CN107349469A - 气管内创面修复用温敏水凝胶的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种气管内膜损伤修复用温敏水凝胶的制备方法，主要以白芨水提物、壳聚糖、甘油磷酸钠为原料。所得温敏水凝胶呈半流动状态，无纤毛毒性，并具有良好的抑菌性及生物相容性，可促进气管内膜损伤的修复，防止疤痕的过度生成,预防气管创伤愈合后管瘢痕性狭窄的发生，有良好的研究应用前景。

Description

气管内创面修复用温敏水凝胶的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及医药材料领域，特别是涉及气管内创面修复用半流动态温敏水凝胶的制备方法。
背景技术
随着微创外科技术的发展, 经气管镜腔内治疗已成为气管内病变的重要治疗方法，但会不可避免地造成气管内创面，且创面愈合时间和质量与治疗效果密切相关。此外，机械性损伤、烧灼伤、气管插管等均易造成气管内一定程度的损伤，形成气管内创面，在其愈合过程中易发生气管瘢痕性狭窄，严重影响患者生活质量乃至威胁患者生命。气管狭窄瘢痕以成纤维细胞过度增生、细胞外基质过度沉积和成分改变为其病理特征,本质上是一种增生性瘢痕, 往往引起外观畸形或组织功能障碍，治疗方法主要有介入治疗、外科手术治疗和药物治疗等，常用的方法包括支气管镜或支撑喉镜下激光、氩气刀、冷冻等瘢痕切除术、球囊扩张成形术，以及各种支架置入术等。这些治疗方法可在气管内造成新的损伤，易出现再狭窄。因此，使气管内创面正常再生修复，防止疤痕过度增生，预防气管瘢痕性狭窄的发生是目前研究的重点和难点。
壳聚糖有止血、止痛、调节巨噬细胞和成纤维细胞生长及广泛的抑菌作用，不同浓度、不同来源的壳聚糖及其衍生物一方面促进成纤维细胞的增殖，有利于新生修复组织的结构重塑和构建，能增强或恢复伤口愈合后的力学强度；另一方面抑制成纤维细胞的过度繁殖，防止疤痕增生，利于外观和功能的恢复，使伤口愈合质量提高，近年来, 人们开始以壳聚糖为原料制备智能水凝胶，通过不同制备途径，可得到各种类型温敏水凝胶。壳聚糖温敏水凝胶制备条件温和，具有原位成胶的特点，并有生物黏附、生物相容和可生物降解等特性，广泛应用于组织工程修复和药物释放载体的研究中。
温敏水凝胶是指随着外界温度变化而产生刺激响应性的智能水凝胶，其响应性依赖于温度的变化，有临界相转变温度，优点在于可以在液态下复合细胞、治疗性的药物、生长因子等，以内窥镜或者注射器等微创的方式将其植入体内并且在原位形成凝胶。
授权公告号CN 104984401 A（申请号201510434128.3）的中国专利文献公开了一种温敏水凝胶/磷酸三钙材料的制备方法，该方法步骤流程包括将温敏水凝胶在低温下溶解、按一定比例加入磷酸三钙粉体、混合材料随意塑形成任何想要的形状。公布号CN103004757 A（申请号201210571657.4）的中国专利文献公开了一种多孔温敏水凝胶缓释剂及其制备方法。发明以聚N-异丙基丙烯酰胺多孔温敏水凝胶为载体，在凝胶内负载上药物，利用聚N-异丙基丙烯酰胺的温度敏感特性，来实现对药物的控制释放。当温度低于水凝胶的LCST时，药物释放很慢，而当温度高于其LCST时，释放速率加快。
近年来围绕壳聚糖及其衍生物温敏水凝胶的研究逐年增多, 在再生医学和组织工程学应用方面，如注射填充不规则形状的腔隙或常规器械难以到达的部位，作为药物载体和基因载体等，在外伤敷料、妇科疾病、口腔及牙周疾病、血管栓塞载体的应用等方面做了大量有意义的研究工作，但有关气管内创面修复用功能复合温敏水凝胶的研究鲜有报道，本发明构建气管内创面修复用功能复合温敏水凝胶，适合气管腔内特殊环境的治疗要求，可诱导气管内创面再生修复、预防创面感染、抑制疤痕增生、提高愈合质量、预防气管瘢痕性狭窄的发生，对气管内创面修复及气管内病变的腔内治疗有重要意义。
发明内容
针对现有技术的问题，本发明的目的是提供一种气管内创面修复用温敏水凝的制备方法，呈半流动状态，适合气管腔内特殊环境的治疗要求，具有良好的抑菌作用及生物相容性，无纤毛毒性，可诱导气管内创面再生修复、预防创面感染、抑制疤痕增生、提高愈合质量、预防气管瘢痕性狭窄的发生，在气管内膜损伤局部治疗方面，有着良好的研究应用前景。
本发明的技术方案是：
气管内膜损伤修复用半流动状态温敏水凝胶制备方法，呈半流动状态，以白芨水提物、壳聚糖、甘油磷酸钠为主要原料，具体步骤如下：
（1）取白芨洗净，用纱布包好放于蒸馏水中浸泡40分钟，用电阻炉功率调制550W,大火进行性加热30分钟，后用400W功率小火继续加热，然后过滤除去滤渣，得白芨提取液备用；
（2）取壳聚糖粉碎研磨5-15分钟，置于0.1mol/L的冰乙酸中充分溶解后，加入白芨提取液，用pH计测量其pH值，逐滴添加56%的甘油磷酸钠，并不断搅拌，用饱和的磷酸氢钠溶液调节pH至6.96；
（3）将上述配置好的壳聚糖溶液置于容器中，放入恒温水浴锅中加热，待溶液呈半流动状态时，即形成温敏水凝胶。
所述的温敏水凝胶的制备方法，取下列重量份的原料，壳聚糖0.1-0.19，白芨水提物0.25-1.0，甘油磷酸钠0.5-1.5（优选为壳聚糖0.15，白芨水提物0.25，甘油磷酸钠1.0）。
所述的温敏水凝胶的制备方法，步骤（1）蒸馏水的用量为白芨重量的10-40倍（优选为蒸馏水的用量为白芨重量的20倍）。
所述的温敏水凝胶的制备方法，步骤（1）小火继续加热25-35分钟（优选的：小火继续加热30分钟）。
所述的温敏水凝胶的制备方法，步骤（2）冰乙酸水溶液的用量为壳聚糖质量的100倍。
所述的温敏水凝胶的制备方法，步骤（3）恒温水浴锅的温度为34-40℃（优选的：恒温水浴锅的温度为37℃）。
本发明提供的气管内创面修复用温敏水凝胶的制备方法科学，工艺简单，所得产品同时兼具了壳聚糖和白芨的特性，具有良好的抑菌作用及良好的生物相容性以及无纤毛毒性在气管内膜损伤局部治疗方面，有着良好的研究应用前景。
附图说明
图1为纤毛毒性试验的观察结果；
图2为不同浓度的温敏水凝胶对NIH-3T3细胞存活率的影响结果；注：A1；A2;A3;A4;A5;A6依次代表稀释倍数，分别为是0倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍，B.C.D.同上；柱状图横纵坐标分别为稀释倍数和细胞相对增值率；
图3：a所得温敏水凝胶相转变前;b所得温敏水凝胶相转变后。
具体实施方式
下面结合实施例和实验例详细说明本发明的技术方案，但保护范围不限于此。
本申请所用材料均可从市场购买，其中白芨购自聊城市中医院；壳聚糖购自浙江金壳生物化学有限公司，批号为20140318C；甘油磷酸钠为国产分析纯，购自湖北远成赛创科技有限公司。
实施例1气管内创面修复用温敏水凝胶的制备方法，步骤如下：
（1）取白芨4g洗净，用纱布包好放于80ml蒸馏水中浸泡40分钟，用电阻炉功率调制550W,大火进行性加热30分钟，后用400W功率小火继续加热25分钟，然后过滤除去滤渣得白芨提取液备用；
（2）取壳聚糖0.1g粉碎研磨5分钟，置于10ml，0.1mol/L的冰乙酸中充分溶解后，加入白芨提取液0.25ml，用pH计测量其pH值，逐滴添加56%的甘油磷酸钠1.0ml，并不断搅拌，用饱和的磷酸氢钠溶液调节pH至 6.96；
（3）将上述配置好的壳聚糖溶液置于容器中，放入34℃恒温水浴锅中加热4分钟，呈半流动状态，即形成温敏水凝胶。
实施例2气管内创面修复用温敏水凝胶的制备方法，步骤如下：
（1）取白芨4g洗净，用纱布包好放于80ml蒸馏水中浸泡40分钟，用电阻炉功率调制550W,大火进行性加热30分钟，后用400W功率小火继续加热25分钟，然后过滤除去滤渣得白芨提取液备用；
（2）取壳聚糖0.15g粉碎研磨15分钟，置于10ml，0.1mol/L的冰乙酸中充分溶解后，加入白芨提取液1.0ml，用pH计测量其pH值，逐滴添加56%的甘油磷酸钠1.0ml，并不断搅拌，用饱和的磷酸氢钠溶液调节pH至6.96；
（3）将上述配置好的壳聚糖溶液置于容器中，放入40℃恒温水浴锅中加热加热2分钟，呈半流动状态，即形成温敏水凝胶。
实施例3气管内创面修复用温敏水凝胶的制备方法，步骤如下：
（1）取白芨4g洗净，用纱布包好放于80ml蒸馏水中浸泡40分钟，用电阻炉功率调制550W,大火进行性加热30分钟，后用400W功率小火继续加热30分钟，然后过滤除去滤渣得白芨提取液备用；
（2）取壳聚糖0.19g粉碎研磨10分钟，置于10ml，0.1mol/L的冰乙酸中充分溶解后，加入白芨提取液0.50ml，用pH计测量其pH值，逐滴添加56%的甘油磷酸钠1.0ml，并不断搅拌，用饱和的磷酸氢钠溶液调节pH至6.96；
（3）将上述配置好的壳聚糖溶液置于容器中，放入37℃恒温水浴锅中加热加热4分钟，呈半流动状态，即形成白芨壳聚糖基温敏水凝胶。
实施例4气管内创面修复用温敏水凝胶的制备方法，步骤如下：
（1）取白芨2g洗净，用纱布包好放于80ml蒸馏水中浸泡40分钟，用电阻炉功率调制550W,大火进行性加热30分钟，后用400W功率小火继续加热30分钟，然后过滤除去滤渣得白芨提取液备用；
（2）取壳聚糖0.12g粉碎研磨10分钟，置于10ml，0.1mol/L的冰乙酸中充分溶解后，加入白芨提取液0.50ml，用pH计测量其pH值，逐滴添加56%的甘油磷酸钠1.0ml，并不断搅拌，用饱和的磷酸氢钠溶液调节pH至6.96；
（3）将上述配置好的壳聚糖溶液置于容器中，放入37℃恒温水浴锅中加热加热4分钟，呈半流动状态.即形成温敏水凝胶。
实施例5气管内创面修复用温敏水凝胶的制备方法，步骤如下：
（1）取白芨4g洗净，用纱布包好放于80ml蒸馏水中浸泡40分钟，用电阻炉功率调制550W,大火进行性加热30分钟，后用400W功率小火继续加热30分钟，然后过滤除去滤渣得白芨提取液备用；
（2）取壳聚糖0.2g粉碎研磨10分钟，置于10ml，0.1mol/L的冰乙酸中充分溶解后，加入白芨提取液0.50ml，用pH计测量其pH值，逐滴添加56%的甘油磷酸钠1.0ml，并不断搅拌，用饱和的磷酸氢钠溶液调节pH至6.96；
（3）将上述配置好的壳聚糖溶液置于容器中，放入37℃恒温水浴锅中加热加热4分钟，呈半流动状态，即形成温敏水凝胶。
实施例6气管内创面修复用温敏水凝胶的制备方法，步骤如下：
（1）取白芨8g洗净，用纱布包好放于80ml蒸馏水中浸泡40分钟，用电阻炉功率调制550W,大火进行性加热30分钟，后用400W功率小火继续加热30分钟，然后过滤除去滤渣得白芨提取液备用；
（2）取壳聚糖0.15g粉碎研磨10分钟，置于10ml，0.1mol/L的冰乙酸中充分溶解后，加入白芨提取液0.50ml，用pH计测量其pH值，逐滴添加56%的甘油磷酸钠1.0ml，并不断搅拌，用饱和的磷酸氢钠溶液调节pH至6.96；
（3）将上述配置好的壳聚糖溶液置于容器中，放入37℃恒温水浴锅中加热加热4分钟，呈半流动状态，即形成温敏水凝胶。
实施例7气管内创面修复用温敏水凝胶的制备方法，步骤如下：
（1）取白芨4g洗净，用纱布包好放于80ml蒸馏水中浸泡40分钟，用电阻炉功率调制550W,大火进行性加热30分钟，后用400W功率小火继续加热30分钟，然后过滤除去滤渣得白芨提取液备用；
（2）取壳聚糖0.16g粉碎研磨10分钟，置于10ml，0.1mol/L的冰乙酸中充分溶解后，加入白芨提取液0.50ml，用pH计测量其pH值，逐滴添加56%的甘油磷酸钠0.5ml，并不断搅拌，用饱和的磷酸氢钠溶液调节pH至6.96；
（3）将上述配置好的壳聚糖溶液置于容器中，放入37℃恒温水浴锅中加热加热4分钟，呈半流动状态，即形成温敏水凝胶。
实施例8气管内创面修复用温敏水凝胶的制备方法，步骤如下：
（1）取白芨4g洗净，用纱布包好放于80ml蒸馏水中浸泡40分钟，用电阻炉功率调制550W,大火进行性加热30分钟，后用400W功率小火继续加热30分钟，然后过滤除去滤渣得白芨提取液备用；
（2）取壳聚糖0.14g粉碎研磨10分钟，置于10ml，0.1mol/L的冰乙酸中充分溶解后，加入白芨提取液0.50ml，用pH计测量其pH值，逐滴添加56%的甘油磷酸钠1.0ml，并不断搅拌，用饱和的磷酸氢钠溶液调节pH至6.96；
（3）将上述配置好的壳聚糖溶液置于容器中，放入37℃恒温水浴锅中加热加热4分钟，呈半流动状态，即形成温敏水凝胶。
实施例9气管内创面修复用温敏水凝胶的制备方法，步骤如下：
（1）取白芨4g洗净，用纱布包好放于80ml蒸馏水中浸泡40分钟，用电阻炉功率调制550W,大火进行性加热30分钟，后用400W功率小火继续加热30分钟，然后过滤除去滤渣得白芨提取液备用；
（2）取壳聚糖0.17g粉碎研磨10分钟，置于10ml，0.1mol/L的冰乙酸中充分溶解后，加入白芨提取液0.50ml，用pH计测量其pH值，逐滴添加56%的甘油磷酸钠1.5ml，并不断搅拌，用饱和的磷酸氢钠溶液调节pH至6.96；
（3）将上述配置好的壳聚糖溶液置于容器中，放入37℃恒温水浴锅中加热加热4分钟，呈半流动状态，即形成温敏水凝胶。
实施例10气管内创面修复用温敏水凝胶的制备方法，步骤如下：
（1）取白芨4g洗净，用纱布包好放于80ml蒸馏水中浸泡40分钟，用电阻炉功率调制550W,大火进行性加热30分钟，后用400W功率小火继续加热35分钟，然后过滤除去滤渣得白芨提取液备用；
（2）取壳聚糖0.18g粉碎研磨15分钟，置于10ml，0.1mol/L的冰乙酸中充分溶解后，加入白芨提取液1.0ml，用pH计测量其pH值，逐滴添加56%的甘油磷酸钠1.0ml，并不断搅拌，用饱和的磷酸氢钠溶液调节pH至6.96；
（3）将上述配置好的壳聚糖溶液置于容器中，放入35℃恒温水浴锅中加热加热6分钟，呈半流动状态，即形成温敏水凝胶。
实施例11气管内创面修复用温敏水凝胶的制备方法，步骤如下：
（1）取白芨4g洗净，用纱布包好放于80ml蒸馏水中浸泡40分钟，用电阻炉功率调制550W,大火进行性加热30分钟，后用400W功率小火继续加热35分钟，然后过滤除去滤渣得白芨提取液备用；
（2）取壳聚糖0.18g粉碎研磨15分钟，置于10ml，0.1mol/L的冰乙酸中充分溶解后，加入白芨提取液1.0ml，用pH计测量其pH值，逐滴添加56%的甘油磷酸钠1.0ml，并不断搅拌，用饱和的磷酸氢钠溶液调节pH至6.96；
（3）将上述配置好的壳聚糖溶液置于容器中，放入37℃恒温水浴锅中加热加热4分钟，呈半流动状态，即形成温敏水凝胶。
实施例12气管内创面修复用温敏水凝胶的制备方法，步骤如下：
（1）取白芨4g洗净，用纱布包好放于80ml蒸馏水中浸泡40分钟，用电阻炉功率调制550W,大火进行性加热30分钟，后用400W功率小火继续加热35分钟，然后过滤除去滤渣得白芨提取液备用；
（2）取壳聚糖0.12g粉碎研磨15分钟，置于10ml，0.1mol/L的冰乙酸中充分溶解后，加入白芨提取液1.0ml，用pH计测量其pH值，逐滴添加56%的甘油磷酸钠1.0ml，并不断搅拌，用饱和的磷酸氢钠溶液调节pH至6.96；
（3）将上述配置好的壳聚糖溶液置于容器中，放入39℃恒温水浴锅中加热加热3分钟，呈半流动状态，即形成温敏水凝胶。
试验例1本发明所得气管内创面修复用温敏水凝胶的抑菌性能测定：
设置四组，其中A、B、C组分别对应实施例1-3中的气管内创面修复用温敏水凝胶，D组为不含白芨的壳聚糖温敏水凝胶；
在实验条件下，将保存的大肠杆菌进行活化培养，培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，待培养基长出单个菌落后，用接种环挑取单个菌落制备大肠杆菌的菌悬液。无菌条件下，在90mm的培养基中加入适量的牛肉膏蛋白胨培养基，凝固后向培养基加入0.1ml菌悬液(107cfu/ml)，用涂布器涂布均匀。选取直径0.4cm打孔器，对凝胶样品进行打孔，制得直径0.4cm的圆柱体。在已经划好区域的培养基上，依次放置A、B、C、D，四种待测样品，待培养皿在37℃恒温培养箱中培养24h后，测量各个样品抑菌圈直径大小并记录数据。以同样的方法测试样品对金黄色葡萄球菌、肺炎球菌、绿脓杆菌的抑菌效果，同时测量各个样品抑菌圈直径大小并记录数据。
试验结果如下表所示：
表1：白芨壳聚糖基温敏水凝胶抑菌试验
通过表格1中实验组（ABC组）与空白组（D组）对照，明显看出白芨壳聚糖基温敏水凝胶对于四种菌具有较好的接触抑菌的作用，各样品与培养基的接触面均没有细菌的生长。同时发现随着白芨含量的增加，抑菌圈的直径明显的增加，可以体现抑菌的作用效果明显增强。
试验例2本发明所得气管内创面修复用温敏水凝胶的纤毛毒性实验：
2.1 蟾蜍上颚粘膜观察
本试验中，选用无纤毛毒性的生理盐水为阴性对照样品，有严重纤毛毒性的去氧胆酸钠为阳性对照品，分别评价不同浓度的试验样品的纤毛毒性；共分为5组，分别为A组（实施例1的水凝胶），B组（实施例2的水凝胶），C组（实施例3的水凝胶），D组（生理盐水组），E组（1%去氧胆酸钠组）。
将30只蟾蜍平均分成5组，将蟾蜍仰卧固定于蛙板上,使口腔张开,以止血钳牵拉,防止闭合和吞咽。分别将0.5mL水凝胶,0.5mL去氧胆酸钠应用到蟾蜍上颚部位,以生理盐水0.5mL作为对照,保留30min。用眼科小剪刀从口腔上剪下3-4 mm2粘膜,用生理盐水将表面的血液和粘液漂洗干净,并将其平铺于载玻片上,滴加生理盐水,轻轻盖上盖玻片,于10*40倍倒置显微镜下观察黏膜形态。
试验结果如附图1所示：
取下粘膜后立即在显微镜下观察，由图片1结果显示可知，生理盐水组的粘膜表面和纤毛清晰完整，纤毛活动活跃，呈流水状摆动; 1%去氧胆酸钠组纤毛停止摆动，粘膜受损严重，表面杂乱，纤毛基本脱落，只见裸露基部，周围可见很多脱落细胞; 其他药物组粘膜和纤毛较完整清晰，无脱落等异常现象，纤毛运动较活跃。
2.2纤毛持续运动时间和持续运动百分率的测定
将黏膜置于预先用少量蒸馏水饱和的层析缸中，密闭，环境温度25℃，此后每隔一定的时间取出上颚标本于图像分析系统下观察，若蟾蜍纤毛继续运动则放回层析缸中，直至纤毛运动停止。同时记录从给药开始至纤毛停止运动的时间，即蟾蜍纤毛的摆动时间（Persistent Vibration Duration,PVD）。以各给药组的PVD除以生理盐水对照组的PVD即得到纤毛持续运动的百分率（Percentage of Persistent Vibration ,PPV)。百分率越低表示药物对于纤毛的毒性越大，百分率越高则表示药物对纤毛的毒性越小。
试验结果如表2所示：
表2各组纤毛持续运动时间和持续运动百分率（x±s，n=6）
由表2可知，与生理盐水组比较，去氧胆酸钠组纤毛持续运动时间短于生理盐水组，有极显著性差异。同时给药组的纤毛持续运动时间也短于生理盐水组，但是无显著性差异，可认为给予的药物对纤毛运动无影响。用生理盐水冲洗粘膜后，除去氧胆酸钠组的纤毛之外，其余药物组纤毛均恢复摆动。此结果提示气管内创面修复用温敏水凝胶的对蟾蜍口腔黏膜纤毛运动基本没影响，因此水凝胶对蟾蜍纤毛毒性符合生物材料的安全评价标准。
2.3实验样品纤毛输送速率的测定
分组、给药同实验2.1的方法。给药5 min后在上腭靠前方部位用毛细管放置甲基红颗粒，此时颗粒将沿黏膜表面缓慢向咽部移动留下红色轨迹，用秒表记录颗粒移动1cm所需时间，每只蟾蜍测定3次，取均值后计算纤毛输送速率。
上述实验的统计学处理方法，计量资料数据以`x± s表示，应用SPSS19.0系统分析软件进行分析，采用单因素方差分析及SNK检验，P＜0.05为差异有统计意义。
试验结果如表3所示：
表3对纤毛的输送速率的影响（x±s，n=6）
如表3所示，所示各给药组与生理盐水组纤毛输送速率比较，A、B、C组（凝胶组）与生理盐水对照组无显著差异（P＜0.05），其余1%去氧胆酸钠组（E组）与生理盐水组差异有显著性（P>0.05），表明白芨壳聚糖基温敏水凝胶对于纤毛的传输速率基本没有影响。
试验例3本发明所得气管内创面修复用温敏水凝胶的细胞相容性试验：
3.1 不同白芨含量的壳聚糖基温敏水凝胶的48h的制备
各种样品水凝胶分别按照样品:细胞培养液=0.2g:1ml的比例予以浸泡48h得试验样品的浸提液，0.2um的滤膜推虑除菌，将推虑好的试验样品进行梯度稀释，依次是0倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍的样品提取液。
3.2 细胞的培养
小鼠成纤维细胞（NIH-3T3），细胞培养在添加,15％胎牛血清的DMEM培养基中，培养条件为：5％CO2、37℃、饱和湿度CO2培养箱中，采用倒置相差显微镜下观察细胞形态。
3.3 细胞存活率的测定
将处于对数生长期的细胞按4000个/孔种植到96孔板，37℃、5％CO2培养，待NIH-3T3细胞长到80％以上，除正常组外所有处理组，分别经不同浓度的分别处理细胞24h后，取出96孔板，甩出细胞培养液；每孔添加100ul,10％三氯乙酸（TCA）放置4℃恒温冰箱固定1h；甩出TCA，用超净水对每孔侧壁冲洗5遍，放烘箱37℃烘干；每孔添加50ul的0.4％SRB染料并放置摇床5min,吸出染料；1％的乙酸冲洗5遍并放置烘箱烘干；每孔添加100ul,100 mmol/LTris碱溶解；492nm处测OD吸光值。计算细胞的相对增值率（relative growth rate,RGR）*100％。
根据美国药典中细胞毒性的六级标准评价材料的毒性大小，细胞毒性反应分级如下：
表4细胞相对增值率与细胞毒性分级的关系
毒性的判定标准:0 级和Ⅰ级判为合格，Ⅱ级者结合形态分析综合评价，Ⅲ～Ⅳ级者判为不合格。
采用SPSS19.0软件包统计分析,计量资料以“`x ± s”表示，采用t检验进行统计学分析。*P＜0.05 为差异显著，**P＜0.01为差异极显著。细胞存活率 (％ )=(处理组 OD值／对照组 OD值 )X 100％，数据采用采用SPSSvl1.5软件包统计分析。
试验结果如附图2所示：
不同浓度的温敏水凝胶对NIH-3T3细胞存活率的影响如附图2所示，不同浓度稀释倍数的白芨壳聚糖基温敏水凝胶复合物以及壳聚糖温敏水凝胶的浸提液对于NIH-3T3细胞都没有表现出细胞毒性。水凝胶提取液稀释50倍，100倍对于NIH-3T3细胞的增值有着明显的促进作用（P＜0.01)。浸提液稀释5倍、10倍、20倍，对于细胞的生长基本没有影响。浸提液稀释0倍，细胞的增值率相对降低，但是对于NIH-3T3细胞造成不了毒性作用。因此水凝胶浸提液对于NIH-3T3细胞毒性符合生物材料的安全评价标准。
综上可知，本发明气管内创面修复用温敏水凝胶对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎球菌均有较好的接触抑菌作用，并且随着水凝胶中白芨含量的提高抑菌效果也随之增强，同时与壳聚糖温敏水凝胶相比其抑菌作用更强；白芨壳聚糖基温敏水凝胶和壳聚糖温敏水凝胶24h浸提液对NIH-3T3细胞均没有毒性并且有良好的细胞相容性；白芨壳聚糖基温敏水凝胶的对蟾蜍口腔黏膜纤毛运动基本没影响。因此该类温敏水凝胶可促进气管内膜损伤的修复，具有良好的抑菌作用及生物相容性，无纤毛毒性，可诱导气管内创面再生修复、预防创面感染、抑制疤痕增生、提高愈合质量、预防气管瘢痕性狭窄的发生，可用于气管内创面等内膜损伤的局部治疗，有着良好的研究应用前景。
且图3为所得温敏水凝胶相转变前后的状态图，其中a为所得温敏水凝胶相转变前；b为所得温敏水凝胶相转变后，由此可看出该温敏水凝胶可随温度的变化，发生相变，且常温状态下为流动状态，体温状态下为半流动状态。
应当指出的是，具体实施方式只是本发明比较有代表性的例子，显然本发明的技术方案不限于上述实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员，以本发明所明确公开的或根据文件的书面描述毫无异议的得到的，均应认为是本专利所要保护的范围。

Claims (7)

1.气管内创面修复用温敏水凝胶的制备方法，其特征在于，呈半流动状态，以白芨水提物、壳聚糖、甘油磷酸钠为主要原料，具体步骤如下：
（1）取白芨洗净，用纱布包好放于蒸馏水中浸泡40分钟，用电阻炉功率调制550W,大火进行性加热30分钟，后用400W功率小火继续加热，然后过滤除去滤渣，得白芨提取液备用；
（2）取壳聚糖粉碎研磨5-15分钟，置于0.1mol/L的冰乙酸中充分溶解后，加入白芨提取液，用pH计测量其pH值，逐滴添加56%的甘油磷酸钠，并不断搅拌，用饱和的磷酸氢钠溶液调节pH至6.96；
（3）将上述配置好的壳聚糖溶液置于容器中，放入恒温水浴锅中加热，待溶液呈半流动状态时，即形成温敏水凝胶。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，取下列重量份的原料，壳聚糖0.1-0.19，白芨水提物0.25-1.0，甘油磷酸钠0.5-1.5（优选为壳聚糖0.15，白芨水提物0.25，甘油磷酸钠1.0）。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）蒸馏水的用量为白芨重量的10-40倍（优选为蒸馏水的用量为白芨重量的20倍）。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）小火继续加热25-35分钟（优选的：小火继续加热30分钟）。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）冰乙酸水溶液的用量为壳聚糖质量的100倍。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）恒温水浴锅的温度为34-40℃（优选的：恒温水浴锅的温度为37℃）。
7.本温敏水凝胶可用于气管内膜损伤修复用。
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