。

本发明的化合物可以全身作用和/或局部作用。为此目的，它们可以以合适的方式施用，诸如例如，通过口服、肠胃外、肺、鼻、舌下、舌、口腔、直肠、皮肤、透皮、结膜或耳途径施用或作为植入物或支架施用。

本发明的化合物可以以适合于这些施用途径的施用形式来施用。

适合于口服施用的是这样的施用形式，其根据现有技术行使功能并且快速地且/或以改良的方式递送本发明的化合物，并且其包含以结晶和/或非结晶和/或溶解形式的本发明的化合物，诸如例如片剂(未包衣的或包衣的片剂，例如具有肠溶包衣或不可溶的包衣或延迟溶解且控制本发明化合物释放的包衣)、在口中快速崩解的片剂、或膜/薄片(wafers)、膜/冷冻干燥物、胶囊(例如硬或软明胶胶囊)、糖衣片剂、颗粒剂、丸剂、粉剂、乳剂、悬浮液、气雾剂或溶液。

可以进行肠胃外施用而避免吸收步骤(例如静脉内、动脉内、心内、脊柱内或腰椎内)或包括吸收(例如肌内、皮下、皮内、经皮或腹膜内)。适合于肠胃外施用的施用形式尤其是以溶液、悬浮液、乳剂、冷冻干燥物或无菌粉剂的形式用于注射和输注的制剂。

适合于其他施用途径的是，例如用于吸入的药物形式(尤其是干粉吸入剂、喷雾器)、滴鼻剂、溶液或喷剂、片剂、用于经舌、舌下或口腔途径施用的膜/薄片或胶囊、栓剂、用于眼或耳的制剂、阴道胶囊、水性悬浮液(洗液、振摇混合物)、亲脂性悬浮液、软膏剂、乳膏剂、透皮治疗系统(例如贴剂)、乳、糊剂、泡沫剂、扑粉(dusting powders)、植入物或支架。

在更优选的实施方案中，本发明涉及上述化合物或药物组合物/药物，其用于治疗和/或预防疾病的方法中，所述疾病包括在以下疾病的组中：肺动脉高压、与左心病症相关的肺动脉高压、与肺疾病和/或低氧相关的肺动脉高压和由于慢性血栓栓塞的肺动脉高压(CTEPH)。甚至更优选的实施方案是用于治疗和/或预防肺动脉高压的方法中。

在更优选的实施方案中，本发明涉及上述化合物或药物组合物/药物，其用于治疗和/或预防慢性心力衰竭的方法中。

在更优选的实施方案中，本发明涉及上述化合物或药物组合物/药物，其用于治疗和/或预防扩张型心肌病的方法中。

诊断学

在另一个实施方案中，特异性结合CTSK的抗体可以用于诊断肺动脉高压或心力衰竭，或用于监测用CTSK抑制剂治疗的患者的测定中。可以以与上文描述用于治疗剂的那些相同的方式制备用于诊断目的的抗体。对CTSK的诊断测定包括这样的方法，其利用抗体和标记来在人体液中或在细胞或组织的提取物中检测CTSK，优选在心组织中，更优选在心室(左心室和/或右心室)中并且甚至更优选在右心室中检测CTSK。抗体可以进行或不进行修饰来使用，并且可以通过共价或非共价结合报告分子来标记。

包括ELISA、RIA和FACS在内多种用于测定CTSK的方案是本领域已知的，并且提供了用于诊断CTSK表达的改变的或异常的水平的基础。通过在适合于复合物形成的条件下将取自普通哺乳动物对象，优选人的体液或细胞提取物与针对CTSK的抗体组合，来确定CTSK表达的正常或标准值。标准复合物形成的量可以通过多种方法定量，优选通过光度测定的方式。将来自活检组织的对象样品中表达的CTSK的量与标准值比较。标准值和对象值之间的偏差确定了用于诊断疾病的参数。

在本发明的另一个实施方案中，可以将编码CTSK的多核苷酸用于诊断目的。可以使用的多核苷酸包括寡核苷酸序列、互补RNA和DNA分子、和PNA。使用多核苷酸来检测并定量其中CTSK的表达与疾病相关联的活检组织中，优选上述心样品中的基因表达。可以使用诊断测定在CTSK的缺失、存在和过量表达之间进行区分，并且监测治疗介入过程中CTSK水平的调节。

编码CTSK的多核苷酸序列可以用于诊断与CTSK表达相关的外周和中枢神经系统的病症、血液疾病、癌疾病和心血管疾病。编码CTSK的多核苷酸序列可以用于Southern、Northern或点印记分析、或其他基于膜的技术中；用于PCR技术中；用于浸量片(dipstick)、针(pin)和ELISA测定中；和用于利用来自患者活组织检查的液体或组织的微阵列中，来检测改变的CTSK表达。这样的定性或定量方法是本领域熟知的。

在具体方面中，编码CTSK的核苷酸序列可以用于诊断肺动脉高压或心力衰竭的测定中。可以通过标准方法标记编码CTSK的核苷酸序列并在适合于形成杂交复合物的条件下加入到来自患者的液体或组织样品中。在合适的孵育期后，洗涤样品并将信号定量并与标准值比较。如果患者样品中的信号量相对于可比较的对照样品的信号量显著改变，则核苷酸序列已经与样品中的核苷酸序列杂交，并且样品中存在编码CTSK的核苷酸序列的改变的水平说明存在相关病症。此类测定还可以用于在动物研究中、在临床试验中、或在监测个体患者的治疗中评价具体治疗处理方案的效力。

为了提供诊断肺动脉高压或心力衰竭的基础，确定了对于表达的正常概况或标准概况。这可以通过在适合于杂交或扩增的条件下将取自正常对象(动物或人)的体液或细胞提取物与编码CTSK的序列或其片段组合来完成。可以通过将从正常个体获得的值与来自使用已知量的基本纯化的多核苷酸的实验的值比较来定量标准杂交。可以将从正常样品中获得的标准值与从来自具有病症的症状的患者的样品获得的值比较。相比于标准值增加的值诊断为存在上述病症。

本发明的另一个目标是诊断哺乳动物中的包含在以下疾病的组中的疾病的方法：肺动脉高压(pulmonary hypertension)、肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension)、与左心病症相关的肺动脉高压、与肺疾病和/或低氧相关的肺动脉高压、由于慢性血栓栓塞的肺动脉高压(CTEPH)和心力衰竭，其包括步骤(i)确定取自所述哺乳动物的样品中的CTSK多核苷酸或多肽的量，(ii)确定健康的和/或患病的哺乳动物中的CTSK多核苷酸或多肽的量。优选的实施方案是诊断肺动脉高压或慢性或急性心力衰竭。如果与患病的哺乳动物相比，在所述的检测哺乳动物中的CTSK多核苷酸或多肽的量基本相似，则诊断为疾病。如果与健康的哺乳动物相比，在所述的检测哺乳动物中的CTSK多核苷酸或多肽的量增加，则诊断为疾病。在优选的实施方案中，CTSK多核苷酸或多肽的量增加至少1.5倍。

A: 　实验方法

A-1. 　实施例 1

表达分析

通过用液氮研磨将豚鼠或犬组织磨成粉状。提取总RNA，进行DNase I消化以去除残余的基因组DNA并且使用随机六聚物(hexomer)引物将RNA反转录。使用Applied Biosystems PRISM 7900序列检测系统进行定量TaqMan RT-PCR分析。将加热方案设定为50℃下2分钟，随后95℃下10分钟，和95℃下15秒和60℃下1分钟的40个循环。将结果对L32 (犬)或b-肌动蛋白(豚鼠)对照归一化，并按照以下公式计算相对表达：相对表达= 2(20-(CT(探针)-CT(L32/b-肌动蛋白)))。将参数CT定义为扩增曲线经过基线上固定阈值处的循环数。

A-2. 　实施例 2

LTBP2作为心血管疾病(低氧引起的肺动脉高压)中的生物标记物、治疗和诊断目标的用途

低氧引起的肺动脉高压模型描述于动物模型部分(A3.)中。

使用Trizol-Reagent方案，按照生产商说明书(Invitrogen；USA)分离总细胞RNA。用DNAse I处理通过Trizol-Reagent方案制备的总RNA以去除基因组DNA污染。

对于LTBP2的mRNA分布的相对定量，首先反转录来自每一样品的总RNA。使用ImProm-II反转录体系(Promega, USA)，按照生产商方案将1 µg的总RNA反转录。用水将终体积调节为200 µl。

对于LTBP2 mRNA分布的相对定量，按照生产商说明书和方案使用Applied Bioscience ABI 7900HT序列检测系统。将PCR反应设定为对LTBP2和持家基因b-肌动蛋白进行定量。使用Applied Bioscience ABI Primer ExpressTM软件设计用于LTBP2的正向和反向引物及探针，并由Eurogentec (比利时)合成。LTBP2正向引物序列为：引物1 (SEQ ID NO:9)。LTBP2反向引物序列为引物2 (SEQ ID NO:10)。使用由作为报告染料的FAM (羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)和作为淬灭剂的TAMRA (羧基四甲基罗丹明)标记的探针1 (SEQ ID NO: 11)作为用于LTBP2的探针。制备总计20 µl的以下试剂：1x qPCR-MasterMix (Eurogentec；比利时)和探针1 (SEQ ID NO: 11)、LTBP2正向和反向引物各200 nM，200 nM LTBP2 FAM/TAMRA标记的探针和5 µl的模板cDNA。热循环参数为50℃下2分钟，随后为95℃下10分钟，随后为95℃下15秒和60℃下退火/延伸1分钟的40个循环。

相对表达的计算

如在“核酸的定量测定”部分中所述，计算CT (阈值循环)值。

ΔCT =CTLTBP2 - CTb-肌动蛋白

相对表达 = 2^(15-ΔCT)

mRNA定量(表达概况)的结果显示在图26中。

动物模型

可以根据本发明使用的化合物的有利的药理性质可以通过以下方法来确定。

A-3. 　 在豚鼠中低氧诱导的肺动脉高压的动物模型

用 CTSK 抑制剂的处理

将称重约250 g的雄性Dunkin Hartley豚鼠随机分为三个不同的处理组(n=7-8只动物/组；对照 + 安慰剂、低氧 + 安慰剂、低氧 + 奥达卡替)。对于慢性低氧的暴露，将豚鼠在通风橱中常压性低氧(为10% O₂)下饲养28天。将对照动物饲养于室内空气中。无限制地提供食物和水。通过植入渗透微泵经持续输注使豚鼠从第0天直到第28天接受奥达卡替或安慰剂。在第28天，将动物放血并切出心。将心切开，并计算右心室与左心室加隔的重量比例(RV/LV + S)作为右心室肥大的指标。将右心室在干冰上快速冷冻用于RNA提取和实时定量聚合酶链反应。低氧4周后，RV/LV+S比例从0.28 ± 0.01 (平均值±SEM，含氧量正常的对照组)增加至0.37 ± 0.01 (平均值±SEM，含氧量低的安慰剂组)。用奥达卡替处理显著地将RV/LV+S比例降低为0.30 ± 0.01 (平均值±SEM)。结果显示于图24中。对照：含氧量正常下心右心室重量相对于包括隔的左心室重量的比例；安慰剂：低氧和安慰剂输注下心右心室重量相对于包括隔的左心室重量的比例；奥达卡替：低氧和奥达卡替处理下心右心室重量相对于包括隔的左心室重量的比例。用星号标记显著性。

A-4. 　 起搏的犬

急性实验设定概述于图30中。对于起搏器植入(第0天)和血液动力学评价(第21天)，将重量为25-32 kg之间的杂种犬(Marshall BioResources/USA)用戊巴比妥(15-30 mg/kg以起效)麻醉。如需要，使用戊巴比妥(1-5 mg/kg/h)并经左头静脉施用来提供麻醉补充。对于止痛，经右头静脉输注芬太尼(10-40 µg/kg/h)。在所有实验程序期间，将动物插管并使用Sulla 808麻醉呼吸机(Dräger/德国)用室内空气进行机械通气。

起搏器植入

在透视引导(OEC FlexiView 8800，GE Healthcare/USA)下和在无菌条件下，将类固醇洗脱的起搏器电极导线(Setrox S60，Biotronik/德国)经腋静脉插入右心室中并与起搏器(Logos, Biotronik/德国)连接。为了证实正确放置，测定捕获阈值(capture threshold)和心内信号。所有动物在起搏器植入后3天的时期内接受肠胃外抗生素(恩氟沙星(Baytril®)，Bayer/德国；5mg/kg；s.c.)和止痛剂(安乃近(Metamizole-WDT®) WDT/德国；50mg/kg；i.m.)处理。伤口愈合后(第7天)，激活起搏器并将心以220次心跳/分钟(BPM)的速率持续起搏14天。在该起搏时期内，将犬置于畜栏中，提供任意获取的食物和水，并允许犬每日进入活动区两次。在研究持续过程中观察并每日临床评价犬。

急性实验设定

起搏14天后，在全身麻醉下研究动物来分别评价它们对静脉内考尼伐坦-(0.1 mg/kg, i.v.)或托伐普坦-推注(0.1 mg/kg, i.v.)的血液动力学和尿排出应答。在研究当天，麻醉诱导前一小时将起搏器失效。在无菌条件下，对动物安置股动脉入口(以通过NaCl 0.9%充满的护套导引器(Cordis, Waterloo/比利时)测量动脉血压，并使用ECG和5F-微尖导管(Millar Instruments Inc., Houston/USA)评价LV性能(心率、收缩性以及舒张))。将Swan Ganz导管(具有Vigilance监测器的CCOmbo，Edwards Lifescience/USA)经腋静脉引入来测定心输出量、肺动脉压、中心静脉压和体温。用Gould Amplifier和ACQ-16 Acquisition Interface Unit记录所有数据并用Ponemah软件(均为DSI/ St. Paul/USA)进一步分析。插入膀胱导尿管并每20分钟测定尿输出量。生理效应描述于Mondritzki等人(Am J Ther；2010年12月29日)。

A-5. 　 生物标记物

分类：

疾病生物标记物：涉及疾病的临床结果或测定的生物标记物。

效力生物标记物：反映所给予治疗的有益效果的生物标记物。

分期生物标记物：区分慢性病症的不同病期的生物标记物。

代用品生物标记物：视为对临床结果测定的有效替代品的生物标记物。

毒性生物标记物：报告药物在体外或体内系统中的毒理学作用的生物标记物。

机制生物标记物：报告药物的下游作用的生物标记物。

目标生物标记物：报告药物与它的目标的相互作用的生物标记物。

ANP

心房钠尿肽(ANP)、心房利钠因子(ANF)、心房利钠激素(ANH)或心房肽是强效的血管舒张剂，并且是由心肌细胞分泌的蛋白(多肽)激素[11]。它参与身体水、钠、钾和脂肪(脂肪组织)的稳态控制。它由心的上室(房)中的肌细胞(心房肌细胞)响应高血压而释放。ANP作用以降低循环系统中的水、钠和脂肪负荷，由此降低血压。ANP结合一类特异的受体，即ANP受体。受体-激动剂结合导致血液体积降低，并由此降低心输出量和全身血压。脂解增加并且肾的钠重吸收降低。ANP对身体的总体作用是对抗由肾素-血管紧张素系统导致的血压和血液体积的增加。

ANP是众所周知的对于肺动脉高压和心力衰竭(Clin.Cardiol.33, 11, 700-707 (2010))的疾病生物标记物、分期生物标记物、代用品生物标记物、效力生物标记物。

肾的：

扩张入球小动脉，收缩出球小动脉，并舒张系膜细胞。这增加肾小球毛细血管中的压力，因此增加肾小球滤过率(GFR)，导致更多的钠和水的排泄。增加通过直小血管的血流量，所述直小血管将把溶质(NaCl和尿素)从髓质间质中洗出[6]。髓质间质更低的渗透性导致肾小管液更少的重吸收和增加的排泄。经鸟苷3',5'-环单磷酸(cGMP)依赖的ENaC磷酸化减少肾单位的近曲小管和皮质集合管中钠的重吸收。抑制肾素分泌，由此抑制肾素-血管紧张素系统。降低肾上腺皮质的醛固酮分泌。

血管的：

舒张小动脉和小静脉中的血管平滑肌，其通过：膜受体介导的对儿茶酚胺作用的提高的血管平滑肌cGMP抑制。

心的：

抑制适应不良的心肌肥厚。缺乏心NPRA的小鼠发育出增加的心质量和严重的纤维化和突然死亡。NPRA的再表达拯救了该表型。它可以与单独的心房淀粉样变相关。

LTBP2

LTBP2的核苷酸序列在数据库中可通过检索号Z37976 (人)获得。引物序列在SEQ ID NO:9-11 (豚鼠)中给出。

转化生长因子β(TGFβ)细胞因子是多功能家族，其对正常的和转化的哺乳动物细胞都产生多种作用。TGFβ的分泌和活化由它们与潜态相关蛋白(latency associated protein)和潜伏TGFβ结合蛋白(LTBPs)的结合所调节。转化生长因子β(TGFβ)以三种哺乳动物同工型(TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3)存在。这些的每一种通常以大的潜伏复合物(LLCs)分泌，所述大的潜伏复合物不具有生物活性并且包含三种组分：与潜态相关蛋白(LAPs；前体TGFβ的N末端片段的同型二聚体)非共价结合的成熟TGFβ的二硫键合的同型二聚体和潜伏TGFβ结合蛋白(LTBP)的共价连接的分子。已经鉴定了四种LTBP基因：LTBP1至LTBP4。LAPs足以使成熟的同型二聚体失活，并且LAPs及LTBP二者的去除或者它们相互作用的调节对于任何TGFβ同工型行使功能是必需的。TGFβ细胞因子调节许多哺乳动物细胞类型的生长和功能。近年来已经清楚LTBPs可以参与TGFβ的装配、分泌及其向它贮存和/或活化的位置的靶向。因此，这些蛋白在控制及支配TGFβ的活性中起关键作用。LTBP还可以独立于与TGFβ相关的蛋白来起作用，例如作为结构基质蛋白。

相对而言，对于LTBP2的功能作用所知不多。与其他LTBP不同，LTBP2无法与小潜伏TGFβ结合。LTBP2主要表达于肺中，并且在较小程度上表达于肝、骨骼肌、胎盘和心中。潜伏TGFβ结合蛋白LTBP2降低成纤维细胞与纤连蛋白的附着。LTBP2功能作用的说明进一步由小鼠中LTBP2的缺失导致胚胎致死这一事实所限定。

关于LTBP2在心血管系统中的功能作用，证实在冠状动脉血管成形术的猪模型中LTBP2合成提高了对动脉损伤的应答[9]。因此，结合TGFβ在发展心力衰竭中众所周知的作用[10]，本发明人的发现，即在LVAD心中以及在多种心力衰竭的动物模型中TGFβ功能修饰性LTBP2在RNA水平上被调节，使得LTBP2成为用于CHF的有吸引力的候选生物标记物。

LTBP2公开于(但不限于)专利WO 2004/075835和WO 02/068579。

附图说明

图1显示了豚鼠CTSK的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。

图2显示了豚鼠CTSK的多肽序列(SEQ ID NO:2)。

图3显示了用于本发明(豚鼠CTSK)的引物的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)。

图4显示了用于本发明(豚鼠CTSK)的引物的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)。

图5显示了用于本发明(豚鼠CTSK)的引物的核苷酸序列(SEQ ID NO:5)。

图6显示了用于本发明(豚鼠ANP)的引物的核苷酸序列(SEQ ID NO:6)。

图7显示了用于本发明(豚鼠ANP)的引物的核苷酸序列(SEQ ID NO:7)。

图8显示了用于本发明(豚鼠ANP)的引物的核苷酸序列(SEQ ID NO:8)。

图9显示了用于本发明(豚鼠LTBP2)的引物的核苷酸序列(SEQ ID NO:9)。

图10显示了用于本发明(豚鼠LTBP2)的引物的核苷酸序列(SEQ ID NO:10)。

图11显示了用于本发明(豚鼠LTBP2)的引物的核苷酸序列(SEQ ID NO:11)。

图12显示了用于本发明(豚鼠b-肌动蛋白)的引物的核苷酸序列(SEQ ID NO:12)。

图13显示了用于本发明(豚鼠b-肌动蛋白)的引物的核苷酸序列(SEQ ID NO:13)。

图14显示了用于本发明(豚鼠b-肌动蛋白)的引物的核苷酸序列(SEQ ID NO:14)。

图15显示了用于本发明(犬L32)的引物的核苷酸序列(SEQ ID NO:15)。

图16显示了用于本发明(犬L32)的引物的核苷酸序列(SEQ ID NO:16)。

图17显示了用于本发明(犬L32)的引物的核苷酸序列(SEQ ID NO:17)。

图18显示了用于本发明(犬CTSK)的引物的核苷酸序列(SEQ ID NO:18)。

图19显示了用于本发明(犬CTSK)的引物的核苷酸序列(SEQ ID NO:19)。

图20显示了用于本发明(犬CTSK)的引物的核苷酸序列(SEQ ID NO:20)。

图21显示了用于本发明(犬ANP)的引物的核苷酸序列(SEQ ID NO:21)。

图22显示了用于本发明(犬ANP)的引物的核苷酸序列(SEQ ID NO:22)。

图23显示了用于本发明(犬ANP)的引物的核苷酸序列(SEQ ID NO:23)。

图24显示了豚鼠中的低氧诱导的肺动脉高压模型的心重。对照：含氧量正常下心右心室重量相对于包括隔的左心室重量的比例；安慰剂：低氧和安慰剂输注下心右心室重量相对于包括隔的左心室重量的比例；奥达卡替：低氧和奥达卡替处理下心右心室重量相对于包括隔的左心室重量的比例。

图25显示了在豚鼠中低氧诱导的肺动脉高压模型的心右心室中ANP的相对表达(X轴: 1= 对照, 2: 安慰剂, 3: 奥达卡替; Y轴: 相对表达)。对照：含氧量正常下饲养的动物；安慰剂：低氧和安慰剂输注下饲养的动物；奥达卡替：低氧和奥达卡替处理下饲养的动物。

图26显示了在豚鼠中低氧诱导的肺动脉高压模型的心右心室中LTBP2的相对表达(X轴: 1= 对照, 2: 安慰剂, 3: 奥达卡替; Y轴: 相对表达)。对照：含氧量正常下饲养的动物；安慰剂：低氧和安慰剂输注下饲养的动物；奥达卡替：低氧和奥达卡替处理下饲养的动物。

图27显示了在豚鼠中低氧诱导的肺动脉高压模型的心右心室中CTSK的相对表达(X轴: 1= 对照, 2: 安慰剂, 3: 奥达卡替; Y轴: 相对表达)。对照：含氧量正常下饲养的动物；安慰剂：低氧和安慰剂输注下饲养的动物；奥达卡替：低氧和奥达卡替处理下饲养的动物。

图28显示了在犬心力衰竭模型的心右心室、左心室、右心房和左心房样品中CTSK的相对表达。对照：未进行起搏的动物；起搏的：进行起搏的动物。

图29显示了在犬心力衰竭模型的心右心室、左心室、右心房和左心房样品中ANP的相对表达。对照：未进行起搏的动物；起搏的：进行起搏的动物。

图30显示了对犬中起搏诱导的心力衰竭模型的急性实验设定(根据Yatsu等人， Pharmacol Res 2002; 46:375-381和Mondritzki等人，Am J Ther，2010年12月29日)。

参考文献：

。

　　　　　　　　　　　　　　　　　　序列表

<110> Bayer Intellectual Property GmbH

<120> 组织蛋白酶K抑制用于治疗和/或预防肺动脉高压和/或心力衰竭的用途

<130> BHC 11 1 014

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 990

<212> DNA

<213> 豚鼠

<400> 1

atgtgggggc tcaaggttct gctgctgcct gtggtgagct ttgctctgta ccctgaggag 60

atactggaca ctcagtggga gctttggaag aagacctaca ggaagcagta caatggcaag 120

gtggatgaaa tctctcggcg cataatttgg gaaaagaatc tgaaatatat ttccatccat 180

aaccttgagg cctctcttgg tgtccataca tatgaactga gcatgaacca cttgggagac 240

atgaccagtg aagaagtggt tcagaagatg actgggctca aagtacctcc ctctcattct 300

cacagtaatg ataccctgta catcccagac tgggaaggca gggctcctga ttctgttgac 360

taccgaaaga agggctatgt tactcccgtc aaaaaccagg gtcagtgtgg ttcctgttgg 420

gctttcagct ctgtgggtgc cctcgagggc cagctcaaga agaaaacagg caaactctta 480

aatctgagcc cccagaatct ggtggattgt gtatctgaga atgatggctg tggaggtggc 540

tatatgacca acgcctttca gtatgtgcaa gagaaccgtg gcattgactc tgaggacgcc 600

tatccctacg tgggccagga ggaaagctgt atgtacaatc caacaggcaa ggctgctaaa 660

tgccgcgggt atagagagat ccctgtgggc aatgagaagg cgctgaaaag agctgtggcc 720

cgcgtgggac ccgtctctgt ggccattgat gcaagcctga gctccttcca gttctacagc 780

aagggtgtgt attatgatga aagctgcaat ggtgaggatc tgaatcatgc actgctggca 840

gtgggatatg ggatgcagag aggaaataag cactggatac ttaaaaacag ctggggagaa 900

aactggggaa acaaaggcta tgttctcttg gctcgaaata agaacaatgc atgtggcatt 960

gccaacctcg ccagctttcc caagatgtga 990

<210> 2

<211> 329

<212> PRT

<213> 豚鼠

<400> 2

Met Trp Gly Leu Lys Val Leu Leu Leu Pro Val Val Ser Phe Ala Leu

1 5 10 15

Tyr Pro Glu Glu Ile Leu Asp Thr Gln Trp Glu Leu Trp Lys Lys Thr

20 25 30

Tyr Arg Lys Gln Tyr Asn Gly Lys Val Asp Glu Ile Ser Arg Arg Ile

35 40 45

Ile Trp Glu Lys Asn Leu Lys Tyr Ile Ser Ile His Asn Leu Glu Ala

50 55 60

Ser Leu Gly Val His Thr Tyr Glu Leu Ser Met Asn His Leu Gly Asp

65 70 75 80

Met Thr Ser Glu Glu Val Val Gln Lys Met Thr Gly Leu Lys Val Pro

85 90 95

Pro Ser His Ser His Ser Asn Asp Thr Leu Tyr Ile Pro Asp Trp Glu

100 105 110

Gly Arg Ala Pro Asp Ser Val Asp Tyr Arg Lys Lys Gly Tyr Val Thr

115 120 125

Pro Val Lys Asn Gln Gly Gln Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Ser

130 135 140

Val Gly Ala Leu Glu Gly Gln Leu Lys Lys Lys Thr Gly Lys Leu Leu

145 150 155 160

Asn Leu Ser Pro Gln Asn Leu Val Asp Cys Val Ser Glu Asn Asp Gly

165 170 175

Cys Gly Gly Gly Tyr Met Thr Asn Ala Phe Gln Tyr Val Gln Glu Asn

180 185 190

Arg Gly Ile Asp Ser Glu Asp Ala Tyr Pro Tyr Val Gly Gln Glu Glu

195 200 205

Ser Cys Met Tyr Asn Pro Thr Gly Lys Ala Ala Lys Cys Arg Gly Tyr

210 215 220

Arg Glu Ile Pro Val Gly Asn Glu Lys Ala Leu Lys Arg Ala Val Ala

225 230 235 240

Arg Val Gly Pro Val Ser Val Ala Ile Asp Ala Ser Leu Ser Ser Phe

245 250 255

Gln Phe Tyr Ser Lys Gly Val Tyr Tyr Asp Glu Ser Cys Asn Gly Glu

260 265 270

Asp Leu Asn His Ala Leu Leu Ala Val Gly Tyr Gly Met Gln Arg Gly

275 280 285

Asn Lys His Trp Ile Leu Lys Asn Ser Trp Gly Glu Asn Trp Gly Asn

290 295 300

Lys Gly Tyr Val Leu Leu Ala Arg Asn Lys Asn Asn Ala Cys Gly Ile

305 310 315 320

Ala Asn Leu Ala Ser Phe Pro Lys Met

325

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 豚鼠

<400> 3

tgagaatgat ggctgtggag 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 豚鼠

<400> 4

gtcaatgcca cggttctctt 20

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 豚鼠

<400> 5

atgaccaacg cctttcagta tgtgc 25

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 豚鼠

<400> 6

gagtctgcgc aggtccag 18

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 豚鼠

<400> 7

ctgctctggg ctccaatc 18

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 豚鼠

<400> 8

cttcggaggc cggatggaca g 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 豚鼠

<400> 9

gtgagaatgg acgctgtgtg 20

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 豚鼠

<400> 10

aagccctcga agcagtca 18

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 豚鼠

<400> 11

cgtgcgggag ggctacacct g 21

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 豚鼠

<400> 12

tgtcttcccc tccatcgt 18

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 豚鼠

<400> 13

ttctggccca tgcctaccat 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 豚鼠

<400> 14

aagatctggc ccttgaacct 20

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 犬

<400> 15

ggcaccagtc agaccgata 19

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 犬

<400> 16

cctattgtca atgcctctgg 20

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 犬

<400> 17

caaaattaag cgcaactggc ggaaa 25

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 犬

<400> 18

ggggagaaaa ctggggaaa 19

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 犬

<400> 19

gccgcaagcg ttgttctta 19

<210> 20

<211> 26

<212> DNA

<213> 犬

<400> 20

aaaggctata tcctcatggc tcggaa 26

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 犬

<400> 21

ttggaggaca agatgccttt 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 犬

<400> 22

cttccgcatt ctgctcactc 20

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 犬

<400> 23

aagatgaagc cgagtctccc caagc 25

Claims

1.组织蛋白酶K抑制剂，其用于治疗和/或预防肺动脉高压和/或急性或慢性心力衰竭的方法中。

2.式(I)至(XV)的化合物

或

其用于治疗和/或预防肺动脉高压和/或急性或慢性心力衰竭和/或其组合的方法中。

3.式(I)的化合物

4.式(I)的化合物

或它们的盐、溶剂合物和盐的溶剂合物，其用于治疗和/或预防肺动脉高压的方法中。

5.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述药物用于口服使用。

6.用于治疗和/或预防在人和动物中的肺动脉高压和/或急性或慢性心力衰竭的方法，其通过施用治疗有效量的至少一种权利要求1-4中任一项的化合物，包含与惰性的，非毒性的，药学上可接受的添加剂组合的至少一种权利要求1-4中任一项的化合物的药物，或包含与惰性的、非毒性的、药学上可接受的添加剂组合的至少一种权利要求1-4中任一项的化合物和至少一种其他的药学活性化合物的药物。