CN103665400A - 白芨止血凝胶的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及白芨有效成分和凝胶混合制备方法，具体涉及白芨提取物与透明质酸进行聚合制备止血凝胶的方法和应用。采用以白芨和透明质酸为原料，使水凝胶具有较强的伸缩性和一定的力学强度，又便于透明质酸的释放，可作为注射型水凝胶的使用。通过调节白芨用量和巯基化透明质酸浓度，可得到不同力学参数的水凝胶，获得具有止血功能的水凝胶。透明质酸是体内自身有的成分，可以促进细胞生长，生物相容性很好，本发明获得的水凝胶中透明质酸更易容易游离出来。

Description

白芨止血凝胶的制备方法及应用

技术领域

本发明属高分子材料技术领域，涉及白芨有效成分和凝胶混合制备方法，具体涉及白芨提取物与透明质酸进行聚合制备止血凝胶的方法和应用。

背景技术

白芨，又名白给、箬兰，为兰科白及属的一种，种拉丁名为Bletilla striata。多年生草本，假鳞茎块根状，白色，肥厚，有指状分歧。茎粗壮，直立，高30－60厘米。主要应用于咳血吐血，外伤出血，疮疡肿毒，皮肤皲裂。肺结核咳血，溃疡病出血。其球茎含白芨胶质、淀粉、挥发油等。药用，有收效、补肺止血、消肿等作用，外敷治创伤出血、痈肿、烫伤、疔疮等。

基于高分子量的PEGDA水凝胶是用于药物载体和组织工程用途，例如用于伤口闭合、药物递送、除皱产品中的填充、骨科领域的髓核、眼科领域的玻璃体。基于PEG的水凝胶是三维交联的分子网络，可吸收大量的水，再加上透明质酸对促进细胞生长有很大的帮助。

近年来可注射生物材料得到广泛研究并将对药物释放和组织工程领域具有重大影响。可注射水凝胶是一类原位形成的功能性水凝胶，其快速成型特点使得这类生物材料在临床方面具有广阔的应用前景。可注射水凝胶在体内时为凝胶状态，在体外时为溶液状态，在此状态下可以包埋如多肽、蛋白质、细胞等生物活性物质，当注射到皮下组织或肌肉组织后，由于温度的变化或化学交联反应的发生，包含有活性物质的溶液迅速转化为凝胶，而后活性物质在扩散作用和凝胶自身降解作用的双重推动下，从凝胶内平隐地释放出来，达到长期释放的效果。在包埋过程中，由于不会涉及有机溶剂，不会使得包埋物质的活性轻易丧失。可注射水凝胶的另一优势是它可通过注射方法植入体内，使流动性生物材料溶液可以充满整个具有不规则形状的受损部位，手术创伤小且容易操作。

公开号为CN1579559的中国专利公开了一种含药物、壳聚糖的聚乙烯醇水凝胶敷料及其制备方法，该种水凝胶敷料固体成分由合成和天然固体聚合物构成，另外添加适量的保湿剂、增塑剂、药物等，溶剂为二次蒸馏水、生理盐水或磷酸盐中性缓冲溶液。该种水凝胶敷料可以缓慢释放药物和具有生物抗菌活性的天然多糖壳聚糖，具有主动的抗菌能力，同时具有含水量高、保水性好、力学强度适中、透光、透气性好的特点，能满足湿法治疗各种创伤的要求，既可作为轻度皮肤创伤或慢性皮肤疾病的永久性敷料，也可用于严重皮肤组织创伤或烧伤创口的即时关闭。

公开号为CN101664563的中国专利公开了一种抗菌水凝胶敷料的制备方法，包括以下步骤：1)将双端羟基聚乙二醇溶于四氢呋喃中，加入丙烯酰氯后在氮气保护下于室温中反应；将所得的反应产物依次经过滤、蒸发、洗涤和浓缩，得聚乙二醇双丙烯酸酯交联剂；2)将含有Ag+的ZnO纳米颗粒配制成质量浓度为15-30%的纳米水溶液，Ag∶Zn的摩尔比=1∶4；然后将天然高分子材料溶入纳米水溶液中，得含有纳米Ag的天然高分子水溶液；3)将丙烯酰胺、聚乙二醇双丙烯酸酯交联剂和含有纳米Ag的天然高分子水溶液相混合，然后室温下置于60Co源辐照交联，得抗菌水凝胶敷料。采用该方法制备的抗菌水凝胶敷料是一种具有抗菌性能和水化性能的多孔网状敷料。

公开号为CN102977277A的中国专利公开了一种新型高强度微凝胶复合水凝胶的制备方法，采用丙烯酰胺和2-丙烯酰胺基-二甲基丙磺酸作为主要单体，用N-羟甲基丙烯酰胺作为功能单体，首先利用反相乳液聚合得到含有羟甲基的反应性微凝胶，再将这种微凝胶粒子分散到丙烯酰胺和2-丙烯酰胺基-二甲基丙磺酸的水溶液中并进行自由基聚合得到微凝胶复合聚合物，最后将这种微凝胶复合聚合物或先部分脱水的微凝胶复合聚合物在加热发生交联，就可以得到微凝胶复合水凝胶。并以纳米粘土作为交联剂。制得的复合水凝胶具有更高的机械强度，高吸水率，其强度和含水量与人体软骨组织类似，是软骨组织修复的可替代材料。

公开号为CN101721735A的中国专利公开了一种止血防渗水凝胶的制备方法，首先将由末端功能化的胶原、聚乙二醇、海藻酸盐、聚乳酸、聚三亚甲基碳酸二甲酯中的两种或多种以上共混使用，或使用上述材料中的两种或多种的共聚物配置成25%的乙醇溶液，涂抹于使用位置；然后加入引发剂，经过510-530nm的紫外光照射，形成凝胶。上述物质与溶剂水形成目标产品。使用时只需要把产品涂抹在需防粘连的部位，通过自由基引发剂引发上述材料的末端双键，从而形成交联，封闭渗血渗液的组织部位，从而达到止血防渗的目的。

公开号为CN1839797的中国专利公开了一种原位快速形成可注射超分子结构水凝胶的制备方法及其应用，包括如下步骤：室温下，将质量百分比浓度为8-12.7%的环糊精水溶液与质量百分比浓度为1-20%的水溶性聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯三嵌段共聚物的水溶液混合，凝胶原位迅速形成，即得到可注射超分子结构水凝胶，且该凝胶具有剪切变稀特性。本发明具有快速凝胶化、室温成形、不涉及任何化学交联反应及有机溶剂的使用，获得的水凝胶具有优良的生物降解性和生物相容性，可望在生物医学工程领域得到应用。

公开号为CN1965802的中国专利公开了一种聚乙二醇化药物的可注射性水凝胶制剂及其制备方法，具体涉及包裹了PEG化药物的可注射性水凝胶制剂及其制备方法。PEG化药物是指PEG修饰剂通过共价反应结合到原始药物分子上形成的药物分子，包裹药物的载体为可降解聚合物与水的混合物，该可降解聚合物为由PEG为亲水段和可降解的聚酯为疏水段的两亲性嵌段共聚或及衍生物等。该水凝胶制剂在体温以下时是流动的溶液，在体温时自发物理凝胶化成为不流动的凝胶，是一种可注射性水凝胶制剂。通过一次注射可使PEG化药物缓释从数天到数月不等，是一种长效的PEG化药物的缓释制剂。

公开号为CN2383500的中国专利公开了一种水凝胶复合型创伤敷料，是在水凝胶层2的一面覆盖一层透气性聚合物膜1。水凝胶层2与透气性聚合物膜1之间可设有粘附层3。水凝胶层2的另一面覆盖一层涂有硅酮4的离型纸5或剥离膜8。本产品具有良好透明度、高吸水性、透气性、透湿性，但不透水，可防止伤口感染、加速痊愈。适用于烧伤、烫伤、褥疮及外伤性创伤的创面保护及治疗。另外经过辐射灭菌，可长期贮存。

公开号为CN102573913A的中国专利公开了一种可生物降解的基于聚乙二醇的水不溶性水凝胶，其包括通过可水解降解的键互相连接的骨架部分，该骨架部分还包括反应性官能团，其中所述水不溶性水凝胶的其他特征为，通过将可降解键水解而将水凝胶完全降解成包含一个或多个骨架部分的水溶性降解产物的时间与基于水凝胶中骨架部分总量的前10摩尔%的包含一个或多个骨架部分的水溶性降解产物释放的时间的比值大于1并且小于等于2。本发明还涉及所述水凝胶与配体或连接基团的缀合物，前药和药物组合物以及它们在医药中的用途。

公开号为CN1535991的中国专利公开了一种高吸水性树脂及其制备方法，先用分子量200-1500的聚乙二醇减压蒸馏，与金属钠粉反应得到聚乙二醇钠；再以氯仿为溶剂，将聚乙二醇钠与丙烯酰氯在一定条件下密闭反应，将反应物过滤、减压蒸馏得到不同分子量的交联剂二丙烯酸聚乙二醇酯。其后在单体丙烯酸中加入去离子水，用氢氧化钠部分中和，加入2-甲基-(2-丙烯酰胺基)丙烷磺酸钠，通氮气，加入上述交联剂；最后再加入过氧化物引发剂进行反应，即可制得高吸水性树脂。本发明的交联剂，分子链长，活性适中；其高吸水性树脂交联均匀，线型可溶聚合物少，吸水速度快，吸盐水倍率高，吸盐水达饱和时，水凝胶仍具有一定的强度。

公开号为CN102898661A的中国专利公开了一种原位注射聚乙二醇型水凝胶及其制备方法，包括：以聚乙二醇和硫代苹果酸为原料，以三氟甲基磺酸稀土为催化剂，通过缩聚反应制备多巯基线形聚乙二醇型聚醚酯；以聚乙二醇和马来酸酐为初始原料，以三氟甲基磺酸稀土为催化剂，通过缩聚反应制备多双键线形聚乙二醇型聚醚酯；分别将多巯基线形聚乙二醇型聚醚酯及多双键线形聚乙二醇型聚醚酯溶PBS缓冲溶液中，两份溶液迅速混匀，静置，制得原位注射聚乙二醇型水凝胶。该方法操作简单，条件易控制，适于工业化生产。本发明还公开了一种原位注射聚乙二醇型水凝胶，具有可降解、可原位注射性能。

公开号为CN103131054A的中国专利公开了一种高强度水凝胶，以聚电解质(例如：透明质酸、聚谷氨酸、硫酸软骨素和聚赖氨酸)合成第一网络水凝胶，此水凝胶浸泡在双键功能化聚乙二醇水溶液中一段时间后取出，进行交联得到高强度的双网络水凝胶。所合成的高强度水凝胶，具有良好的生物相容性，可以作为组织工程/修复支架材料等，在生物医学材料领域有广泛的用途。

公开号为CN102718991A的中国专利公开了一种高强度可注射水凝胶及其制备方法，涉及一种利用聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)的双键与巯基化天然聚合物上的巯基发生Michael加成反应，同时以聚乙二醇与聚己内酯(PEG-PCL-PEG)的三嵌段共聚物的纳米粒子为增强剂而形成的水凝胶，此类水凝胶具有较高的力学强度，为生物相容性良好且可注射水凝胶和可降解水凝胶，凝胶速率较快。该水凝胶的特点是原料价廉易得、制备方法简单，在生物医用领域具有良好的应用前景。由于采用低分子量的聚乙二醇为原料，对后期形成的凝胶的伸缩性有较大影响，再加上采用增强剂进行增强，增加了合成的难度和步骤。

公开号为CN101249274的中国专利公开了一种促进伤口愈合的白芨多糖水凝胶的制备及其应用，将白芨多糖溶于去离子纯水中，加入适量高碘酸钠，搅拌反应过夜，经去离子水透析除去高碘酸钠，得到醛基化的白芨多糖；醛基化的白芨多糖与多胺类交联剂的质量比为20：1，8：1，4：1，2：11：1，1：2，混合后加热蒸发水溶剂，得到不同配比的白芨水凝胶。具有良好的消炎作用，良好的透气性，良好的保湿作用以及吸收创伤分泌物的功能，在动物模型中显著提高了创伤愈合的速度。但只采用白芨中一种成分制备白芨水凝胶，并不能使白芨止血和抗菌作用发挥出良好效果。

发明内容

针对合成水凝胶的原料中PEG分子量越小，对水的吸附能力越差，润滑性能也变差，水凝胶的力学强度差，另外透明质酸虽对骨骼生长具有显著效果，但需要透明质酸的持续释放才能达到。若水凝胶的力学强度差将会造成一次性释放或，而水凝胶的力学强度高会由于孔隙小（PEG分子量小）造成不释放。创伤后组织在生长过程中易受到出血液影响，而我们将合成水凝胶的原料中加入高分子量的PEG和透明质酸和部分白芨提取物，并将其注射到骨间隙中有利于改善骨骼生长效果和达到良好地止血效果。

本发明目的是为了改善水凝胶的水吸附能力和润滑性能以及促进人体骨骼生长，同时合成过程更加温和，提供一种止血凝胶及其制备方法。创伤后以减少组织出血和促进透明质酸的有效释放是本发明的创新点，采用以白芨和透明质酸为原料，使水凝胶具有较强的伸缩性和一定的力学强度，又便于透明质酸的释放，可作为注射型水凝胶的使用。

利用白芨与巯基化透明质酸合成水凝胶分为三个步骤进行：

（1）白芨处理过程如下：

取新鲜白芨，去根洗净,高温高压处理10-30min，将其捣碎后用帆布盛放，用30-45℃水冲洗，收集滤液，静置取沉淀后20-40℃低温干燥，备用。

（2）利用透明质酸制备巯基化透明质酸的过程:

a.巯基化试剂为2，2‘-二硫代二酰胺，3,3’-二硫代二丙酰胺，4,4’-二硫代二丁酰胺：

b.巯基化试剂为2，2‘-二硫代二乙酰肼，3,3’-二硫代二丙酰肼，4,4’-二硫代二丁酰肼：

具体制备方法如下：

将2g透明质酸溶解于水中，加入带有二硫键的化合物，温度在15-45度，用1mol/L HCl将pH至3-6，加入0.5-10克1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺（EDC），搅拌至少2h，用1mol/L NaOH调节pH至5-9，加入0.6-1.5kg的含二硫键化合物，用1mol/L NaOH调节pH至6-10，搅拌12-72h，搅拌速度为100-2000rpm，用HCl调节pH至2-5，装入透析袋中进行透析，其中透析袋的截留分子量为2000-10000Da，或直接超滤，其中超滤膜的截留分子量为1000-2000Da，在2-8℃下离心速度为3000-10000rpm。，取上清液冷冻干燥，其中冷肼温度为-40-60℃，真空度为<20Pa，得巯基化透明质酸。

本发明所使用的透明质酸分子量在1万-200万道尔顿左右。

本发明所采用的含二硫键化合物为2，2‘-二硫代二酰胺，3,3’-二硫代二丙酰胺，4,4’-二硫代二丁酰胺，2，2‘-二硫代二乙酰肼，3,3’-二硫代二丙酰肼，4,4’-二硫代二丁酰肼。

本发明所述加入水量（kg）为透明质酸（kg）重量的50-250倍。

本发明所述加入带有二硫键的化合物的量（kg）为透明质酸（kg）重量的1-5倍。

本发明所述透析方法为在含有2.5-15克NaCl（pH2-5）的盐酸溶液中透析1-3天，在HCl（pH,2-5）中透析1-3天。

本发明所述超滤方法为用含有2.5-15克NaCl（pH2-5）的盐酸溶液进行超滤，再用HCl（pH,2-5）中进行超滤。

本发明所得到的巯基化透明质酸可以用于植入假体材料，也可以作为合成水凝胶的原料，也可直接于化妆品中保水材料和除皱等方面的应用。

Ellman法定性定量：Ellman法可测定游离巯基的量，而HA为重复的二糖结构，其羧基的数量基本固定，因此，通过测定巯基化透明质酸所含的巯基的量，即可求算出羧基覆盖率即产率（SD%）。

Ellman法原理：游离巯基与过量DTNB常温孵育，生成有色物质，在412nm紫外光处有吸收，E_mol=13600，根据Lambert-Beer定律，A=E_molCL（L=1），可通过测定吸光度（A），求得实际巯基浓度。

巯基化产率计算方法：巯基化HA由重复二糖结构组成，每个二糖单元分子量为388，含有一个可反应的羧基，接上巯基后的分子量为491，本实验称取HA-SH0.005g，配制成0.05L溶液（浓度为0.1g/L），使其与过量DTNB常温孵育，生成有色物质，在412nm测定其吸光度（A）。则：1g产物含巯基数量为N=A/E_molL/0.1。本发明所合成巯基化透明质酸的A值均在1.7以上，则巯基产率在1250μmol/g以上。

（3）利用白芨和巯基化透明质酸制备水凝胶的过程如下：

将10-25g白芨处理物用100mLPBS在40-70℃溶解，形成10%-25%溶液，将0.1-1.0g巯基化透明质酸用100mLPBS溶解，取白芨处理物和巯基化透明质酸溶液，按1:2体积比混合均匀，向混合液中加入5-25g的丙烯酸，再加入0.1-4%的过硫酸铵水溶液，在25-40℃静置一定时间，逐渐形成凝胶，即可。

一个具体实施方案中，所述PBS溶液配制方法为：氯化钠NaCl0.8g、磷酸二氢钾KH₂PO₄0.024g、磷酸氢二钠Na₂HPO₄0.144g、氯化钾KCl0.02g、碳酸氢钠NaHCO₃0.3g用水配成100mL。

另一个具体实施方案中，所述一定时间为4-20min。

技术效果

1、原位注射，实现无创手术。

2、通过调节白芨用量和巯基化透明质酸浓度，可得到不同力学参数的水凝胶，获得具有止血功能的水凝胶。

3、透明质酸是体内自身有的成分，可以促进细胞生长，生物相容性很好，本发明获得的水凝胶中透明质酸更易容易游离出来。

4、通过过硫酸铵使白芨多糖、透明质酸等物质与丙烯酸交联，能提高白芨止血功能，其中白芨胶质与透明质酸相互作用更能达到生肌活肤的效果。

具体实施方式

通过下面的具体实施例可进一步了解本发明。但他们不是对本发明的限定。

实施例1

取新鲜白芨，去根洗净,高温高压处理20min，将其捣碎后用帆布盛放，用30-45℃水冲洗，收集滤液，静置取沉淀后20-40℃低温干燥，备用。

称取2.0g透明质酸（10万，注射级，生物发酵）加入到200mL灭菌三蒸水，搅拌至溶解，加入4.0g2，2’-二硫代二酰胺，再用1.0mol/L HCl调节pH至3.0，加入1.5gEDC搅拌2h，再用1.0mol/L NaOH调节pH至7.0，加入β-巯基乙醇5g，用1.0mol/L NaOH调节pH至8.0，搅拌,12h，用1.0mol/L HCl调节pH至2.0，装入Mw3500Da的透析袋在5gNaCl的0.01mol/L HCl（pH,2.0）中透析1天，在0.01mol/L HCl（pH,2.0）溶液中透析1天，离心，上清液冷冻干燥，得到1.85g巯基化透明质酸，采用Ellman法定性定量测定所得巯基的产率达到1661μmol/g。

将10g处理好的白芨用100mLPBS（氯化钠NaCl0.8g、磷酸二氢钾KH₂PO₄0.024g、磷酸氢二钠Na₂HPO₄0.144g、氯化钾KCl0.02g、碳酸氢钠NaHCO₃0.3g用水配成100mL）溶解在50℃，形成10%溶液，将1g巯基化透明质酸用200mLPBS（氯化钠NaCl0.8g、磷酸二氢钾KH₂PO₄0.024g、磷酸氢二钠Na₂HPO₄0.144g、氯化钾KCl0.02g、碳酸氢钠NaHCO₃0.3g用水配成100mL）溶解，取50mL白芨溶液和100mL巯基化透明质酸溶液，向混合液中加入10g的丙烯酸，再加入0.5%过硫酸铵溶液，进行均匀混合，30℃静置9min，逐渐形成水凝胶，即可。

实施例2

取新鲜白芨，去根洗净,高温高压处理30min，将其捣碎后用帆布盛放，用30-45℃水冲洗，收集滤液，静置取沉淀后20-40℃低温干燥，备用。

称取2.0g透明质酸（50万，注射级，生物发酵）加入到250mL灭菌三蒸水，搅拌至溶解，加入2.5g4，4’-二硫代二乙酰胺，再用1.0N HCl调节pH至4.0，加入2.5g EDC搅拌2h，再用1.0mol/L NaOH调节pH至7.0，加入β-巯基乙醇15g，用1.0mol/L NaOH调节pH至8.5，搅拌,12h，用1.0mol/L HCl调节pH至3.0，用超滤(宁波宏耀电泳科技有限公司，截留分子量为1500Da)进行超滤，在含有10g NaCl的0.001mol/L HCl（pH,3.0）中超滤，再在含有0.001mol/LHCl（pH,3.0）中超滤2天，离心，上清液冷冻干燥，得到1.78g巯基化透明质酸，采用Ellman法定性定量测定所得巯基的产率达到1692μmol/g。

将15g处理好的白芨用100mLPBS（氯化钠NaCl0.8g、磷酸二氢钾KH₂PO₄0.024g、磷酸氢二钠Na₂HPO₄0.144g、氯化钾KCl0.02g、碳酸氢钠NaHCO₃0.3g用水配成100mL）溶解在50℃，形成15%溶液，将1g巯基化透明质酸用200mLPBS（氯化钠NaCl0.8g、磷酸二氢钾KH₂PO₄0.024g、磷酸氢二钠Na₂HPO₄0.144g、氯化钾KCl0.02g、碳酸氢钠NaHCO₃0.3g用水配成100mL）溶解，取50mL白芨溶液和100mL巯基化透明质酸溶液，向混合液中加入15g的丙烯酸，再加入0.6%过硫酸铵溶液，进行均匀混合，30℃静置12min，逐渐形成水凝胶，即可。

实施例3

取新鲜白芨，去根洗净,高温高压处理25min，将其捣碎后用帆布盛放，用30-45℃水冲洗，收集滤液，静置取沉淀后20-40℃低温干燥，备用。

称取2.0g透明质酸（80万，注射级，生物发酵）加入到300mL灭菌三蒸水，搅拌至溶解，加入3.0g2，2’-二硫代二乙酰肼，再用1.0mol/L HCl调节pH至4.5，加入3.0g EDC搅拌2h，再用1.0mol/L NaOH调节pH至7.4，加入β-巯基乙醇20g，用1.0mol/L NaOH调节pH至8.5，搅拌,24h，用1.0mol/L HCl调节pH至3.5，装入Mw3500Da的透析袋在15g NaCl（pH,3.5）中透析2天，在HCl（pH,3.5）中透析2天，离心，上清液冷冻干燥，得到1.85g巯基化透明质酸，采用Ellman法定性定量测定所得巯基的产率达到1762μmol/g。

将15g处理好的白芨用100mLPBS（氯化钠NaCl0.8g、磷酸二氢钾KH₂PO₄0.024g、磷酸氢二钠Na₂HPO₄0.144g、氯化钾KCl0.02g、碳酸氢钠NaHCO₃0.3g用水配成100mL）溶解在50℃，形成15%溶液，将1g巯基化透明质酸用200mLPBS（氯化钠NaCl0.8g、磷酸二氢钾KH₂PO₄0.024g、磷酸氢二钠Na₂HPO₄0.144g、氯化钾KCl0.02g、碳酸氢钠NaHCO₃0.3g用水配成100mL）溶解，取50mL白芨溶液和100mL巯基化透明质酸溶液，向混合液中加入20g的丙烯酸，再加入0.3%过硫酸铵溶液，进行均匀混合，30℃静置9min，逐渐形成水凝胶，即可。

实施例4

取新鲜白芨，去根洗净,高温高压处理25min，将其捣碎后用帆布盛放，用30-45℃水冲洗，收集滤液，静置取沉淀后20-40℃低温干燥，备用。

称取2.0g透明质酸（120万，注射级，生物发酵）加入到300mL灭菌三蒸水，搅拌至溶解，加入3.0g2，2’-二硫代二乙酰肼，再用1.0mol/L HCl调节pH至4.5，加入3.0g EDC搅拌2h，再用1.0mol/L NaOH调节pH至7.4，加入β-巯基乙醇20g，用1.0mol/L NaOH调节pH至8.5，搅拌,24h，用1.0mol/LHCl调节pH至3.5，装入Mw3500Da的透析袋在15g NaCl（pH,3.5）中透析3天，在HCl（pH,3.5）中透析2天，离心，上清液冷冻干燥，得到1.87g巯基化透明质酸，采用Ellman法定性定量测定所得巯基的产率达到1787μmol/g。

将20g处理好的白芨用100mLPBS（氯化钠NaCl0.8g、磷酸二氢钾KH₂PO₄0.024g、磷酸氢二钠Na₂HPO₄0.144g、氯化钾KCl0.02g、碳酸氢钠NaHCO₃0.3g用水配成100mL）溶解在55℃，形成20%溶液，将1g巯基化透明质酸用200mLPBS（氯化钠NaCl0.8g、磷酸二氢钾KH₂PO₄0.024g、磷酸氢二钠Na₂HPO₄0.144g、氯化钾KCl0.02g、碳酸氢钠NaHCO₃0.3g用水配成100mL）溶解，取50mL白芨溶液和100mL巯基化透明质酸溶液，向混合液中加入10g的丙烯酸，再加入0.6%过硫酸铵溶液，进行均匀混合，30℃静置13min，逐渐形成水凝胶，即可。

Claims (8)

1.白芨止血凝胶的制备方法及应用，具体操作步骤如下：

（1）取新鲜白芨，去根洗净,高温高压处理10-30min，将其捣碎后用帆布盛放，用30-45℃水冲洗，收集滤液，静置取沉淀后20-40℃低温干燥，备用；

（2）将2g透明质酸溶解于水中，加入带有二硫键的化合物，温度在15-45度，用1mol/L HCl将pH至3-6，加入0.5-10克1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺（EDC），搅拌至少2h，用1mol/L NaOH调节pH至5-9，加入0.6-1.5kg的含二硫键化合物，用1mol/L NaOH调节pH至6-10，搅拌12-72h，搅拌速度为100-2000rpm，用HCl调节pH至2-5，装入透析袋中进行透析，其中透析袋的截留分子量为2000-10000Da，或直接超滤，其中超滤膜的截留分子量为1000-2000Da，在2-8℃下离心速度为3000-10000rpm。，取上清液冷冻干燥，其中冷肼温度为-40-60℃，真空度为<20Pa，得巯基化透明质酸；

（3）将10-25g白芨处理物用100mLPBS在40-70℃溶解，形成10%-25%溶液，将0.1-1.0g巯基化透明质酸用100mLPBS溶解，取白芨处理物和巯基化透明质酸溶液，按1:2体积比混合均匀，向混合液中加入5-25g的丙烯酸，再加入0.1-4%的过硫酸铵水溶液，在25-40℃静置4-20min，逐渐形成凝胶，即可。

2.根据权利要求1的方法，步骤（2）中透明质酸分子量在1万-200万道尔顿左右。

3.根据权利要求1的方法，步骤（2）所采用的含二硫键化合物为2，2‘-二硫代二酰胺，3,3’-二硫代二丙酰胺，4,4’-二硫代二丁酰胺，2，2‘-二硫代二乙酰肼，3,3’-二硫代二丙酰肼，4,4’-二硫代二丁酰肼。

4.根据权利要求1的方法，步骤（2）所述加入水量kg为透明质酸重量kg的50-250倍。

5.根据权利要求1的方法，步骤（2）所述加入带有二硫键的化合物的重量kg为透明质酸重量kg的1-5倍。

6.根据权利要求1的方法，步骤（2）所述透析方法为在含有2.5-15克氯化钠的pH2-5的盐酸水溶液中透析1-3天，再在pH2-5的盐酸水溶液中透析1-3天。

7.根据权利要求1的方法，步骤（2）所述超滤方法为用含有2.5-15克氯化钠的pH2-5的盐酸水溶液中进行超滤，再在pH2-5的盐酸水溶液中进行超滤。

8.根据权利要求1的方法，步骤（3）中所述PBS溶液配制方法为：氯化钠NaCl0.8g、磷酸二氢钾KH₂PO₄0.024g、磷酸氢二钠Na₂HPO₄0.144g、氯化钾KCl0.02g、碳酸氢钠NaHCO₃0.3g用水配成100mL。