CN103649309A - 朱栾倍半萜合酶 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的朱栾倍半萜合酶、涉及编码这种朱栾倍半萜合酶的核酸、涉及包含所述编码核酸序列的宿主细胞并涉及一种用于制备朱栾倍半萜的方法，所述方法包括在本发明的朱栾倍半萜合酶存在下使法呢基二磷酸转化成朱栾倍半萜。

Description

朱栾倍半萜合酶

本发明涉及朱栾倍半萜合酶，涉及编码所述朱栾倍半萜合酶的核酸，涉及包含所述核酸的表达载体，涉及包含所述表达载体的宿主细胞，涉及制备朱栾倍半萜的方法，并涉及制备诺卡酮的方法。

许多生物具有产生种类广泛的萜类和类萜的能力。萜类实际上或概念上从具有分子式C₅H₈的通常称作异戊二烯单位的2-甲基丁烷残基产生。可以将异戊二烯单位视为自然的共同结构单元之一。萜类的基本分子式是多个以下式：(C₅H₈)_n，其中n是连接的异戊二烯单位的数目。这称作异戊二烯规则，因此，萜类也称作类异戊二烯。异戊二烯单位可以“头对尾”连接在一起以形成线性链或它们可以排列形成环。在它们的生物合成中，萜类从统一的5碳前体异戊烯基二磷酸(IPP)及其异构体、二甲基烯丙基二磷酸盐(DMAPP)形成。因此，萜烯碳主链通常包含5个碳原子的倍数。最常见是5碳、10碳、15碳、20碳、30碳和40-碳萜类，它们分别称作半、单、倍半、双、三和四萜类。除了“头-对-尾”连接之外，三萜和四萜也在它们的中心含有一个“尾-对-尾”连接。萜类可以包含其他官能团，如醇类和它们的糖苷、醚、醛、酮、羧酸和酯。这些官能化的萜类在本文中称作类萜。如同萜类，类萜通常具有包含5个碳原子倍数的碳主链。应当指出类萜中碳的总数不需要是5的倍数，例如，该官能团可以是包含具有任何碳原子数目的烷基的酯基。

除上文给出的定义之外，重要的是指出，术语“萜烯”、“类萜”和“类异戊二烯”在开放文献以及专利文献中频繁地互换使用。

朱栾倍半萜是一种天然存在的萜烯，在特定植物如各种柑橘果实中产生。在这些植物中，在朱栾倍半萜合酶存在下，法呢基二磷酸(FPP)以酶促方式转化成朱栾倍半萜。

朱栾倍半萜例如工业上可用作香精或香料。朱栾倍半萜可以通过蒸馏从自柑橘果实所获得的柑橘精油中获得，但是从这些油中分离是繁琐的，因为这些果实中朱栾倍半萜浓度低(按重量计0.2至0.6%)。

已经提出利用通过以下方式基因修饰的微生物，以微生物方式制备朱栾倍半萜：并入编码具有朱栾倍半萜合酶活性的蛋白质的基因。因此，产生的朱栾倍半萜合酶可以用于从FPP制备朱栾倍半萜(可能作为孤立反应(体外)或作为最终导致从糖产生朱栾倍半萜的较长代谢途径的部分(体内)所执行的转化过程)。

来自柑橘的几种朱栾倍半萜合酶是已知的。例如，在US7,273,735和US 7,442,785中描述了来自葡萄柚(Citrus x paradisi)的朱栾倍半萜合酶在大肠杆菌(E.coli)中的表达。另外，来自葡萄(Vitisvinifera)的朱栾倍半萜合酶来已经由Lücker等人描述。(Phytochemistry(2004)65:2649-2659)。虽然已经描述这些朱栾倍半萜合酶在宿主生物中表达，但是实际酶活性仅在体外条件下显示。

许多论文也描述体内朱栾倍半萜合酶的活性。例如，Takahashi等人(Biotechnol.Bioeng.(2007)97:17-181)报道了葡萄柚(Citrus xparadisi)朱栾倍半萜合酶基因(登录号AF411120)在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株中的表达，其中已经通过敲除突变使ERG9基因失活(还有其它手段)将所述酿酒酵母菌株优化为关键中间体FPP的水平提高。在含有麦角甾醇以补足ERG9突变的限定成分的极限培养基中培养最佳菌株216小时导致20mg/L朱栾倍半萜的产量。Asadollahi等人(Biotechnol.Bioeng.(2008)99:666-677)描述了相当相似的朱栾倍半萜生产系统，所述系统基于在酿酒酵母菌株中表达一种葡萄柚朱栾倍半萜合酶基因(登录号CQ813508；与AF411120相比，存在3/548个氨基酸差异)，在酿酒酵母菌株中将天然ERG9启动子替换为可调节MET3启动子下调ERG9基因表达。以十二烷作为有机溶剂，采用双液相发酵培养在极限培养基中培育这个菌株，导致在60小时内形成3mg/L朱栾倍半萜。

目前已知的朱栾倍半萜合酶具有许多不同缺点，当这些合酶在从FPP制备朱栾倍半萜的工业朱栾倍半萜生产过程中或者在孤立反应中(体外)(例如使用分离的朱栾倍半萜合酶或(透化)完整细胞)或否则例如在作为最终导致从糖产生朱栾倍半萜的较长代谢途径的部分的发酵过程(体内)中应用时，这些缺点是尤其不希望的。例如，本发明人的内部研究揭示，在不同微生物(大肠杆菌、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、酿酒酵母中)过量表达活性形式来自葡萄柚的朱栾倍半萜合酶(CQ813508)或来自甜橙(Citrus sinensis)的朱栾倍半萜合酶(AF441124)带来麻烦，导致朱栾倍半萜产生速率严重受损。类似地，Asadollahi等人(Biotechnol.Bioeng.(2008)99:666-677)发现重组酿酒酵母菌株中低下的朱栾倍半萜合成由葡萄柚朱栾倍半萜合酶基因的不良异源表达引起。

另外，已经发现与来自甜橙的酶几乎相同的葡萄柚朱栾倍半萜合酶在中性或略微碱性pH处不仅催化FPP转化成朱栾倍半萜，还转化成显著量的大根香叶烯A(US 7,442,785 B2)。

将这种酶与FPP在pH7.5温育，例如，导致两种化合物形成，这两种化合物占所形成的总反应产物的超过95%、其中30%是β-榄香烯(大根香叶烯A的热重排产物)和65%是朱栾倍半萜。发明人进一步发现，还在体内条件下，显著的量的大根香叶烯A副产物由这种酶形成；培育经优化用于类异戊二烯产生并携带葡萄柚朱栾倍半萜合酶基因的类球红细菌菌株(登录号CQ813508)导致分别占所形成的倍半萜的总量48%和25%的朱栾倍半萜和大根香叶烯A形成(通过GC分析为β-榄香烯)。

葡萄的朱栾倍半萜合酶(登录号AAS66358)显示相似的特异性缺乏。在大肠杆菌中表达随后进行体外酶测定，显示这种合酶将FPP转化成(+)-朱栾倍半萜(49.5%的总产物)和(-)-7-表-α-芹子烯(35.5%的总产物)，连同5种少量产物(Lücker等人,Phytochemistry(2004)65:2649-2659)。

除了具有生物化学证明过的朱栾倍半萜合酶活性的以上酶之外，GenBank核酸序列数据库仍含有注释为朱栾倍半萜合酶的另一个条目，即紫苏原变种朱栾倍半萜合酶基因(登录号AY917195)。然而，在文献中，尚无关于这种特定推定性朱栾倍半萜合酶的报道，因此缺少其活性和特异性的生物化学证据。

因而，需要可以在制备朱栾倍半萜中使用的另一种朱栾倍半萜合酶。具体而言，需要另一种朱栾倍半萜合酶，所述酶显示改善的表达，至少在选择的宿主细胞中如此；另一种朱栾倍半萜合酶，所述酶至少在特定条件下如在中性或碱性pH和/或在已经产生该酶的细胞中胞内具有高度酶活性；和/或另一种朱栾倍半萜合酶，就催化FPP转化成朱栾倍半萜而言，所述酶至少在特定条件下如在大致中性或在碱性pH和/或在已经产生该酶的细胞中胞内至少是高度特异的，尤其与来自葡萄柚的朱栾倍半萜合酶相比具有改善的特异性。

已经发现一种迄今未知的特定多肽具有朱栾倍半萜合酶活性并且可以使用这种多肽作为可以充当已知朱栾倍半萜合酶类的替代物的催化剂。具体地，就催化FPP转化成朱栾倍半萜而言，与来自葡萄柚的朱栾倍半萜合酶相比，这种酶具有改善的特异性和/或生产率。

因此，在一个方面，本发明涉及包含如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的朱栾倍半萜合酶或其功能同源物，所述功能同源物是包含下述氨基酸序列的朱栾倍半萜合酶，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2具有至少40%、优选地至少50%的序列同一性。所述同源物可以特别地是包含下述氨基酸序列的朱栾倍半萜合酶，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2具有至少55%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列同一性。

发明人进一步发现，可以提供与具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的朱栾倍半萜合酶相比，具有改善的法呢基二磷酸转化成朱栾倍半萜的生产率的朱栾倍半萜合酶。

因此，本发明特别地涉及与SEQ ID NO:2代表的朱栾倍半萜合酶相比，具有增加的法呢基二磷酸转化成朱栾倍半萜的生产率(表示为测试条件下每小时形成的朱栾倍半萜的摩尔量)的朱栾倍半萜合酶。

另外，本发明特别地涉及包含SEQ ID NO:3代表的氨基酸序列的朱栾倍半萜合酶，条件是SEQ ID NO:3中至少一个标注为′X′的位置与SEQ ID NO:2中的相应位置不同。在一个优选实施方案中，所述朱栾倍半萜合酶包含如SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列，条件是与SEQ ID NO:2相比，这种序列包含在氨基酸序列中的至少一个差异。

另外，本发明涉及对本发明的朱栾倍半萜合酶具有特异性结合亲和力的抗体。本发明的抗体因此与本发明的朱栾倍半萜合酶特异性结合。

另外，本发明涉及与抗体显示免疫交叉反应性的蛋白质，所述抗体针对本发明朱栾倍半萜合酶的片段产生，特别地，这种蛋白质具有朱栾倍半萜合酶活性。

该免疫交叉反应性可以使用抗体测定，所述抗体针对具有朱栾倍半萜合酶活性的本发明分离多肽的至少一个表位产生或与之反应。可以通过本领域已知的方法产生抗体(其可以是单克隆或多克隆的)，例如，如Hudson等人,Practical Immunology,第3版(1989),Blackwell Scientific Publications描述。免疫化学交叉反应性可以使用本领域已知的测定法确定，一个例子是蛋白质印迹法，例如，如Hudson等人,Practical Immunology,第3版(1989),BlackwellScientific Publications中描述。

本发明还涉及一种核酸，其包含编码本发明朱栾倍半萜合酶的核酸序列、特别地编码包含如SEQ ID NO:2、3或4中所示的氨基酸序列的朱栾倍半萜合酶或其功能同源物的核酸序列，或包含与所述编码序列互补的核酸序列。具体而言，该核酸可以选自包含如SEQ ID NO:1中所示核酸序列的核酸，和编码本发明朱栾倍半萜合酶的其他核酸序列，所述其他序列包含与SEQ ID NO:1中所示的核酸序列具有至少50%、特别地至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的核酸序列，或编码包含如SEQ ID NO:3或4中所示序列的朱栾倍半萜合酶的核酸序列，分别地与之互补的核酸。所述编码本发明朱栾倍半萜合酶的其他核酸序列可以在下文中称作功能性类似物。

本发明还涉及一种核酸，其包含编码本发明朱栾倍半萜合酶的核酸序列，所述核酸序列在低严格性条件下、优选地在中等严格性条件下、更优选地在高严格性条件下并且最优选地在极高严格性条件下与SEQ ID NO:1中所示的核酸序列杂交，或编码如SEQ IDNO:3或4中所示的氨基酸序列的核酸序列，分别地与之互补的核酸。

杂交实验可以通过多种方法进行，所述方法是技术人员完全可获得的。用于这些多种方法当中选择的一般指导原则可以在例如Sambrook,J.和Russell,D.W.Molecular Cloning:A LaboratoryManual.第3版,Cold Spring Harbour Laboratory Press,ColdSpring Harbour,NY,(2001)中找到。

杂交条件的严格性意指这样的条件，在所述条件下进行由实际杂交和洗涤步骤组成的杂交。洗涤步骤用来洗去与固定在例如硝酸纤维素滤膜上的靶核酸不杂交的核酸。可以例如通过改变洗涤溶液的盐浓度和/或通过改变进行洗涤步骤的温度(洗涤温度)，改变杂交条件的严格性。通过降低洗涤溶液中的盐浓度或通过升高洗涤温度增加杂交的严格性。出于这种应用目的，低、中等、高和极高严格性条件尤其是以下条件及其等同物：杂交在约45℃于包含6X SSC(20X SSC母液是在水中的3.0M NaCl和0.3M柠檬酸三钠)、5XDenhardt试剂(100X Denhardt试剂是在水中的2%(w/v)BSA第V级分、20%(w/v)Ficoll400和2%(w/v)聚乙烯吡咯烷酮)，0.5%(w/v)SDS和100μg/mL变性、片段化鲑精DNA的水溶液中进行约12小时。通过在室温于2X SSC，0.1%(w/v)SDS中两个连续5分钟洗涤步骤移除未结合的核酸探针后，在室温于0.2X SSC，0.1%(w/v)SDS中执行两个连续5分钟洗涤步骤是低严格性的例子，在42℃于0.2XSSC，0.1%(w/v)SDS中执行两个连续15分钟洗涤步骤是中等严格性的例子，在55℃于0.1X SSC，0.1%(w/v)SDS中执行两个连续15分钟洗涤步骤是高严格性的例子，并且在68℃于0.1X SSC，0.1%(w/v)SDS中执行两个连续30分钟洗涤步骤是高严格性的例子。

本发明的朱栾倍半萜合酶或核酸可以是天然化合物或从其天然来源分离的化合物的片段，是化学或酶促合成的化合物或化合物片段或重组细胞中产生的化合物或化合物片段，在所述重组细胞中可以存在所述化合物或从所述细胞中可以已经分离所述化合物。

本发明还涉及包含本发明核酸的表达载体。

本发明还涉及包含本发明表达载体的宿主细胞。

本发明还涉及一种用于制备朱栾倍半萜的方法，包括在本发明的朱栾倍半萜合酶存在下使FPP转化成朱栾倍半萜。可能存在FPP的4种不同几何异构体，即2E,6E-FPP、2Z,6E-FPP、2E,6Z-FPP和2Z,6Z-FPP。良好结果已经用2E,6E-FPP获得，虽然原则上，FPP的任何其他异构体可以是本发明酶的合适底物。

本发明还涉及一种用于制备诺卡酮的方法，其中将本发明方法中所制备的朱栾倍半萜转化成诺卡酮。

本发明是还涉及一种用于产生本发明朱栾倍半萜合酶的方法，所述方法包括有利于产生朱栾倍半萜合酶和从宿主细胞回收朱栾倍半萜合酶的条件下培养本发明的宿主细胞。

根据本发明，已经发现可能使得朱栾倍半萜合酶在不同生物中以良好产率表达。已经发现朱栾倍半萜合酶(由序列ID NO:2代表)在大肠杆菌中和在酿酒酵母(面包酵母)中良好表达。另外，已经发现在产生类异戊二烯的宿主生物(类球红细菌)中表达本发明朱栾倍半萜合酶的本发明方法中，朱栾倍半萜产量高于其中表达柑橘朱栾倍半萜合酶的对比方法。

就根据SEQ ID NO:2的朱栾倍半萜合酶而言，已经发现它比来自柑橘的朱栾倍半萜合酶对朱栾倍半萜合成更特异，特别地在大约中性pH或在宿主细胞中胞内合成朱栾倍半萜的体外测定法是这样，其中所述宿主细胞经基因修饰以分别产生本发明的朱栾倍半萜合酶和柑橘朱栾倍半萜合酶。初步结果显示在相同条件下，随本发明新酶形成的主要副产物的量(大根香叶烯A)显著较低，即采用柑橘朱栾倍半萜合酶时2:1的摩尔比相比，朱栾倍半萜:大根香叶烯A的摩尔比是4:1。不受理论约束，认为对于胞内制备朱栾倍半萜的方法，指向在中性或略微碱性pH催化朱栾倍半萜合成的高特异性特别被视为合乎需要，因为认为各种宿主细胞具有中性或略微碱性的胞内pH，如7.0-8.5的pH(对于细菌的胞内pH值，见例如：Booth,Microbiological Reviews(1985)49:359-378)。例如当大肠杆菌细胞暴露于范围从5.5至8.0的pH值时，胞内pH在7.1和7.9之间(Olsen等人,Appl.Environ.Microbiol.(2002)68:4145-4147)。这可以解释指向本发明朱栾倍半萜合酶的朱栾倍半萜合成(也是胞内方式)的改进特异性。

本发明朱栾倍半萜合酶的生产率可以是SEQ ID NO:2代表的朱栾倍半萜合酶的生产率的至少1.1倍、至少1.5倍、至少2.0倍或至少2.5倍。这种生产率可以是至多到100倍更高或甚至更多倍。在一个具体实施方案中，生产率是至多到10倍更高，特别地至多到5倍更高，更特别地至多到4倍更高。

与SEQ ID NO:2代表的朱栾倍半萜合酶相比，与根据SEQ IDNO:2的朱栾倍半萜合酶相比生产率增加的本发明朱栾倍半萜合酶可以特别地具有增加的比生产率、增加的稳定性(降低的酶失活速率)、增加的产物特异性(相对于法呢基二磷酸转化成大根香叶烯A)或宿主细胞中增加的表达。

与根据SEQ ID NO:2的朱栾倍半萜合酶相比生产率增加的朱栾倍半萜合酶通常具有与根据SEQ ID NO:2的朱栾倍半萜合酶约相同或较之更高的比生产率，所述比生产率表示为每小时每份量的酶形成的朱栾倍半萜的摩尔量。优选地，该比生产率是根据SEQ IDNO:2的朱栾倍半萜合酶的比生产率的至少1.1倍、更优选地至少1.5倍、特别地至少2.0倍、更特别地至少2.5倍。上限不是关键的。生产率增加的朱栾倍半萜合酶的比生产率可以是SEQ ID NO:2的朱栾倍半萜合酶的比生产率至多到100倍，但是它可以更高。在一个具体实施方案中，该比生产率是SEQ ID NO:2代表的朱栾倍半萜合酶的比生产率的至多到10倍，特别地5倍或更少，更特别地4倍或更少。

产物特异性，其表示为从法呢基二磷酸形成的朱栾倍半萜对从法呢基二磷酸形成的大根香叶烯的摩尔比(在本文规定的测试条件下)，通常是6或更优选地是10或更大，更优选地是至少13，特别地是至少15。产物特异性可以是至多到1000，不过它可以高于1000。在一个具体实施方案中，产物特异性是100或更小，特别地30或更小，更特别地25或更小，或22或更小。

如本文所用，“生产率”定义为每单位时间(更具体地每小时)从底物(更具体地法呢基二磷酸)中形成的反应产物(更具体地朱栾倍半萜)的摩尔量。本发明的朱栾倍半萜合酶的′生产率′在充分可控的标准条件下、优选地在体外测定法中测定，如实施例2中所述。为此目的，将本发明的朱栾倍半萜合酶在30℃与过量的法呢基二磷酸温育并且在pH 7.0-7.5缓冲2小时，此后通过用乙酸乙酯提取终止反应。因为朱栾倍半萜合酶以澄清的裂解物形式测定，所以添加原钒酸钠以抑制磷酸化并因此阻止不希望的法呢基二磷酸水解。选择实施例2中所示的反应条件(包括澄清的裂解物的量、法呢基二磷酸的量和反应时间)，从而所形成的产物的量是仍线性地依赖于裂解物的量。

如本文所用，朱栾倍半萜生产的“比生产率”定义为每份量的朱栾倍半萜合酶每单位时间(小时)从底物法呢基二磷酸中形成的朱栾倍半萜的摩尔量。其因此是每份量的朱栾倍半萜合酶的如上文定义的“生产率”，并且因此意在补偿用来测定“生产率”的酶制备物中存在的不同量的朱栾倍半萜合酶。在测定纯的朱栾倍半萜合酶制备物，标准总蛋白定量方法(例如Bradford法[Bradford M.M,Anal.Biochem.1976,72:248-254])可以用来将朱栾倍半萜合酶的量定量。在朱栾倍半萜生产率测定中使用非纯朱栾倍半萜合酶制备物的情况下，必须应用将朱栾倍半萜合酶与制备物中存在的其他蛋白质区分的方法。实施例2描述这种方法，该方法基于在SDS-PAGE凝胶上分离蛋白质，与通过采用荧光染料将蛋白质条带染色、随后将其成像而对它们定量相组合。

如本文所用，“稳定性”定义为“操作稳定性”，表示朱栾倍半萜合酶在所应用的使底物法呢基二磷酸转化成反应产物朱栾倍半萜的条件下的稳定性。因为在实施例2中描述的′生产率′测定法中使用2小时的反应时间，所以这种方法也内在地决定在应用的体外条件下本发明朱栾倍半萜合酶的可操作稳定性，因为不稳定的酶将比更稳定的酶更快停止作用，并且因此将导致较少的产物形成和因此降低的生产率。

如本文所用，“产物特异性”定义为朱栾倍半萜对实施例2中描述的标准生产率测定法中从法呢基二磷酸形成的大根香叶烯A的摩尔比。在本发明的朱栾倍半萜合酶将产生显著量的其他倍半萜样副产物的情况下，“产物特异性”定义为朱栾倍半萜对实施例2中描述的标准生产率测定法中从法呢基二磷酸形成的其他倍半萜类总数的摩尔比。

如本文所用，“在宿主细胞中的表达”定义为相对于特定宿主细胞中所形成的蛋白质的总量，在这种宿主细胞中形成的本发明的朱栾倍半萜合酶的量。通常用于确定特定蛋白质的表达水平的方法基于在SDS-PAGE凝胶上分离(例如在澄清的裂解物中)存在的全部蛋白质，随后对它们染色并后续定量。表达水平(以%计)则定义为与凝胶上全部条带的强度的总和相比，属于目的蛋白的条带的相对强度乘以100%。

因为以下事实：本发明的朱栾倍半萜合酶作为澄清的裂解物分析，所以“比生产率”和“在宿主细胞中的表达”均相对于一种标准蛋白即SEQ ID NO:2的朱栾倍半萜合酶来确定。

除非另外指出，否则如本文所用的术语“或”定义为“和/或”。

除非另外指出，否则如本文所用的术语“a(一个)”或“an(一种)”定义为“至少一个”。

当提到单数的名词时(例如，一种化合物、一种添加物等)，意在包括复数。

如本文可互换使用的术语法呢基二磷酸和法呢基焦磷酸(均缩写为FPP)指化合物3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯-1-基焦磷酸并且包括这种化合物的全部已知异构体。

关于重组细胞、载体、核酸等，如本文所用的术语“重组”指这样的细胞、载体、核酸等，它含有在该细胞、载体、核酸中不天然存在和/或在这个相同位置不天然存在的核酸。通常，已经使用重组DNA技术将所述核酸引入菌株(细胞)。

当关于核酸(DNA或RNA)或蛋白质使用时，术语“异源”指这样的核酸或蛋白质，它不天然地作为其中存在所述核酸或蛋白质的生物、细胞、基因组或DNA或RNA序列的部分存在，或不同于它在自然界被发现的细胞或者基因组或DNA或RNA序列中的一个位置或多个位置存在。异源核酸或蛋白质相对于引入它们的细胞不是内源的，但是已经从另一种细胞获得或合成地或重组地生产。通常，但不是必需地，这类核酸编码了其中表达DNA的细胞正常情况下不产生的蛋白质。

下述基因也称作异源的，其中所述基因相对于特定宿主细胞是内源，但是已经距其天然形式受到修饰，例如利用DNA改组受到修饰。术语“异源”也包括天然存在DNA序列的非天然存在的多个副本。因而，术语“异源“可以指这样的DNA区段，它相对于细胞是外来或异源的，或者与该细胞同源，但是在宿主细胞内部处于其中所述区段通常不存在的位置和/或数目。表达外源DNA区段以产生外源多肽。“同源”DNA序列是与向其中引入它的宿主细胞天然结合的DNA序列。

本文中术语“异源核酸或蛋白质”包括本领域技术人员将相对于其表达该核酸或蛋白质的细胞而视为异源或外来的任何核酸或蛋白质。

与另一种蛋白质或肽(尤其与SEQ ID NO:2中所示序列内的氨基酸组成的多肽相比)相比，如本文中关于蛋白质或多肽所用，术语“修饰的”、“修饰”、“突变的”、“突变”或“变体”用来表示修饰的蛋白质或多肽与进行比较的蛋白质或多肽(如野生型蛋白质/多肽)相比在氨基酸序列中具有至少一个差异。无论是否实际上已经通过诱变编码这些氨基酸的核酸或修饰多肽/蛋白质或以另一种方式(例如使用人工基因-合成方法)获得修饰的/突变的蛋白质，均使用这些术语。诱变是本领域熟知的方法，并且包括，例如，借助PCR或通过寡核苷酸介导诱变的位点定向诱变，如Sambrook,J.和Russell,D.W.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第3版,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,(2001)中所述。如本文中关于基因所用，术语“修饰的”、“修饰”、“突变的”、“突变”或“变体”用来表示在该基因或其调节序列的核苷酸序列中至少一个核苷酸与进行比较的核苷酸序列(例如野生型核苷酸序列，如SEQ ID NO:1)不同。无论是否实际上已经诱变获得修饰的/突变的核苷酸序列，均使用这些术语。

修饰/突变可以特别地是一个氨基酸或核苷酸分别由一个不同氨基酸或核苷酸替换、缺失氨基酸或核苷酸或插入氨基酸或核苷酸。

术语“可读框”和“ORF”指在编码序列的翻译起始和终止密码子之间编码的氨基酸序列。术语“起始密码子”和“终止密码子”指编码序列中分别规定蛋白质合成的起始和链终止(mRNA翻译)的三个相邻核苷酸单位(′密码子′)。

术语“基因”广泛地用来指与生物学功能相关的任何核酸区段。因而，基因包括编码序列和/或为表达它们所需要的调节序列。例如，基因指表达mRNA或功能性RNA或编码特定蛋白质并包含调节序列的核酸片段。基因也包括例如形成其他蛋白质的识别序列的不表达的DNA区段。基因可以从多种来源获得，包括从目的来源克隆或从已知或预测的序列信息合成，并且可以包括经设计以具有所需参数的序列。

术语“嵌合基因”指任何基因含有1)DNA序列，包括自然界中不存在的调节序列和编码序列，或2)编码不天然连接的蛋白质部分的序列，或3)不天然连接的启动子的部分。因此，嵌合基因可以包含源自不同来源的调节序列和编码序列，或包含源自相同来源，但是以不同于自然界中存在的方式排列的调节序列和编码序列。

对于如本文所用的转基因细胞或生物，术语“转基因”指含有核酸的生物或细胞(所述细胞可以是生物本身或从中已经分离出该细胞的多细胞生物的细胞)，所述核酸在该生物或细胞中不天然存在并且已经使用重组DNA技术向该生物或细胞中引入(即已经在生物或细胞本身中或在该生物的祖先中或已经分离出该细胞的生物的祖先生物中引入)。

“转基因”指已经通过转化引入基因组中并且优选地稳定维持的基因。转基因可以例如包括与待转化的特定植物的基因异源或同源的基因。另外，转基因可以包括插入非天然生物中的天然基因或包括嵌合基因。术语“内源基因”指在生物基因组中其天然位置内的天然基因。“外来基因”指正常情况下不存在于宿主生物中，但通过基因转移引入的基因。

如本文所用，“转化”(transformation和transforming)指将异源核苷酸序列引入宿主细胞中，无论为插入所用的方法是什么，例如，直接摄入、转导、接合、f-交配或电穿孔。外源多核苷酸可以作为非整合型载体(例如，质粒)维持，或可选地，可以整合至宿主细胞基因组中。

“编码序列”指编码特定氨基酸序列并排除非编码序列的DNA或RNA序列。它可以构成“不间断的编码序列”，包括缺少内含子，如在cDNA中那样，或它可以包含由适宜剪接交界界定的一个或多个内含子。“内含子”是含于初级转录物内但是在细胞内部经切割而移除并且RNA再连接以产生可以翻译成蛋白质的成熟mRNA的RNA序列。

“调节序列”指位于编码序列上游(5′非编码序列)、内部或下游(3′非编码序列)并影响所结合的编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译的核苷酸序列。调节序列包括增强子、启动子、翻译前导序列序列、内含子和多聚腺苷化信号序列。它们包括天然和合成性序列以及可以作为合成序列和天然序列组合的序列。如上文所示，术语“合适的调节序列”不限于启动子。

调节序列的例子包括启动子(如转录启动子、组成型启动子、诱导型启动子)、操纵基因、或增强子、mRNA核糖体结合位点，和控制转录及翻译起始与终止的适宜序列。当调节序列功能地与本发明的DNA或cDNA序列相关时，核酸序列“可操作地连接”。

每个调节序列可以独立地选自异源和同源调节序列。

“启动子”指核苷酸序列，通常在其编码序列上游(5′)，其中所述核苷酸序列通过为正确转录所需的RNA聚合酶和其他因子提供识别，控制所述编码序列的表达。“启动子”包括最小启动子，它是由TATA框和起到规定转录启动位点的其他序列组成的短DNA序列，向其添加调节元件以控制表达。“启动子”也指核苷酸序列，其包括最小启动子外加能够控制编码序列或功能性RNA表达的调节元件。这种类型的启动子序列由近端上游元件和更远的上游元件组成，后一类元件经常称作增强子。因此，“增强子”是这样的DNA序列，该序列可以刺激启动子活性并且可以是该启动子的固有元件或经插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件。它能够以两种取向(正常或反转)工作，并且甚至从启动子上游或下游被移动的情况下也能够发挥作用。增强子和其他上游启动子元件均结合介导它们作用的序列特异性DNA结合蛋白。启动子可以完全源自天然基因，或由不同的元件组成，源自自然界中存在的不同启动子，或甚至由合成性DNA区段组成。启动子也可以含有参与结合蛋白质因子的DNA序列，所述蛋白质因子控制响应于生理或发育状况时转录起始的有效性。

如本文所用，术语“核酸”包括对脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物的称谓，即，处于单链或双链形式的多核苷酸，并且除非另外限制，否则涵盖具有天然核苷酸实质特性的已知类似物，在于它们以类似于天然存在核苷酸的方式与单链核酸杂交(例如，肽核酸)。多核苷酸可以是天然或异源结构基因或调节基因的全长或子序列。除非另外说明，该包括指定序列以及其互补序列。因而，为稳定性或出于其他原因而修饰主链的DNA或RNA主链修饰是本文如该术语意指的“多核苷酸”。另外，包含稀有碱基(如肌苷)或修饰碱基(如三苯甲基化碱基)的DNA或RNA(仅提到两个实例)是如该术语在此使用的“多核苷酸”。可以理解已经对DNA和RNA进行种类多样的修饰，这些修饰起到本领域技术人员已知的许多有用目的。如本文中使用的术语“多核苷酸”包括这类化学、酶促或代谢修饰形式的多核苷酸，以及作为病毒和细胞(包括简单细胞和复杂细胞，这仅为其中之一)之特征的DNA和RNA的化学形式。

通过参考遗传密码，本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了每种可能的核酸沉默变异。术语“保守性修饰的变体”适用于氨基酸序列和核酸序列。就特定核酸序列而言，术语“保守性修饰的变体”指因遗传密码简并性而编码相同变体或保守修饰变体的那些核酸。术语“遗传密码的简并性”指众多功能上相同的核酸编码任一给定蛋白质的事实。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因而，在其中丙氨酸由某个密码子指定的每个位置，可以将该密码子变成任一个所述的相应密码子，而不改变编码的多肽。这类核酸变异是“沉默性变异”并且代表一个种类的保守性修饰的变异。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在此互换地使用来指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在氨基酸的人造化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。天然存在氨基酸的此类类似物的本质特性是当掺入蛋白质中时，该蛋白质与针对同一蛋白质所激发的、但完全由天然存在氨基酸组成的抗体发生特异性反应。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”也包括修饰，包括但不限于糖基化、脂质附着、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟基化和ADP-核糖基化。

在本申请的情境内，将低聚物(如寡核苷酸，寡肽)视为聚合物群组的一个种类。低聚物具有相对低的单体单位数目，一般2-100个，特别地6-100个。

如本文中所用的“表达盒”意指能够指导特定核苷酸序列在适宜宿主细胞中表达的DNA序列，其包含与目的核苷酸序列可操作地连接的启动子，其中所述的目的核苷酸序列与终止信号可操作地连接。该DNA序列一般还包含为正确翻译所述核苷酸序列所需的序列。编码区通常编码目的蛋白，但也可以按有义方向或反义方向编码功能性目的RNA，例如反义RNA或非翻译的RNA。包含目的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，这意指该表达盒的至少一个组分相对于该表达盒的其他组分至少之一是异源的。该表达盒也可以是天然存在的、但已经以可用于异源表达的重组形式获得的表达构建体。该表达盒中的核苷酸序列的表达可以处于组成型启动子或处于仅在宿主细胞暴露于一些特定外部刺激时才启动转录的诱导型启动子的控制下。在多细胞生物的情况下，该启动子也可以是针对特定组织或器官或发育阶段特异的。

如本文所用的术语“载体”指由经设计旨在直接转化所靶向细胞的遗传物质组成的结构。载体含有按位置和顺序取向，即与其他必需元件可操作地连接的多个遗传元件，从而，核酸盒中的核酸可以转录并且当需要时，在转化的细胞中翻译。

具体而言，载体可以选自病毒载体、(细菌)噬菌体、粘粒或质粒。载体也可以酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或农杆菌双元载体。载体可以处于双链或单链线性或环状形式，所述形式可以是或可以不是自我传播或移动的，并且可以通过整合至细胞基因组而转化原核或真核宿主生物或者在染色体外存在(例如带有复制起点的自主复制型质粒)。具体而言，包括穿梭载体，其意指天然能够或通过设计能够在两种不同的宿主生物中复制的DNA载体，可以选自放线菌和相关物种、细菌和真核(例如高等植物、哺乳动物、酵母或真菌)细胞。优选地，载体中的核酸处在用于宿主细胞(如微生物细胞例如细菌细胞或植物细胞)中转录的适宜启动子或其他调节元件控制下并可操作地与之连接。载体可以是在多种宿主中发挥作用的双功能表达载体。在基因组DNA的情况下，这可以含有其自身的启动子或其他调节元件，并且在cDNA的情况下，这种可以处在用于宿主细胞中表达的适宜启动子或其他调节元件控制下。

含有本发明核酸的载体可以基于本领域本身已知的方法学制备。例如，可以利用与合适调节元件，如转录性或翻译性调节核酸序列可操作地连接的编码本发明多肽的cDNA序列。

如本文所用，术语“载体”包括用于标准克隆工作的载体(“克隆载体”)以及更专用类型的载体，如(常染色体)表达载体和用于整合至宿主细胞染色体中的克隆载体(“整合载体”)。

“克隆载体”通常含有一个或少数限制性核酸内切酶识别位点，其中外来DNA序列可以在所述识别位点处按可确定方式插入，而载体的基本生物学功能不丧失，以及适于鉴定和选择用克隆载体转化的细胞的标记基因。

术语“表达载体”指线型或环状DNA分子，其包含编码目的多肽的区段，所述区段处在引起其转录的额外核酸区段控制下(即与之可操作地连接)。这类额外区段可以包括启动子序列和终止子序列，并且可以任选地包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、多聚腺苷化信号等。表达载体通常源自质粒或病毒DNA，或可以含有二者的元件。具体而言，表达载体包含一种核苷酸序列，其以5′至3′方向包含以下对象并与之可操作地连接：(a)由宿主生物识别的转录和翻译起始区域，(b)目的多肽的编码序列，和(c)由宿主生物识别的转录及翻译终止区。“质粒”指不整合至微生物的基因组中并且在自然下通常为环状的自主复制型染色体外DNA。

“整合载体”指线型或环状的DNA分子，所述DNA分子可以并入微生物的基因组中并且提供编码目的多肽的基因的稳定遗传。整合载体通常包含一个或多个包含基因序列的区段，所述基因序列编码目的多肽的区段，所述区段处在引起其转录的额外核酸区段控制下(即与之可操作地连接)。这类额外区段可以包括启动子序列和终止子序列，和驱动目的基因(通常借助同源重组过程)并入靶细胞的基因组中的一个或多个区段。通常，整合载体将可以转移入靶细胞中但是具有在该生物中无功能的复制子的一种载体。如果在包含目的基因的区段内部包含适宜的标记，可以选择该区段的整合。

如本文中所用，术语“可操作地连接”或“有效地连接”并列指其中如此所述的组件处在允许它们以其预期方式发挥功能的关系。与另一个控制序列和/或与编码序列“可操作地连接”的控制序列以这样的方式连接，从而在与所述控制序列相容的条件下实现编码序列的转录和/或表达。通常，可操作地连接意指连接的核酸序列是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，是连续并且处于相同的可读框中。

术语“朱栾倍半萜合酶”在本文用于具有从法呢基二磷酸形成朱栾倍半萜的催化活性的多肽，并且用于包含这种多肽的其他部分。这类其他部分的例子包括所述多肽与一种或多种其他多肽的复合物、所述多肽的其他复合物(例如金属蛋白复合物)、包含所述多肽和另一个有机部分的大分子化合物，所述多肽与支撑材料结合等。可以在其天然环境中提供，即在已经产生该酶的细胞内部朱栾倍半萜合酶，或在该酶已经由产生它的细胞分泌的培养基中提供。它也可以与已经产生该多肽的来源无关提供并且可以通过与载体连接、用标记部分标记等进行操作。

如本文所用，术语序列的“功能同源物”或简称做“同源物”指包含所述特定序列的多肽，条件是一个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入，并且所述多肽(定性地)具有用于底物转化的相同酶促功能性，即，具有序列SEQ ID NO:2的同源物具有从法呢基二磷酸形成朱栾倍半萜的催化活性。在实施例2中，描述了一项试验，所述试验适于验证多肽或包含多肽的部分是否具有从法呢基二磷酸形成朱栾倍半萜的催化活性(“确定朱栾倍半萜合酶突变体的(比)生产率和产物特异性”)。另外，技术人员认识到由本发明包括的等同核苷酸序列也可以由它们在低、中等和/或严格条件下与处于本权利要求书字面范围内的核苷酸序列杂交的能力定义。

本发明的优选朱栾倍半萜合酶具有催化朱栾倍半萜形成的特异，其表示为当使用下文在实施例2中描述的“确定朱栾倍半萜合酶突变体的(比)生产率和产物特异性”试验，在pH7测定时(使用含有本发明朱栾倍半萜合酶的澄清裂解物；然而，相同的试验设置也可以在使用纯化的多肽时适用)，朱栾倍半萜对大根香叶烯A的摩尔比(已知的副产物，在已知的朱栾倍半萜合酶催化反应中形成)是至少3:1、特别地是至少4:1。所述比率可以是无限的(1:0；即无可检测量的大根香叶烯A形成)，或至多到100:1，或至多到10:1或至多到5:1。

序列同一性、同源性或相似性在本文中定义为两个或多个多肽序列或两个或多个核酸序列之间的关系，如通过比较这些序列所确定。通常，序列同一性或相似性在序列的整个长度范围内比较，然而，但是也可以仅对彼此对齐的序列部分比较。在本领域，“同一性”或“相似性”也意指多肽序列或核酸序列之间相关性的程度，根据具体情况，如由此类序列之间的匹配所决定。如本文所用的序列同一性是如通过EMBOSS配对比对算法“Needle”所确定的值。具体而言，可以使用来自EMBOSS软件包的NEEDLE程序(2.8.0或更高版本，EMBOSS:The European Molecular BiologyOpen Software Suite-Rice,P.等人,Trends in Genetics(2000)16:276-277；http://emboss.bioinformation.nl/)，使用计算“最长同一性”的NOBRIEF选项(与NO的‘简洁同一性和相似性’)。

两个比对序列之间的同一性、同源性或相似性计算如下：在扣除比对结果中空位总数后，比对结果中显示两个序列内相同氨基酸的相应位置数目除以比对的总长度。对于氨基酸序列的比对，默认参数是：矩阵=Blosum 62；开放空位罚分=10.0；空位延伸罚分=0.5。对于核酸序列的比对，默认参数是：基质=全DNA；开放空位罚分=10.0；空位延伸罚分=0.5。在现有的SEQ ID NO:2的朱栾倍半萜合酶或SEQ ID NO:1的核酸和所述朱栾倍半萜合酶的功能同源物之间的不一致性可能特别是修饰的结果，其中通过本领域技术人员已知的生物技术如例如分子进化或理性设计或通过使用本领域已知的诱变技术(随机诱变、位点定向诱变、定向进化、基因重组等)进行所示修饰，例如以改善朱栾倍半萜合酶或核酸的特性(例如改善的表达)。分别与SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:1的序列相比，朱栾倍半萜合酶的或核酸的序列可以因一个或多个天然存在的变异而改变。这类天然修饰/变异的例子是糖基化(更广泛地定义为“翻译后修饰”)差异、归因于可变剪接的差异和单核酸多态性(SNP)。核酸可以被修饰，从而它编码与SEQ ID NO:2的多肽差异至少一个氨基酸的多肽，从而它编码与SEQ ID NO:2相比包含一个或多个氨基酸置换、缺失和/或插入的多肽，所述示多肽仍具有朱栾倍半萜合酶活性。另外，可以利用人工基因合成法(合成DNA)。另外，可以利用密码子优化或密码子对优化，例如基于如WO 2008/000632中所述的或如商业DNA合成公司DNA2.0、Geneart和GenScript所提供的方法。

编码不与本发明多肽天然连接的适宜信号肽的一种或多种核酸序列可以并入(表达)载体中。例如，信号肽前导序列的DNA序列可以与本发明的核酸序列符合可读框地融合，从而本发明的多肽最初翻译为包含该信号肽的融合蛋白。取决于信号肽的性质，将差异性地导引表达的多肽。在预期宿主细胞中有功能的分泌信号肽例如增强所表达多肽的细胞外分泌。其他信号肽指引表达的多肽至某些细胞器，如叶绿体、线粒体和过氧化物酶体。当转运至预期细胞器或从细胞转运时，信号肽可以从多肽中切除。可以在SEQ ID NO:2的多肽或其同源物的氨基端或羧基端提供额外肽序列的融合。

发明人已经发现本发明的多种朱栾倍半萜合酶，它们与SEQ IDNO:2的朱栾倍半萜合酶不同并且具有增加的生产率。本发明的朱栾倍半萜合酶可以不同在于它仅在一个氨基酸位置含有修饰或在于它含有两个或更多个修饰。一个或多个修饰可以特别地是一个或多个置换。也可能是不存在一个或多个氨基酸。例如，SEQ ID NO:2的位置1-15或位置1-16的一个或多个氨基酸可以不存在(残基编号始于该多肽的NH2端)。

与SEQ ID NO:2的朱栾倍半萜合酶相比，生产率增加的朱栾倍半萜合酶，特别地SEQ ID NO:2的朱栾倍半萜合酶功能同源物，可以在朱栾倍半萜合酶的多个位置处包含修饰。一个修饰可以在朱栾倍半萜合酶的第一壳(shell)位置处或在朱栾倍半萜合酶的第二壳位置处或在朱栾倍半萜合酶的更远部分中(相对于底物结合位点)存在。术语“第一壳”和“第二壳”位置通常是本领域已知的。

具体而言，使用SEQ ID NO:2的模型结构，可以确定某个氨基酸是否形成朱栾倍半萜合酶的第一壳、第二壳或更远部分的部分。这种模型结构以分子建模软件包YASARA Structure第11.2.18版；http//www.yasara.org/)(YASARA模型)可获得的同源性建模惯例制备。建模中使用的模板是与(2-顺,6-反)-2-氟法呢基二磷酸(2F-FPP)复合的普通烟草(Nicotiana tabacum)5-表-马兜铃烯合酶的结构，如已经由Noel J.P.等人,ACS Chem.Biol.(2010)5:377-392(坐标：PDB ID:3M02)公开。将这个模板载入YASARA程序后，执行同源性建模运行，同时该程序的建模速度设定为‘低’并且最大模板和每模板的最大比对设定为1。其他设定保持为程序的默认值。

将第一壳位置定义为以下氨基酸残基，所述氨基酸残基在该模型结构中在结合的2F-FPP的7.5埃原子范围内具有至少一个非氢侧链或主链原子。与SEQ ID NO:2相比，第一壳中的修饰优选地在第一壳可变位置处存在。这些可变位置是以下位置(与之对齐(aligning with))：SEQ ID NO:2的位置301、303、307、310、331-337、341、409、413、416、420、435、437-441、444、476、479、481-484、486、487、491、552、553、556、557、560、569和574。

将第二壳位置定义为以下氨基酸残基，所述氨基酸残基在该模型结构中在结合的2F-FPP的7.5埃和15埃之间原子范围内具有至少一个非氢侧链或主链原子，但是在该模型结构中在结合的2F-FPP的7.5埃原子范围内没有侧链或主链原子。与SEQ ID NO:2相比，第二壳中的修饰优选地在可变位置处存在。第二壳可变位置是以下位置(与之对齐)：SEQ ID NO:2的位置25、27-32、34、225-228、230、297-300、302、304-306、308、309、311-315、325-328、330、340、343-346、350、353、354、357、375、378、379、382、383、402-408、410-412、414、415、417、418、421、422、424、427-434、436、442、443、445-448、464、472-475、477、478、485、488-490、492-503、516、517、519-521、523、524、527、548-551、554、555、558、559、561-564、566-568、570、571、573、575、576、578和579。

已经特别地发现在第二壳中或在第一壳中的修饰有利于获得生产率增加的朱栾倍半萜合酶，更特别地有利于获得比生产率增加的朱栾倍半萜合酶。

在一个有利的实施方案中，朱栾倍半萜合酶在与SEQ ID NO:2中半胱氨酸位置相对应的位置处具有至少一个修饰。这些半胱氨酸位置是SEQ ID NO:2的位置16、225、244、323、327、405、503和527(与之对齐)。

不受理论约束，构思了这种朱栾倍半萜合酶中改善的生产率可以部分地或完全因增加的酶稳定性所致，更精确地因增加的可操作稳定性(随时间推移丧失催化活性倾向性较低)所致。SEQ ID NO:2中的半胱氨酸位置可以是半胱氨酸作为游离半胱氨酸出现或在SEQ ID NO:2的朱栾倍半萜合酶的YASARA-模型中的二硫键内出现的位置。这些半胱氨酸位置是SEQ ID NO:2的位置16、225、244、323、327、405、503和527(与之对齐)。

在一个优选实施方案中，本发明的朱栾倍半萜合酶包含如SEQID NO:3中所示的氨基酸序列或其功能同源物。本文中，以′X′标注的位置原则上可以含有任何氨基酸残基，条件是优选地至少一个氨基酸残基与SEQ ID NO:2中的相应氨基酸残基不同。在一个特别优选的实施方案中，本发明的朱栾倍半萜合酶包含如SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列或其功能同源物。本文中，在括号之间对SEQID NO:3中已经以′X′标注的位置给出特别优选的氨基酸残基。优选地，这些位置的至少一个具有与SEQ ID NO:2中相应氨基酸残基不同的氨基酸残基。

在一个具体实施方案中，生产率改善的朱栾倍半萜合酶、特别地SEQ ID NO:2的朱栾倍半萜合酶的功能同源物，在与SEQ IDNO:2的87、93、128、171、178、187、226、302、312、319、323、398、436、448、449、450、463、488、492、502、507、530或559对齐的一个或多个位置处包含修饰。

在一个优选实施方案中，与SEQ ID NO:2代表的朱栾倍半萜合酶相比，生产率增加的朱栾倍半萜合酶、特别地SEQ ID NO:2的朱栾倍半萜合酶的功能同源物，在与选自SEQ ID NO:2的16、128、171、187、225、244、300、302、307、319、323、327、331、334、398、405、409、410、412、436、438、439、444、448、449、450、463、488、490、492、502、503、507、527、556、559、560、566、568、569和570的位置相对应的氨基酸位置处具有一个或多个修饰，特别地一个或多个置换。更优选地，生产率增加的朱栾倍半萜合酶在与选自SEQ ID NO:2的16、225、244、300、302、307、323、327、331、334、405、409、410、412、436、438、439、444、448、449、450、463、488、490、492、502、503、507、527、556、559、560、566、568、569和570的一个或多个位置相对应(与之对齐)的位置处包含一个或多个修饰。

在一个特别优选的实施方案中，该朱栾倍半萜合酶具有选自以下的一个或多个修饰：16A、16T、16S、128L、171R、187K、225S、244S、244T、300Y、302D、307T、307A、319Q、323A、327L、331G、334L、398I、398M、398T、405T、405V、409F、410F、410V、410L、412G、436L、436K、436T、436W、438T、439G、439A、444I、444V、448S、449F、449I、449Y、450L、450M、450V、463E、463S、463G、463W、488Y、488H、488S、490N、490A、490T、490F、492A、492K、502Q、503S、507E、507Q、527T、527S、527A、556T、559H、559L、559V、560L、566S、566A、566G、568S、569I、569V、570T、570G、570A和570P。

具体而言，已经用具有选自以下的一个或多个修饰的朱栾倍半萜合酶实现良好结果：16A、16T、16S、244S、244T、300Y、307T、307A、323A、327L、331G、334L、405T、405V、409F、410F、410V、410L、412G、436L、436K、436T、438T、439G、439A、444I、448S、449F、450M、450L、450V、463E、463S、463G、463W、488Y、488S、488H、490N、490A、490T、490F、492A、492K、502Q、503S、507E、507Q、527T、527S、527A、556T、559H、559L、559V、560L、566S、566A、566G、568S、569I、569V、570T、570G和570P。

已经对具有选自以下至少一个修饰的朱栾倍半萜合酶观察到特别高的生产率：16A、244S、300Y、307T、307A、323A、327L、331G、334L、405T、409F、410F、410V、410L、412G、436L、436K、436T、438T、439G、439A、449F、450L、450V、488Y、488H、488S、490N、490A、490T、492A、492K、502Q、503S、507E、507Q、527T、556T、559H、559L、560L、566S、566A、568S、569I、569V、570T和570G。

与SEQ ID NO:2相比，包含至少两个修饰的朱栾倍半萜合酶的优选例子是具有选自128L、187K、302D、398I、398M、398T、436L、436K、436W、449F、449I、449Y、450L、450F、450V、463E、463S、463G、463W、488S、488Y和488H的至少两个修饰的那些。具体而言，已经用与SEQ ID NO:2相比包含至少两个修饰的朱栾倍半萜合酶实现良好结果，其中所述至少两个修饰选自与463、488、436、450相对应的至少两个位置处的修饰，优选地与463和488、或436和450相对应的位置处的突变。这些修饰可以特别地选自上文中指示为优选的置换。

虽然已经用与SEQ ID NO:2相比仅具有一个或两个突变(置换)的朱栾倍半萜合酶获得良好结果，但是本发明的朱栾倍半萜合酶可以包含更多个修饰，特别地3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个或7个或更多个修饰。原则上对修饰的数目不存在限制，条件是该酶保留作为朱栾倍半萜合酶的足够催化性特性。然而，至少对于朱栾倍半萜合酶的功能同源物，通常优选在与SEQ ID NO:2的第一壳和第二壳中的严格保守残基对齐的位置处包含与SEQ ID NO:2相同的氨基酸残基。这些位置特别地是SEQID NO:2的位置324、329、338、339、342、359、360、369、419、426、480、532、555和565，以便实现有利的朱栾倍半萜合酶生产率特性。

与SEQ ID NO:2的朱栾倍半萜合酶相比具有增加的生产率的朱栾倍半萜合酶优选地是SEQ ID NO:2的朱栾倍半萜合酶的功能同源物。与SEQ ID NO:2的朱栾倍半萜合酶相比具有增加的生产率的朱栾倍半萜合酶优选地包含与SEQ ID NO:2具有至少55%、至少65%、至少75%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的氨基酸序列：条件是与SEQ ID NO:2相比，所述朱栾倍半萜合酶含有至少一个修饰。该朱栾倍半萜合酶可以由与SEQ ID NO:2具有这种序列同一性的多肽组成。然而，也可能的是，朱栾倍半萜合酶包含具有这种序列同一性的至少一个区段和至少一个其他肽区段，如标签肽。

因此，在一个具体实施方案中，本发明涉及一种朱栾倍半萜合酶，其中所述朱栾倍半萜合酶包含第一多肽区段和第二多肽区段，所述第一区段包含标签-肽并且第二区段包含具有朱栾倍半萜合酶活性的多肽。

标签-肽优选地选自氮利用蛋白(NusA)、硫氧还蛋白(Trx)和麦芽糖结合蛋白(MBP)。另外，可以使用净负电荷大的小肽作为标签-肽，如已经由Zhang,Y-B等人,Protein Expression and Purification(2004)36:207-216描述。特别合适的是来自大肠杆菌的麦芽糖结合蛋白。通过增加活性形式的朱栾倍半萜合酶表达，该标签可以特别地改善酶的生产率。优选地，与SEQ ID NO:2代表的朱栾倍半萜合酶相比，具有标签肽区段的本发明朱栾倍半萜合酶具有增加的比生产率、增加的稳定性或增加的产物特异性(相对于法呢基二磷酸转化成大根香叶烯A)，特别地当标签-肽选自氮利用蛋白(NusA)、硫氧还蛋白(Trx)和麦芽糖结合蛋白(MBP)时。

为改善加标签的朱栾倍半萜合酶的溶解度(与不带标签的朱栾倍半萜合酶相比)，酶的第一区段优选地在其C端与第二区段的N端结合。可选地，加标签的酶的第一区段在其N端与第二区段的C端结合。

本发明还涉及包含本发明载体的宿主细胞。“宿主细胞”意指含有载体并支持该载体复制和/或表达的细胞。

在宿主细胞中编码朱栾倍半萜合酶的核酸通常异源于宿主细胞。宿主细胞可以是原核细胞、真核细胞或来自古细菌成员的细胞。宿主细胞可以来自任何生物，特别地任何非人类生物。具体而言，宿主细胞可以选自细菌细胞、真菌细胞、古细菌、原生生物、植物细胞(包括藻类)、源自动物(尤其从所述动物分离的)的细胞。宿主细胞可以形成除人或该酶从中天然起源的生物之外的多细胞生物的部分。在一个具体实施方案中，本发明的宿主细胞处于源自多细胞生物，然而从中分离的细胞培养物中。

通常而言，宿主细胞是包含表达酶的基因的生物，所述酶用于催化甲羟戊酸途径或另一条代谢途径(如脱氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途径)的反应步骤，所述另一条代谢途径使得产生作为通用类异戊二烯结构单位的C5异戊烯基二磷酸盐类异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸盐(DMAPP)成为可能。迄今已知，除非已经敲除特定基因，否则全部已知的生物均包含这种途径。真核生物通常天然能够经甲羟戊酸途径制备IPP。这种IPP随后因异戊烯基二磷酸异构酶(Idi)的作用异构化成DMAPP。DXP途径，其以5:1比率供应IPP和DMAPP，是原核生物共有的，虽然几种原核生物天然能够经甲羟戊酸途径制备IPP。这些途径是本领域已知的并且已经例如由描述Withers和Keasling在Appl.Microbiol.Biotechnol.(2007)73:980-990中，其中通过引用方式纳入描述这些途径的内容和特别在所述出版物中提到的图1和在一个或两个所述途径中发挥作用的酶。这些途径的基因可以各自独立地同源或异源于细胞。

宿主细胞进一步将内源性或从异源来源包含一种或多种表达具有异戊烯基转移酶活性的酶的基因，所述酶催化C5异戊烯基二磷酸盐类的头-对-尾缩合，产生较长的异戊烯基二磷酸盐类。例如，通过这些酶的作用，通用性倍半萜前体法呢基二磷酸(FPP)通过连续头-对-尾添加2分子IPP至1分子DMAPP而形成。

在一个实施方案中，宿主细胞是细菌。细菌可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性的。革兰氏阳性细菌可以选自芽孢杆菌属(Bacillus)和乳杆菌属(Lactobacillus)，特别地选自以下物种：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。

在一个优选实施方案中，细菌是选自革兰氏阴性细菌，特别地来自红细菌属(Rhodobacter)、副球菌属(Paracoccus)和埃希氏菌属(Escherichia)的组，更具体地来自荚膜红细菌(Rhodobactercapsulatus)、类球红细菌、产类胡萝卜素副球菌(Paracoccuscarotinifaciens)、产玉米黄素副球菌(Paracoccus zeaxanthinifaciens)和大肠杆菌。类球红细菌是天然含有表达催化DXP途径中各种反应步骤的酶所需要的全部基因的生物的例子，这使得胞内产生IPP和DMAPP成为可能。

在一个实施方案中，宿主细胞是真菌细胞，特别地是选自以下属的真菌细胞：曲霉属(Aspergillus)、布拉霉属(Blakeslea)、青霉属(Penicillium)、法夫酵母属(Phaffia(Xanthophyllomyces))、毕赤酵母属(Pichia)、糖酵母属(Saccharomyces)和耶罗维亚酵母属(Yarrowia)、更特别地选自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、三孢布拉霉(Blakeslea trispora)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)(红法夫酵母(Xanthophyllomycesdendrorhous))、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和解脂耶罗维亚酵母(Yarrowialipolytica)。

也可能在源自高等真核生物的细胞如植物细胞和动物细胞如昆虫细胞或来自小鼠、大鼠或人的细胞中表达本发明的核酸。所述细胞可以在细胞或组织培养物中维持并用于朱栾倍半萜合酶的体外产生。

包含本发明宿主细胞的多细胞生物可以特别地选自多细胞植物和蘑菇(担子菌纲(Basidiomycetes))。

因而，在一个具体实施方案中，本发明涉及转基因植物或包含转基因植物细胞的植物细胞或组织培养物，所述植物或培养物包含本发明的植物宿主细胞。转基因植物细胞的转基因植物或培养物可以特别地选自烟草属物种(Nicotiana spp.)、茄属物种(Solanum spp.)、菊苣(Cichorum intybus)、莴苣(Lactuca sativa)，薄荷属物种(Menthaspp.)、黄花蒿(Artemisia annua)、块茎形成植物，如菊芋(Helianthustuberosus)、木薯和甜菜(Beta vulgaris)，油料作物，如芸苔属物种(Brassica spp.)、油棕属物种(Elaeis spp.)(油棕榈树)、向日葵(Helianthus annuus)、大豆(Glycine max)和落花生(Arachishypogaea)、水培植物如浮萍属物种(Lemna spp.)、烟草BY2细胞和展叶剑叶藓(Physcomitrella patens)、树如松树和杨树，分别地，任何所述植物的细胞培养物或组织培养物。在一个具体实施方案中，组织培养物是须根培养物。

因而，在又一个具体的实施方案中，本发明涉及转基因蘑菇或包含转基因蘑菇细胞的培养物。转基因蘑菇或包含转基因宿主细胞的培养物可以特别地分别选自裂褶菌属(Schizophyllum)、伞菌属(Agaricus)和侧耳属(Pleurotus)、更特别地选自裂褶菌(Schizophyllum commune)、普通蘑菇(双孢蘑菇(Agaricus bisporus))、平菇(糙皮侧耳(Pleurotus ostreotus)和美味侧耳(Pleurotus sapidus))、包含任何所述蘑菇的细胞的培养物。使用蘑菇来表达朱栾倍半萜合酶的一个额外优点是至少一些蘑菇能够将朱栾倍半萜转化成诺卡酮(Fraatz,M.A.等人,J.Mol.Catal.B:Enzym.(2009)61:202-207)。

仅次于产生朱栾倍半萜本身，在植物或蘑菇中表达本发明的朱栾倍半萜合酶和产生朱栾倍半萜也在这些生物中提供抗性。首先，已知的朱栾倍半萜充当昆虫拒斥剂并且有效对抗昆虫如蚊子、蟑螂、蜱、蚤、白蚁和果蝇(Drosophila)。另外，朱栾倍半萜已经显示使植物抵抗病原体，如真菌疫霉(Phytophthora)，尤其多枝疫霉(P.ramorum)(橡树猝死病菌)(Manter,D.K.等人,Forest Pathology(2006)36:297-308)。

本发明的宿主细胞可以基于本领域通常已知的标准遗传学和分子生物学技术产生，例如，如Sambrook,J.和Russell,D.W.″Molecular Cloning:A Laboratory Manual″第3版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,(2001)；和F.M.Ausubel等人编著,″Current protocols in molecular biology″,JohnWiley and Sons,Inc.,New York(1987)以及最近补充中所述。

转化担子菌的方法是例如从Alves等人(Appl.Environ.Microbiol.(2004)70:6379-6384)、Godio等人(Curr.Genet.(2004)46:287-294)、Schuurs等人(Genetics(1997)147:589-596)和WO06/096050中已知的。为实现在担子菌中表达合适的朱栾倍半萜合酶基因，通常地将其完整可读框克隆适于转化担子菌的表达载体中。该表达载体优选地也包含调节转录启动和终止的核酸序列。还优选并入至少一个选择标记基因以允许选择转化体。可以使用担子菌启动子，例如组成型启动子或诱导型启动子实现朱栾倍半萜合酶的表达。一种强组成型启动子的例子是甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpdA)启动子。当重组DNA物质在担子菌宿主中表达时，这种启动子优选用于组成型表达。其他例子是担子菌的磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子、丙酮酸激酶(pki)启动子、TPI磷酸丙糖异构酶(tpi)启动子、APC合成酶亚基g(oliC)启动、sc3启动子和乙酰胺酶(amdS)启动子(WO96/41882)。

如果需要，可以针对担子菌宿主的密码子选择修改朱栾倍半萜合酶基因的一级核苷酸序列。

另外，表达可以尤其指向(单核)菌丝体或指向(二核)子实体。在后一种情况下，侧耳属Fbh1启动子是特别有用的(Penas,M.M.等人,Mycologia(2004)96:75-82)。

本领域中描述了构建植物转化构建体的方法学。可以通过插入所选择基因的一个或多于一个额外副本实现过量表达。不知道最初用核苷酸序列的一个或多于一个额外副本所转化的植物或其子代是否显示出过量表达。

在适宜的植物组织中获得足够水平的转基因表达是产生基因修饰作物的重要方面。异源DNA序列在植物宿主中的表达取决于存在可操作地连接的在植物宿主内有功能的启动子。启动子序列的选择将决定异源DNA序列在生物内部何时和何处表达。虽然来自双子叶植物的许多启动子已经显示在单子叶植物中可运作并且反之亦然，但是理想地选择双子叶启动子用于双子叶植物中的表达，并选择单子叶启动子用于单子叶植物中的表达。然而，对所选择的启动子的出处不存在限制；足够的是它们有效驱动核苷酸序列在所需的细胞或组织中表达。在一些情况下，需要多种组织中的表达，并且在这种情况下看，可以使用组成型启动子如35S启动子系列。然而，在本发明的一些实施方案中，在转基因植物中的表达优选地是叶特异性的，更优选地，基因表达叶质体中发生。来自银白杨(Populus alba)的异戊二烯合酶基因启动子(PaIspS)(Sasaki等人，FEBS Letters(2005)579：2514-2518)似乎驱动质体特异性表达。因此，这种启动子是非常适合用于本发明表达载体中的启动子。

其他适合的叶特异性启动子是rbcS(核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶)启动子(例如来自咖啡，见WO 02/092822)；来自芸苔属(Brassica)，见US 7,115,733；来自大豆，见Dhanker,O等人,NatureBiotechnol.(2002)20:1140-1145)、cy-FBPase启动子(见US6,229,067)、来自油棕的集光性叶绿素a/b结合蛋白的启动子序列(见US 2006/0288409)、来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的STP3启动子(见，Büttner,M.等人,Plant cell &Environ.(2001)23:175-184)、菜豆PAL2基因的启动子(见Sablowski,R.W.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92:6901-6905)、马铃薯ST-LS1启动子的增强子序列(见Stockhaus,J.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)84:7943-7947)、小麦CAB1启动子(见Gotor,C.等人,Plant J.(1993)3:509-518)、来自马铃薯的ADP葡萄糖磷酸化酶基因的气孔特异性启动子(见US 5,538,879)、来自稻P(D540)基因的LPSE1元件(见CN 2007/10051443)和来自拟南芥的气孔特异性启动子pGC1(Atlg22690)(见Yang,Y.等人,Plant Methods(2008)4:6)。

可以例如通过DNA介导的植物细胞原生质体转化法并且随后根据本领域熟知的方法从转化的原生质体再生出植物来转化植物物种。

转化植物细胞的方法的其他例子包括微量注射法(Crossway等人,Mol.Gen.Genet.(1986)202:179-185)、电穿孔法(Riggs,C.D.和Bates,G.W.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986),83:5602-5606)、农杆菌介导转化法(Hinchee等人,Bio/Technol.(1988)6:915-922)、直接基因转移法(Paszkowski,J.等人,EMBO J.(1984)3:2717-2722)和使用从Agracetus,Inc.,Madison,Wisconsin和BioRad,Hercules,California可获得的装置的射弹粒子加速法(见，例如，Sanford等人,美国专利号4,945,050和欧洲专利申请EP 0 332 581)。

也可以采用用于玉米的原生质体转化法(欧洲专利申请EP 0292 435，美国专利号5,350,689)。

特别优选使用农杆菌Ti和Ri质粒的双元型载体。Ti衍生的载体转化类型广泛的高等植物，包括单子叶和双子叶植物，如大豆、棉花、油菜、烟草和稻(Pacciotti等人,Bio/technol.(1985)3:241；ByrneM.C.等人,Plant Cell Tissue and Organ Culture(1987)8:3-15；Sukhapinda，K.等人,Plant Mol.Biol.(1987)8:209-217；Hiei，Y.等人,The Plant J.(1994)6:271-282)。T-DNA转化植物细胞的用途已经得到广泛研究并且大量描述(例如EP-A 120516)。为了引入植物中，可以将本发明的嵌合基因插入如实施例中所述的双元载体中。

本领域技术人员可获得其他转化方法，如直接摄入外来DNA构建体(见EP-A 295 959)、电穿孔技术(来自M.E.等人,Nature(1986),319:791-793)或采用核酸构建体包覆的金属粒子的高速射弹轰击法(例如US 4,945,050)。一旦转化，可以通过本领域技术人员再生细胞。特别有意义的是将外来基因转化至商业重要的作物中的方法，如油菜(De Block,M.等人,Plant Physiol.(1989)91:694-701)、向日葵(Everett,N.P.等人,Bio/Technology(1987)5:1201-1204)、大豆(EP-A 301 749)、稻(Hiei,Y.等人,The Plant J.(1994)6:271-282)和玉米(Fromm等人,1990,Bio/Technology 8:833-839)。

本领域技术人员将理解方法的选择可能取决于植物的类型，即单子叶植物或双子叶植物。

在另一个实施方案中，可以将如本文所述的载体直接转化至质体基因组中。质体转化技术广泛地例如在US 5,451,513、US5,545,817、US 5,545,818和WO 95/16783中描述。用于叶绿体转化的基本技术涉及将分布于选择标记侧翼的克隆的质体DNA的区域连同目的基因一起导入合适的靶组织，如使用生物弹射击法或原生质体转化(如氯化钙或PEG介导的转化)。

含有本发明载体的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)细胞可用于产生转化植物的方法中，其中载体包含Ti质粒。用如上文所述的根癌农杆菌感染植物细胞以产生转化的植物细胞，并且随后从转化的植物细胞再生出植物。已知可用于实施本发明的许多农杆菌载体系统。这些载体统一般携带至少一个T-DNA边界序列并且包括载体如pBIN19(Bevan,Nucl.Acids Res.(1984)12:8711-8720)。

通常但不必然地随选择标记采取使用一种形式的直接基因转移或农杆菌介导转移的方法，其中所述选择标记可以提供针对抗生素(例如卡那霉素、潮霉素或甲氨蝶呤)或除草剂(例如膦丝菌素)的抗性。然而，选择用于植物转化的选择标记对本发明并非至关重要。

培养植物组织的一般方法例如由Maki,K.Y.等人,PlantPhysiol.(1993)15:473-497；和Phillips,R.I.等人,引自：SpragueGF,Dudley JW,编著,Corn and corn improvement.第3版,Madison(1988)345-387提供。

在转化后，将转基因植物细胞置于选择转基因细胞的适宜选择培养基中，其中随后将所述转基因细胞培育成愈伤组织。从愈伤组织培育出苗并且通过在生根培养基中生长，从苗产生小植物。所用的特定标记将允许与缺少已经引入的DNA的细胞相比，选择转化的细胞。

为证实转基因在转基因细胞和植物中的存在，可以进行多种测定法。此类测定法例如包括本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定法，如DNA印迹和RNA印迹法，原位杂交和基于核酸的扩增方法如PCR或RT-PCR和“生物化学”测定法，如检测蛋白质产物的存在，例如，通过免疫手段(ELISA和蛋白质印迹法)或通过酶功能。可以通过化学分析植物的挥发性产物(朱栾倍半萜)建立确立有酶活性的朱栾倍半萜合酶的存在。

本发明的朱栾倍半萜合酶可以用于朱栾倍半萜的工业生产，所述朱栾倍半萜可以本身用作香料或香精，例如用于食品中，或用作香味料(fragrance)，例如用于家用产物中，或用作生产另一种类异戊二烯(例如诺卡酮)的中间体。

一种用于产生本发明朱栾倍半萜的方法包括在朱栾倍半萜合酶存在下制备朱栾倍半萜。原则上，这种方法可以基于制备目的化合物时使用酶的任何技术。

该方法可以是其中向包含朱栾倍半萜合酶的细胞输送FPP或其任何前体(如法呢醇、IPP、异戊烯基磷酸酯、3-甲基丁-3-烯-1-醇和甚至甲羟戊酸)作为底物的方法。可选地，该方法也可以其中利用活生物的方法，所述活生物包含能够从适合的碳源形成FPP的酶系统，因此建立通向朱栾倍半萜的完整发酵途径。应当指出术语“发酵”在本文中以广义用于其中利用生物的培养物从适合的原料(糖、氨基酸源、脂肪酸源)中合成化合物的过程。因而，如本文中所意指的发酵过程不限于无氧条件，并且扩展至需氧条件下的过程。合适的原料通常是对于具体(微)生物物种已知的。

另外，可以利用从已经产生朱栾倍半萜合酶的细胞分离的朱栾倍半萜合酶，例如在其中使底物(FPP)和朱栾倍半萜合酶在合适条件下(pH、溶剂、温度)接触的反应体系中利用，所述条件可以基于在此和本公开提到的现有技术，任选地与一些例行检验组合。朱栾倍半萜合酶可以例如溶解于其中也存在FPP的含水介质中，或朱栾倍半萜合酶可以按本领域已知的方式固定在支撑材料上并且随后与包含FPP的液体接触。由于该酶具有催化FPP至朱栾倍半萜的高度活性和/或选择性，所以本发明也有利于这种体外方法，不仅在酸性条件下，还在pH为约中性或碱性的情况下。适合的条件可以基于用于已知朱栾倍半萜合酶的已知(例如在文献中提到、在本文中提到的)方法学、本文中公开的信息、公知常识和任选地一些例行实验。

在本发明的一个特别有利的方法中，朱栾倍半萜以发酵方式(即，通过在培养基中培育表达朱栾倍半萜合酶的细胞)制备。由朱栾倍半萜合酶催化的实际反应可以在胞内发生或-如果朱栾倍半萜合酶排出至培养基中-可以在培养基中胞外发生。

在制备本发明朱栾倍半萜的方法中使用的细胞可以特别地是本发明的宿主细胞。如果需要，可以将这些宿主细胞工程化以便将FPP以增加的量供应给朱栾倍半萜合酶。这可以例如通过增强通向FPP的碳通量实现，后者本身可以按不同方式实现。在具有内源DXP途径的宿主细胞(如大肠杆菌和类球红细菌)，这些途径酶的表达的脱调节可以对类异戊二烯形成具有清晰的积极影响。过量表达编码1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXP合酶)(DXP途径的第一酶)的dxs和因此代谢工程的主要靶之一已经导致几种类异戊二烯的生物合成增加(例如，Matthews和Wurtzel,Appl.Microbiol.Biotechnol.(2000)53:396-400；Huang等人,Bioorg.Med.Chem.(2001)9:2237-2242；Harker and Bramley,FEBS Lett(1999)448:115-119；Jones等人,Metab.Eng.(2000)2:328-338；和Yuan等人,Metab.Eng.(2006)8:79-90)。另外，编码DXP异构还原酶(也称作1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶)(催化DXP途径中第二和关键步骤的酶)的dxr的过量表达可以导致增加的类异戊二烯产生(Albrecht等人,Biotechnol.Lett.(1999)21:791-795)，这种作用可以通过同时共过量表达dxs而进一步增加(Kim和Keasling,BiotechnolBioeng(2001)72:408-415)。通过过量表达异戊烯基二磷酸异构酶(IPP异构酶，Idi)(催化IPP与二甲基烯丙基二磷酸酯DMAPP互变的酶)(例如，Kajiwara等人,Biochem.J.(1997)324:421-426)；Misawa和Shimada,J.Biotech.(1998)59:169-181和Yuan等人,Metab.Eng.(2006)8:79-90)和在大肠杆菌中作为一个操纵子ispDF转录的MEP胞苷酰基转移酶(也称作4-二磷酸胞苷酰-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合酶，IspD)和2C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环二磷酸酯合酶(IspF)(Yuan等人,Metab.Eng.(2006)8:79-90)，进一步获得对类异戊二烯生物合成的积极影响。

一种用内源DXP途径使菌株工程化以高水平产生类异戊二烯的替代性和更有效方法是引入异源甲羟戊酸途径。当重组大肠杆菌菌株在LB+丙三醇培养基中培育时，大肠杆菌中共表达酿酒酵母甲羟戊酸途径连同合成性紫穗槐-4,11-二烯合酶基因导致滴度超过110mg/L的倍半萜紫穗槐二烯形成(Martin等人,Nat.Biotechnol.(2003)21:796-802)。随后通过引入额外拷贝的编码酵母酶3-羟基-3-甲基-戊二酰-辅酶A(HMG-CoA)还原酶C端催化性结构域的基因tHMG1改进这种大肠杆菌菌株。通过增加这种酶的形成并因此增加其活性，毒性甲羟戊酸途径中间体HMG-CoA的胞内水平降低，因而克服生长抑制并且导致甲羟戊酸的产生增加(Pitera等人,Metab.Eng.(2007)9:193-207)。通过异源甲羟戊酸途径的前三个基因的密码子优化进一步改善经过该途径的通量，其中所述密码子优化与野生型lac启动子替换为两倍更强的lacUV5启动子组合(Anthony等人,Met.Eng.(2009)11:13-19)。甚至可以通过将酵母HMG-CoA合酶和HMG-CoA还原酶基因替换为来自革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的等同基因更多地增加紫穗槐二烯的产生。与优化的发酵方案组合，这种工程化的新大肠杆菌菌株的培育产生27.4g/l的紫穗槐二烯滴度(Tsuruta等人,PloS ONE(2009)4(2):e4489.doi:10.1371/journal.pone.0004489)。类似地，采用与根癌农杆菌癸异戊烯基二磷酸合酶(ddsA)基因组合的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)甲羟戊酸途径工程化的大肠杆菌菌株产生多于2400μg/g细胞干重的辅酶Q₁₀(CoQ₁₀)(Zahiri等人,Met.Eng.(2006)8:406-416)。通过用天然形式(WO 2005/005650)或突变形式(WO 2006/018211)的来自产玉米黄素副球菌的甲羟戊酸途径工程化类球红细菌菌株，也获得增加的CoQ₁₀产量。

另外，具有内源MEV途径的宿主细胞(如酿酒酵母)已经成为多种工程化研究的主题以获得类异戊二烯高产菌株。向酿酒酵母中引入与编码柑橘朱栾倍半萜合酶的基因组合的大肠杆菌源异源DXP途径产生了与仅表达朱栾倍半萜合酶的菌株相比，积累大约10倍更多朱栾倍半萜的菌株(WO 2007/093962)。然而，在工业上重要的酵母产朊假丝酵母(Candida utilis)和酿酒酵母中的最大改善是同源MEV途径工程化的核心。尤其，过量表达全长或截短形式的据信作为DXP途径种主要调节酶的HMG-CoA还原酶似乎是增加类异戊二烯产生的高效方法。过量表达N端截短的HMG-CoA还原酶的这种刺激作用例如已经在产朊假丝酵母中产生番茄红素时(Shimada等人,Appl.Env.Microbiol.(1998)64:2676-2680)和在酿酒酵母中产生表-雪松醇时(Jackson等人,Org.Lett.(2003)5:1629-1632)观察到。在后一种情况下，可以通过引入upc2-1(刺激指向固醇生物合成的代谢通量增加的等位基因)进一步增强这种倍半萜的产生。增加经MEV途径的通量的另一种方法是利用对FPP和其他类异戊二烯前体的反馈抑制较不敏感的甲羟戊酸激酶变体。例如，WO 2006/063752显示产玉米黄素副球菌R114(具有内源MEV途径的细菌)在引入酿酒酵母甲羟戊酸激酶突变体N66K/I152M和来自产玉米黄素副球菌ATCC21588的ddsA基因后产生比表达野生型酿酒酵母甲羟戊酸激酶的相应产玉米黄素副球菌菌株显著更多的辅酶Q₁₀。也已经用产玉米黄素副球菌甲羟戊酸激酶的反馈抗性变体K93E获得对采用产玉米黄素副球菌R114产生辅酶Q₁₀的相似积极影响(WO 2004/111214)。

增加FPP量的第二种方法基于减少或消除对FPP的酶促副活性。在酵母中，基因ERG9编码法呢基二磷酸法呢基转移酶(鲨烯合酶)，其催化两个法呢基二磷酸部分缩合以形成鲨烯。因为这是醇生物合成中FPP之后的第一步骤并因而调节异戊二烯单位进入固醇途径的通量，所以ERG9是酵母代谢工程中用于增加倍半萜和类胡萝卜素产生的频繁靶。在酵母产朊假丝酵母中破坏ERG9联合tHMG-CoA还原酶的过量表达增加番茄红素的产生(Shimada等人,Appl.Env.Microbiol.(1998)64:2676-2680)。与仅表达紫穗槐二烯合酶基因的酵母菌株相比，过量表达tHMG-CoA还原酶和使用甲硫氨酸可阻遏启动子下调ERG9的相似组合增加了酵母中倍半萜紫穗槐二烯的产生约10倍(Ro等人,Nature(2006)440：940-943；Lenihan等人,Biotechnol.Prog.(2008)24:1026-1032)。由于麦角甾醇对酵母生长不可或缺并且酵母细胞不能在有氧生长期间同化外部输入的麦角甾醇，因此ERG9的下调/敲除经常与使酵母菌株能够从培养基有效有氧摄入麦角甾醇的突变组合。例子是sue等位基因(Takahishi等人,Biotechnol.Bioeng.(2007)97:170-181)和upc2-1等位基因(Jackson等人,Org.Lett.(2003)5:1629-1632)。Takahashi等人(Biotechnol.Bioeng.(2007)97:170-181)也研究通过敲除酵母中的磷酸酶基因dpp1限制内源磷酸酶活性的影响。虽然这种敲除明显限制FPP的去磷酸化，由法尼醇积累少得多反映，但是它未改善倍半萜产生，除非在所用生长条件下联合erg9/sue突变之外。

可以根据所用宿主细胞物种(例如荚膜红细菌、类球红细菌、产玉米黄素副球菌、大肠杆菌、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、酿酒酵母、解脂耶罗维亚酵母、产黄青霉、红法夫酵母和巴斯德毕赤酵母的已知条件、本文中公开的信息、公知常识和任选地一些例行实验，选择以发酵方式制备朱栾倍半萜的反应条件。

原则上，可以选择本发明方法中所用的反应培养基(培养基)的pH处于宽限制范围内，只要朱栾倍半萜合酶(在宿主细胞中)有活性并且在该pH条件下显示想要的特异性。在该方法包括使用细胞表达朱栾倍半萜合酶的情况下，如此选择pH，从而细胞能够执行其预期功能或多项功能。可以特别地选择pH处于中性pH以下4个pH单位和中性pH以上两个pH单位的范围内，即在25℃在基本上水质的系统中在pH 3和pH 9之间。良好结果例如已经在具有6.8至7.5范围内的pH的含水反应培养基中实现。

认为某个系统是水质的，如果水是唯一溶剂或优势溶剂(基于总液体>50wt.%、特别地>90wt.%)，其中例如少量醇或另一种溶剂可以以这样的浓度(基于总液体<50wt.%、特别地<10wt.%)(例如在完整发酵方法的情况下，作为碳源)溶解，从而存在的微生物仍有活性。

具体而言，在使用酵母和/或真菌的情况下，可以优选酸性条件，特别地，基于在25℃基本上水质的系统，pH可以处于pH 3至pH8的范围内。如果需要，pH可以使用酸和/或碱调节或用酸和碱的合适组合缓冲。

无氧条件在本文中定义为没有任何氧或其中培养的细胞(特别地微生物)基本上不消耗氧的条件，并且通常对应于小于5mmol/l.h的氧消耗，优选地对应于小于2.5mmol/l.h或更优选地小于1mmol/l.h的氧消耗。有氧条件是这样的条件，其中不限制生长的足够氧水平溶解于培养基中，能够支持至少10mmol/l.h、更优选地多于20mmol/l.h、甚至更优选地多于50mmol/l.h并且最优选地多于100mmol/l.h的氧消耗速率。

限氧条件定义为其中氧消耗受氧从气体转移至液体限制的条件。限氧条件的下限由无氧条件的上限决定，即通常是至少1mmol/l.h，并且特别地是至少2.5mmol/l.h，或至少是5mmol/l.h。限氧条件的上限由有氧条件的下限决定，即即小于100mmol/l.h，小于50mmol/l.h，小于20mmol/l.h，或小于至10mmol/l.h。

条件是否为有氧、无氧或限氧取决于实施方法的条件，特别地取决于进入气流的量和组成、所用设备的实际混合/传质特性、所用微生物的类型和微生物密度。

原则上，所用的温度不是关键的，只要朱栾倍半萜合酶(在细胞中)显示大部分活性。通常，温度可以是至少0℃，特别地是至少15℃，更特别地是至少20℃。在其中利用细胞表达朱栾倍半萜合酶的方法的情况下，所需的最高温度取决于朱栾倍半萜合酶和细胞。温度是70℃或更低，优选地是50℃或更低，更优选地是40℃或更低，特别地是35℃或更低。

在发酵过程的情况下，可以选择温育条件处于宽限值内部，只要细胞显示出足够的活性和/或生长。这包括有氧、限氧和无氧条件。

具体而言，如果在宿主细胞外部实施借以形成朱栾倍半萜的催化反应，则包含有机溶剂的反应培养基可以在高浓度使用(例如基于总液体，高于50%或高于90wt.%)，此时，所用的朱栾倍半萜合酶在这种培养基中保留足够的活性和特异性。

如果需要，本发明方法中所产生的朱栾倍半萜或朱栾倍半萜已经在其制备后转换而成的其他化合物(如诺卡酮)从已经产生它的反应培养基回收。适合方法是采用与反应培养基不可溶混的提取液的液体-液体提取法。

具体而言，适合用液态有机溶剂，如液态烃提取(从含水反应培养基提取)。来自初步结果中，显而易见这种方法也适合从包含用于产生朱栾倍半萜的本发明细胞的反应培养基中提取朱栾倍半萜(或其他产物)，而不需要裂解细胞来回收朱栾倍半萜(或其他产物)。特别地，有机溶剂可以选自液态链烷、液态长链醇(具有至少12个碳原子的醇)和长链脂肪酸的液态酯(具有至少12个碳原子的酸)。合适的液态链烷特别地包括C₆-C₁₆链烷，如己烷、辛烷、癸烷、十二烷、异十二烷和十六烷。合适的长链脂族醇特别地包括C₁₂-C₁₈脂族醇，如油醇和棕榈醇。长链脂肪酸的合适酯特别地包括C₁₂-C₁₈脂肪酸的C₁-C₄醇酯，如肉豆蔻酸异丙酯和油酸乙酯。

在一个有利的实施方案中，朱栾倍半萜(或其他产物)在反应器中产生，所述反应器包含第一液相(反应相)，所述第一液相含有本发明的细胞，在所述细胞中产生朱栾倍半萜(或其他产物)，和第二液相(当接触时与第一相保持基本上相分离的有机相)，所述第二液相是形成的产物对其具有更高亲和力的提取相。这种方法是有利的，在于它允许原位回收产物。另外，它有助于防止或至少减少朱栾倍半萜(或其他产物)对细胞的潜在毒性效应，原因是由于存在第二相，反应相中的朱栾倍半萜(或其他产物)浓度可以在整个过程期间保持相对低。最后，存在提取相有助于从反应相中提取出朱栾倍半萜(或其他产物)的强烈迹象。

在本发明的优选方法中，提取相在反应相的顶部形成一层或与反应相混合以形成反应相在提取相中的分散体或提取相在反应相中的分散体。因此，提取相不仅从反应相提取产物，还有助于减少或完全避免形成的产物从反应器经排气损失，其中如果朱栾倍半萜在(水质)反应相中产生或分泌入(水质)反应相中，则所述损失可能发生。朱栾倍半萜在水中溶解不良并且因此容易从水中挥发出来。构思了至少基本上防止在有机相中溶剂化的朱栾倍半萜(作为层或分散体)挥发。

用作提取相的合适液体兼有比反应相更低的密度连同良好生物相容性(不干扰活细胞的生存力)、低挥发性及与水质反应相的几乎绝对不互溶性。适合这种应用的液体的例子是液态链烷，如癸烷、十二烷、异十二烷、十四烷和十六烷或长链脂族醇如油醇和棕榈醇、或长链脂肪酸的酯如肉豆蔻酸异丙酯和油酸乙酯(见例如Asadollahi等人(Biotechnol.Bioeng.(2008)99:666-677)，Newman等人(Biotechnol.Bioeng.(2006)95:684-691)和WO 2009/042070)。

根据本发明产生的朱栾倍半萜可以例如用作香料或香精，或用作昆虫拒斥剂，或可以用作另一种化合物、特别地另一种香料或香精的原料。具体而言，朱栾倍半萜可以转化成诺卡酮。可以在胞内或胞外实施朱栾倍半萜转化成诺卡酮。如果这种制备在细胞内部实施，则诺卡酮通常在其产生后从宿主细胞分离。

将朱栾倍半萜转化成诺卡酮的合适方式是本领域已知的，例如，如其内容通过引用方式并入的Fraatz等人,Appl.Microbiol.Biotechnol(2009)83:35-41或其中引用的参考文献中所述。

通常，从朱栾倍半萜制备诺卡酮的合适方法可以分成i．纯粹化学方法、ii．生物催化方法(例如使用漆酶与介体组合的那些方法)、iii．生物转化法(即采用完整活细胞的方法)，和iv．全发酵法。

在方法i-iii中，将外部输入的朱栾倍半萜转化，其中，在方法iv中朱栾倍半萜原位产生。

在一个具体实施方案中，转化包括在2-位将朱栾倍半萜区域特异性羟化成α-和/或β-圆柚醇，随后氧化，形成诺卡酮。

在又一个实施方案中，将朱栾倍半萜转化成朱栾倍半萜的过氧化物，后者随后转化成诺卡酮。美国专利号5,847,226描述了在含氧气氛中在不饱和脂肪酸的过氧化物存在时将(+)-朱栾倍半萜化学转化成诺卡酮。例如通过自氧化、光致氧化或使用脂加氧酶的酶促氧化，原位生成这种脂肪酸过氧化物，此后，这种过氧化物催化朱栾倍半萜的自氧化。

(+)-朱栾倍半萜可以由小球藻属(Chlorella)绿藻或葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)真菌的不同物种以高产率转化成诺卡酮(Furusawa等人,Chem.Pharm.Bull.(2005)53:1513-1514和JP2003-070492)。

EP-A 1083233描述了采用无细胞(生物催化)系统制备诺卡酮，所述无细胞系统基于漆酶催化的朱栾倍半萜转化成朱栾倍半萜过氧化物，所述朱栾倍半萜过氧化物随后降解以形成诺卡酮。任选地，可以按维持漆酶活性的浓度包含介体和/或溶剂。

连同其它，WO 2006/079020描述了源自植物的新细胞色素P450酶，即来自埃及莨菪(Hyoscyamus muticus)的豆腐柴螺二烯加氧酶(Premnaspirodiene oxygenase,HPO)，其催化(+)-朱栾倍半萜单羟化成主要地β-圆柚醇。仅在极高浓度的圆柚醇(>30μM)时，但仅以十分低的反应速率观察到诺卡酮形成(Takahashi等人,J.Biol.Chem.(2007)282:31744-31754)。在同一篇论文中，Takahashi等人报道了一种HPO突变体，它在圆柚醇生物合成的催化效率方面改善5倍，而没有明显改变总反应产物谱。这种圆柚醇可以因相同宿主细胞中醇脱氢酶酶的共表达进一步氧化成诺卡酮。

最近已经在菊苣(菊苣(Cichorium intybus L.))中鉴定到另一个源自植物的适合细胞色素P450酶。这种新P450酶与朱栾倍半萜合酶在酵母中的共表达导致形成反-圆柚醇、顺-圆柚醇和(+)-诺卡酮(Cankar,K等人,FEBS Letters(2011)585:178-182)。

除了源自植物的细胞色素P450酶，也已经报道细菌性细胞色素450单加氧酶P450cam和P450BM-3及其突变体氧化(+)-朱栾倍半萜(Sowden等人,Org.Biomol.Chem.(2005)3:57-64)。尽管野生型P450cam不催化这种氧化反应，但是突变体对构成大于85%所形成产物的(+)-朱栾倍半萜、(+)-反-圆柚醇和(+)-诺卡酮中的所需C2位置显示相对高的区域选择性。这些突变体的活性仍相当低。另一方面，P450BM-3突变体显示较高活性，但是无选择性，原因在于(+)-朱栾倍半萜在活性部位中的多个结合取向。最近，已经报道了选择性大得多的BM-3突变体，其中最佳者具有95%的C2区域选择性(Seifert等人,ChemBioChem(2009)10:853-861)。

构思可以将一种或多种编码催化朱栾倍半萜转化成诺卡酮的一种酶或多种酶的基因并入本发明的宿主细胞。这类酶可以例如选自小球藻或葡萄座腔菌的酶，或来自埃及莨菪的豆腐柴螺二烯氧化酶，或上文提到的P450cam或P450BM-3突变体。

如上文所示，本发明涉及对本发明的朱栾倍半萜合酶具有特异性结合亲和力的抗体。术语“抗体”包括抗原结合形式的抗体(例如，Fab、F(ab)₂)。术语“抗体”经常指特异性结合并识别分析物(抗原)的基本上由一个免疫球蛋白基因或多个免疫球蛋白基因编码的多肽或其片段。然而，尽管多种抗体片段可以就消化完整抗体方面进行定义，但是技术人员将理解这类片段可以按化学方式或通过利用重组DNA方法从头合成。因而，如本文所用，术语“抗体”也包括抗体片段如单链Fv、嵌合抗体(即，包含来自不同物种的恒定区和可变区)，人源化抗体(即，包含来自非人类来源的互补决定区(CDR))和异质缀合抗体(例如，双特异性抗体)。

抗体或其片段可以通过本领域已知用于合成抗体的任何方法产生，特别地通过化学合成或优选地通过重组表达技术产生。

针对朱栾倍半萜合酶的多克隆抗体可以通过本领域熟知的各种方法产生。例如，可以将异源朱栾倍半萜合酶施用至各种宿主动物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等，以诱导含有对朱栾倍半萜合酶特异的多克隆抗体的血清产生。根据宿主物种，各种佐剂可以用来增加免疫反应，并且包括但不限于，弗氏(完全和不完全)佐剂、无机凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、多聚醇(pluronicpolyol)、聚阴离子、肽、油乳液、匙孔槭血蓝蛋白、二硝基酚和可能有用的人用佐剂如BCG(卡介苗)和短棒状杆菌(Corynebacteriumparvum)。这类佐剂也是本领域熟知的。

可以使用本领域已知的多种技术(包括使用杂交瘤技术、重组技术和噬菌体展示技术或其组合)制备单克隆抗体。例如，可以使用杂交瘤技术，包括本领域已知和例如在Harlow等人,Antibodies:ALaboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press),第2版,(1988)；Hammerling等人,引自Monoclonal Antibodies andT-Cell Hybridomas,563-681,(Elsevier,N.Y.(1981)。如本文所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”指抗体，其源自单个克隆(包括任何真核、原核或噬菌体克隆)并且不源自借以产生它的方法。

使用杂交瘤技术产生和筛选特异性抗体的方法是本领域例行和熟知的。简而言之，小鼠可以用朱栾倍半萜合酶免疫，并且一旦检测到免疫反应，例如，在小鼠血清中检测到对朱栾倍半萜合酶特异的抗体，则收获小鼠脾并分离脾细胞。随后通过熟知技术使脾细胞与融合任何适合的骨髓瘤细胞例如来自细胞系SP20的细胞融合，所述细胞系SP20从ATCC可获得的。通过有限稀释法选择并克隆杂交瘤。随后通过本领域已知的方法对杂交瘤克隆分析分泌能够本发明多肽的抗体的细胞。可以通过用阳性杂交瘤克隆免疫小鼠产生通常含有高水平抗体的腹水。

在某些实施方案中，产生单克隆抗体的方法包括培养分泌本发明抗体的杂交瘤细胞，其中，优选地通过将从采用朱栾倍半萜合酶免疫的小鼠中分离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合并且随后对因这种融合而产生的杂交瘤筛选能够分泌结合朱栾倍半萜合酶的抗体的杂交瘤克隆，产生所述杂交瘤。本发明的抗体根据可以例如用于分离根据本发明产生的朱栾倍半萜合酶的方法中，例如使用固定在层析支撑材料上的抗体。

另外，本公开涉及一种用于制备朱栾倍半萜或诺卡酮的方法，所述方法包括在本发明的朱栾倍半萜合酶存在下使聚异戊烯基二磷酸底物转化成朱栾倍半萜或诺卡酮。这种方法可以基于本领域已知的方法学，例如，如提到的现有技术中所述，条件是使用本发明的朱栾倍半萜合酶。可以在胞内或使用分离的酶产生朱栾倍半萜或诺卡酮。可以从其中形成朱栾倍半萜或诺卡酮的介质分离朱栾倍半萜或诺卡酮。这可以按照本身已知的方式完成。

也可以在表达一种或多种酶的宿主细胞中制备诺卡酮，所述酶催化朱栾倍半萜转化成诺卡酮的反应步骤；该宿主细胞优选地也包含朱栾倍半萜合酶。

本发明现在将通过以下实施例说明。

实施例：

实施例1：制备朱栾倍半萜合酶突变体用于活性检验

从DNA2.0(Menlo Park，CA，USA)获得在表达载体pACYCDuet-1中(Novagen，MERCK，KGaA，Darmstadt，德国)的合成DNA片段，所述片段具有编码本发明朱栾倍半萜合酶突变体(ValC_mutant)的基因并具有编码朱栾倍半萜合酶野生型(ValC_wt，SEQ ID NO:2)的基因。所述朱栾倍半萜合酶基因已经由DNA2.0进行密码子优化以改善在红细菌属中的表达。所述质粒命名为pACYCDuet:ValC_mutant或pACYCDuet:ValC_wt。pACYCDuet:ValC_wt的核苷酸序列在SEQ ID NO:5中显示。pACYCDuet:ValC_mutant质粒的核苷酸序列与pACYCDuet:ValC_wt相同，不同在于形成朱栾倍半萜合酶突变体所需要的核苷酸置换。

这些基于pACYCDuet-1的重组载体在大肠杆菌中的表达导致形成带有源自pACYC-Duet-1的以下N端延长的朱栾倍半萜合酶(包括其N端甲硫氨酸残基)：NH₂-MGSSHHHHHHSQDPH-COOH。

将获自DNA2.0的冷冻干燥的基于pACYC-Duet-1的载体分别重溶于50μL无菌水中并且在37℃温育1.5小时。随后，完全采用供应商的方案(Novagen；方案TB 313 Rev.B0304)，将96孔形式的市售化学感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞用1μL重溶的质粒溶液转化。将每种转化混合物(50μL外加50μL SOC培养基以促进液体均匀分布在平板上)涂布到选择性平板(含有1%(w/v)葡萄糖和30μg/mL氯霉素的LB培养基)上并且在37℃温育16小时。全部选择性平板均含有菌落，但是获得的转化体的数目大幅度变动，从每块平板1个菌落至超过50个菌落。平板贮存在4℃直至进一步使用。

将各单独转化体的单菌落接种在含有1%(w/v)葡萄糖和50μg/mL氯霉素的5ml LB培养基中并且在37℃培育过夜。这些过夜培养物用来制备在-70℃贮存的甘油贮藏物。此外，将200μL各过夜培养物转移至含有20ml 2xYT培养基连同50μg/mL氯霉素的100ml锥形瓶。将瓶用Rotilabo培养塞(Carl Roth GmbH+Co.KG，卡尔斯鲁厄，德国)封闭并且以250转/分钟和37℃温育直至OD_600nm是0.6-0.8。随后，添加20μL 1M IPTG溶液，并且温育以250转/分钟和18℃继续过夜。次日，通过在50ml管中以3,400转/分钟离心15分钟收获培养物，此后移除培养基。随后，将细胞沉淀物冷冻贮存在-20℃。作为参考，如上处理用含有编码野生型朱栾倍半萜合酶(SEQ ID NO:2)的基因的pACYC-Duet-1转化的大肠杆菌BL21(DE3)。

为制备澄清的裂解物，将细胞沉淀物在冰上融化并重悬于1ml50mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液中。随后添加约0.2g氧化锆/二氧化硅珠0.1mm(BioSpec Products Inc.；http://www.biospec.com/)，并且通过在Bio101/Savant FastPrep FP 120仪(MP Biomedicals LLC.,Illkirch,法国)中以速度6.5振摇10秒实现裂解，随后将管转移至冰中2分钟，并以速度6.5进行另一轮10秒振摇。随后，将裂解物以13,000xg和4℃离心10分钟，并且上清液(=澄清的裂解物)立即用于酶测定法。

因为待测试的朱栾倍半萜合酶变体的数目大于每天可以产生的澄清裂解物的数目，所以每天还从表达作为参考的野生型朱栾倍半萜合酶的细胞制备澄清的裂解物。

实施例2：确定朱栾倍半萜合酶突变体的比生产率和产物特异性

为确定突变体朱栾倍半萜合酶的朱栾倍半萜生产率，使用以下测定法。

在玻璃管中混合：

-65μL 50mM Tris-HCl，pH 7.5；

-800μL分析缓冲液(15mM MOPSO(3-[N-吗啉代]-2-羟基丙磺酸)pH=7.0；12.5%(v/v)丙三醇；1mM抗坏血酸；0.1%Tween 20；1mM MgCl₂；2mM二硫苏糖醇[紧邻使用之前添加]；用NaOH调节pH至7.0)；

-20μL 250mM原钒酸钠；

-和5μL 10mM法呢基二磷酸(FPP，蒸干并溶解于0.2M氨基甲酸铵和50%乙醇中，Sigma)；

通过添加35μL澄清的裂解物启动反应。在混合后，将玻璃管在30℃温育2小时伴以温和搅拌。反应混合物随后用2ml乙酸乙酯提取并涡旋混合10秒。

以1,200xg离心10分钟后，将乙酸乙酯层收集，在硫酸钠柱上干燥并用于GC-MS分析。为此目的，使用气相色谱在7890A GC系统(Agilent Technologies)上分离来自1μl乙酸乙酯层的分析物，该系统配备30m x0.25mm，0.25mm膜厚度柱(ZB-5，Phenomenex)，使用流速1ml/分钟的氦气作为载体气体。上样器(7683B系列，Agilent Technologies)以不分流模式使用，入口温度设定至250℃。初始炉温55℃在1分钟后以速率15℃/分钟提高至300℃并且在300℃维持5分钟。GC与质量选择性检测器(型号5975C，AgilentTechnologies)偶联。鉴定化合物，并且与朱栾倍半萜的权威标准相比，通过它们的质谱、停留时间和MS色谱图的表面积进行定量。大根香叶烯A由其Cope反应产物(β-榄香烯)的出现来鉴定，并通过比较其总离子计数表面积与朱栾倍半萜的总离子计数表面积进行定量。

选择这个测定法中澄清的裂解物(35μl)和反应时间(2小时)的量处于如此范围内，其中形成的朱栾倍半萜的量线性依赖于裂解物的量。这种方法确保通过这种测定法可鉴定生产率改善的朱栾倍半萜合酶突变体。

为了就表达水平的差异补偿不同朱栾倍半萜合酶突变体的朱栾倍半萜产物，将朱栾倍半萜合酶蛋白在每种澄清的裂解物中的相对量定量。从每种澄清的裂解物，将60μl添加至20μl的4倍样品缓冲液(组成如下)，在100℃温育2分钟，并冷冻贮存。为分析，随后将这种母液1:50稀释于1x样品缓冲液中，在100℃温育2分钟并且短暂离心。随后将10μL加载于12孔RunBlue SDS-PAGE凝胶(4-20%)(Expedeon，Harston，Cambridgeshire，UK)。在每块凝胶上，也加载阴性对照(含有空pACYCDuet-1载体的大肠杆菌BL21(DE3)的澄清裂解物)和阳性对照(含有pACYCDuet-1载体的大肠杆菌BL21(DE3)的澄清裂解物，所述pACYCDuet-1载体带有编码野生型朱栾倍半萜合酶的基因)。凝胶在运行缓冲液(组成如下)中在冷却条件下以25mA/凝胶运行30分钟，随后以50mA/凝胶运行60分钟。使用SYPRO Ruby蛋白质凝胶染液(Invitrogen，Breda，荷兰)，将凝胶染色。染色程序包括在40%(v/v)乙醇+10%(v/v)乙酸溶液中固定30分钟，在脱矿质水中的单次洗涤步骤，随后在未稀释的SYPRO Ruby蛋白质凝胶染液中避光温育4小时。随后，将凝胶在10%(v/v)乙醇+7%(v/v)乙酸溶液中洗涤1小时，并且随后在脱矿质水中短暂洗涤。这种染色程序的确产生线性反应曲线。

使用染色后(Poststain)模式，100μm像素，基质类型：凝胶，和Sypro Ruby 1通道(激发滤光片480/30nm，发射滤光片595/25nm，exp 0.2)，通过在Ettan DIGE成像仪(GE Healthcare,Diegem，比利时)上扫描凝胶，将蛋白质条带定量。使用手工泳道创建、滚球背景扣减和手工峰检测，通过ImageQuant TL软件包(GEHealthcare，Diegem，比利时)检测条带。

具有阳性对照的泳道总是显示一个额外条带，其运行略快于带有分子量标记的泳道中的牛血清白蛋白(BSA，66kDa)条带。因为这个额外条带是总是从阴性对照中缺失并且总是在加载有来自表达本发明突变朱栾倍半萜合酶的大肠杆菌克隆的澄清裂解物中存在，因此得出结论，这个条带代表朱栾倍半萜合酶，虽然这种朱栾倍半萜合酶(包括N端His₆-标签)的计算分子量是70,967Da。随后相对于阳性对照泳道中相应条带的强度，同时扣减阴性对照泳道中的背景强度，进行朱栾倍半萜合酶条带的定量。

样品缓冲液(1x)的组成是：

-10%(v/v)丙三醇

-1%(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)

-0.2M盐酸三乙醇胺，pH 7.6

-1%(w/v)Ficoll-400

-0.006%(w/v)酚红

-0.006%(w/v)考马斯亮兰G250

-0.5mMEDTA

运行缓冲液的组成是：

-0.04M曲辛

-0.06M Tris

-0.1%(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)

-2.5mM亚硫酸氢钠

-pH=8.2

表1中提出具有单个氨基酸修饰的朱栾倍半萜合酶突变体的这些体外试验的结果。

表1中的结果显示，具有单点突变的本发明朱栾倍半萜合酶突变体显示明显改善的体外朱栾倍半萜生产率。相对于这个试验体系中用野生型朱栾倍半萜合酶获得的朱栾倍半萜生产率，这些突变体的朱栾倍半萜生产率是103.6%(ValC:E319Q)至397.8%(ValC:I410F)。对于许多测试的朱栾倍半萜合酶突变体，这种改善的朱栾倍半萜生产率与改善的朱栾倍半萜比生产率一起出现，因此指出以下事实：改善的朱栾倍半萜生产率主要不因这些突变体在大肠杆菌中的表达增加引起。本发明的其他朱栾倍半萜合酶突变体是明显表达的突变体，因为与阳性对照相比，朱栾倍半萜合酶条带在SDS-PAGE凝胶上的强度比属于野生型朱栾倍半萜合酶的条带的强度高得多。最后，已经获得与野生型朱栾倍半萜合酶产生的朱栾倍半萜相比，产生少得多的大根香叶烯A的朱栾倍半萜合酶突变体。

表2中的数据证明，与野生型朱栾倍半萜合酶相比，含有至少两个点突变的本发明朱栾倍半萜合酶突变体也显示明显改善的体外朱栾倍半萜生产率，范围从100.6%(ValC:V436W,L449Y)至266.7%(ValC:Q463S,F488S)。

实施例3：构建表达改进的朱栾倍半萜合酶突变体的类球红细菌菌株

描述质粒pJ241-59440-mev A2415 T4088 mod1中的新合成的甲 羟戊酸操纵子

含有来自产玉米黄素副球菌的修饰形式的甲羟戊酸操纵子的DNA合成片段(在WO 06/018211和Humbelin,M等人,Gene(2002)297:129-139[登录号AJ431696]中描述)从DNA2.0购买，并插入pJ241中(来自DNA2.0专利质粒)。该质粒命名为pJ241-59440-mev_A2415_T4088_mod1并且其核苷酸序列在SEQ IDNO:6中显示。与野生型核苷酸序列相比，意在促进其他克隆步骤并通过沉默突变实现的修饰涉及在甲羟戊酸操纵子插入物(SEQ ID NO:6中的位置1240至位置7875)内移除限制性酶BamHI、BglII、EcoRI和NdeI的识别位点并且引入限制性酶KpnI和XhoI的单一识别位点。

将新合成的甲羟戊酸操纵子亚克隆入基于pBBR的质粒，产生质 粒p-mevAT-PcrtE-trx

用AseI消化质粒pBBR-K-mev-op-4-89-PcrtE-trx-valFpoR-rev(在专利申请国际专利申请号PCT/NL2010/050848和欧洲专利申请号EP09174999.0中描述)，并且将较大片段分离并且自我连接，产生质粒p-m-489-PcrtE-trx。将新质粒用ZraI切开并且分离6,636bp片段。质粒pJ241-59440-mev_A2415_T4088_mod1也用ZraI切开并且将5,569bp片段分离并且与源自p-m-489-PcrtE-trx的6,636bp片段连接。对新构建体检查是否以正确取向插入并且将其命名为p-mevAT-PcrtE-trx。

通过插入编码本发明朱栾倍半萜合酶突变体和野生型朱栾倍半萜 合酶的基因至质粒p-mevAT-PcrtE-trx中构建质粒 p-mevAT-PcrtE-trx-ValC mutant和p-mevAT-PcrtE-trx-ValC wt

从DNA 2.0(Menlo Park，CA，USA)获得在通用克隆载体pJ201(专利载体DNA2.0)中的合成DNA片段，所述片段具有编码本发明朱栾倍半萜合酶突变体(ValC_mutant)的基因并具有编码朱栾倍半萜合酶野生型(ValC_wt，SEQ ID NO:2)的基因。所述朱栾倍半萜合酶基因已经由DNA2.0进行密码子优化以改善在红细菌属中的表达。所述质粒命名为pJ201:ValC_mutant或pJ201:ValC_wt。pJ201:ValC_wt的核苷酸序列在SEQ ID NO:7中显示。pJ201:ValC_mutant质粒的核苷酸序列与pJ201:ValC_wt相同，不同在于形成本发明朱栾倍半萜合酶突变体所需要的核苷酸置换。

将质粒p-mevAT-PcrtE-trx用AseI和BamHI切开并且分离12,136bp片段。用NdeI和BamHI切割质粒pJ201:ValC_mutant(见表3，列2)和质粒pJ201:ValC_wt，并且将1,777bp片段分离并且与来自p-mevAT-PcrtE-trx的12,136bp片段连接，产生表3第3列中列出的18个p-mevAT-PcrtE-trx-ValC_mutant质粒和p-mevAT-PcrtE-trx-ValC_wt。

通过将质粒p-mevAT-PcrtE-trx-ValC突变体中合成的甲羟戊酸操 纵子mev A2415 T4088mod1替换为甲羟戊酸操纵子mev-op-4-89，构 建质粒p-m-4-89-PcrtE-trx-ValC mutant

质粒p-m-4-89-PcrtE-trx-valC-opt是与pBBR-K-mev-op-4-89-PcrtE-trx-valFpoR-rev基本上相同的质粒，差异在于以下事实：来自pBBR-K-mev-op-4-89-PcrtE-trx-valFpoR-rev的valF编码区由valC-opt编码区(PCT/NL2010/050848和EP09174999中的SEQ IDNO:18，所述序列通过引用方式并入本文)替换。

将质粒p-m-4-89-PcrtE-trx-valC-opt用ZraI、BlpI和SacI切开并且分离6,739bp ZraI-BlpI片段。p-mevAT-PcrtE-trx-ValC_mutant质粒(表3，第3列)用ZraI、BlpI和AsiSI切割，并且分离7,234bpZraI-BlpI片段。随后将这些片段与来自p-m-4-89-PcrtE-trx-valC-opt的6,739bp片段连接，产生质粒p-m-4-89-PcrtE-trx-ValC_mutant(表4，第3列)。

构建表达甲羟戊酸途径和本发明的突变体朱栾倍半萜合酶的类球 红细菌Rs265-9c菌株

大肠杆菌S17-1用表4第3列中显示的质粒转化，并且通过接合，所得到的菌株用来将所述质粒转移至类球红细菌Rs265-9c中，如PCT/NL2010/050848和EP09174999中所述。

表3.从源自pJ201:mutant质粒的12,136bp p-mevAT-PcrtE-trx片段和1,777bp片段构建的质粒的命名

表4.从源自p-mevAT-PcrtE-trx-valC_Mutant质粒的6,739bpp-m-4-89-PcrtE-trx-ValC-opt片段和7234bp片段构建的质粒的命名

实施例4：标准摇瓶条件下类球红细菌菌株的培养和朱栾倍半萜生产的评价

冷冻细胞贮藏物的制备

通过引入一满环的冷冻细胞至含有50mg/L卡那霉素(如果适用于质粒维持)的2mL RS102培养基中，制备类球红细菌菌株的冷冻细胞贮藏物。将预培养物在30℃培育，以220转/分钟培育24小时。将250μL等分试样的预培养物转移至含有50mg/L卡那霉素的25mLRS102培养基以启动(t=0)生长。将25mL主培养物在250-mL带挡板的锥形瓶中在30℃培育约24小时，伴以220转/分钟。细菌细胞培养物与无菌无水丙三醇和无菌水混合，从而达到丙三醇最终含量为25%以及最终在660纳米的光密度(OD₆₆₀)为12。将所得到的细胞悬液以1.2mL等分试样无菌分配于2mL冷冻管中，随后在-80℃冷冻直至使用。

摇瓶程序

通过引入250μL融化和均化的冷冻细胞贮藏物至含有50mg/L卡那霉素(如果适用于质粒维持)的25mL RS102培养基中，启动类球红细菌菌株的接种。将预培养物在250-mL带挡板的锥形瓶中在30℃培育24-28小时，伴以220转/分钟。将合适等分试样的预培养物转移至含有50mg/L卡那霉素(如果适用于质粒维持)的22.5mL RS102培养基以启动(t=0)摇瓶实验，初始660nm光密度(OD₆₆₀)为0.16。将主培养物在250-mL带挡板的锥形瓶中在30℃培育，伴以220转/分钟。在培育8小时后，将2.5mL正十二烷添加至细菌培养物。在30℃伴以220转/分钟搅拌，摇瓶培育从接种起继续72小时。每份种子培养物用于接种两个重复摇瓶，所述摇瓶具有25mL完整培养液的终体积，所述完整培养液由培养基和用于原位回收产物的正十二烷组成。将样品(0.5mL)双相培养培养液以24小时间隔取出并且分析上清液中的生长(OD₆₆₀)、pH和葡萄糖。在实验结束时(t=72小时)，对双相培养培养液分析朱栾倍半萜的存在(见以下分析方法)。在实验结束时，将10μL培养液无菌涂布于通用培养计数琼脂平板(Becton Dickinson GmbH，海德堡，德国)并在37℃温育24小时以检验污染。

分析方法

用于分析完整培养液中类异戊二烯含量的样品制备

以一般程序，将400μL完整培养液样品转移至15mL一次性无菌聚丙烯锥形管，用4mL丙酮处理，在IKA Vibrax回转摇床上以1,500转/分钟剧烈振摇20分钟，随后在环境温度于台式超声波浴中温育30分钟。最后，将样品以最大速度离心并且将上清液转移至琥珀色色谱进样小瓶以便由气相色谱分析(见下文)。基于使用如下制备的可靠朱栾倍半萜标准溶液建立的校正曲线确定产物产率：将0.5mL可靠朱栾倍半萜添加至10mL体积烧瓶中并且用分析级正十二烷溶解。将等分试样的朱栾倍半萜标准溶液(20、40和80μl)转移至15mL一次性无菌聚丙烯锥形管，用去离子化无菌水(分别是380、360和320μL)和4mL丙酮处理。将每种混合物在涡旋混合振荡器上剧烈混匀，随后转移至琥珀色色谱进样小瓶以由气相色谱分析，从中推导出校正曲线。

气相色谱

在配备Restek Rtx-5Sil MS毛细管柱(30.0m x0.28mm x0.5μm)的Hewlett-PackardGC6890仪上进行气相色谱。进样器和FID检测器温度分别设定至300℃和250℃。经过柱的气体流速设定在1.5ml/分钟。初始炉温维持在70℃持续0.5分钟，以速率20℃/分钟增加至150℃，随后以速率5℃/分钟增加至205℃，进一步以速率40℃/分钟增加至300℃，随后冷却至60℃并且在这个温度维持3分钟直至下一次进样。注射的样品体积是1μL，分流比4:1。基于对可靠样品建立的校正曲线确定产物产率。大根香叶烯A作为β-榄香烯被检测并且采用针对朱栾倍半萜确定的响应系数定量。从完整培养液分析中外推有机相中朱栾倍半萜和β-榄香烯的含量。相对于正十二烷的测量浓度，确定完整培养液中朱栾倍半萜和β-榄香烯的测量浓度。

实施例5：黄扁柏(C.nootkatensis)朱栾倍半萜合酶在酵母中的体内表达

用引物65-3ATGDuetFw 5′-tatatggatccATGGCTGAAATGTTTAATGGAAATTCCAGC-3′(BamHI识别位点加下划线)和DuetAS1 5′-GATTATGCGGCCGTGTACAA-3′以如国际专利申请号PCT/NL2010/050848的实施例9中所述的方式从质粒pAC-65-3扩增出编码黄扁柏朱栾倍半萜合酶的全长可读框(ValC，SEQ ID NO:2)，所述实施例通过引用方式并入本文。使用公知常识和本文中公开的信息，可以在酵母中以相似的方式表达这种朱栾倍半萜合酶的变体，如包含如SEQ ID NO:3或4中所示序列的朱栾倍半萜合酶。

实施例6：ValC在植物中的表达

以如国际专利申请号PCT/NL2010/050848的实施例10中所述方式在植物中表达包含SEQ ID NO:2的序列的朱栾倍半萜合酶，所述实施例通过引用方式并入本文。应用公知常识和本文中公开的信息，可以在植物中以相似的方式表达这种朱栾倍半萜合酶的变体，如包含如SEQ ID NO:3或4中所示序列的朱栾倍半萜合酶。

序列

SEQ ID NO：1

valC

黄扁柏(Chamaecyparis nootkatensis)

核苷酸序列

ATGGCTGAAATGTTTAATGGAAATTCCAGCAATGATGGAAGTTCTTGCATGCCCGTGAAGGACGCCCTTCGTC

GGACTGGAAATCATCATCCTAACTTGTGGACTGATGATTTCATACAGTCCCTCAATTCTCCATATTCGGATTC

TTCATACCATAAACATAGGGAAATACTAATTGATGAGATTCGTGATATGTTTTCTAATGGAGAAGGCGATGAG

TTCGGTGTACTTGAAAATATTTGGTTTGTTGATGTTGTACAACGTTTGGGAATAGATCGACATTTTCAAGAGG

AAATCAAAACTGCACTTGATTATATCTACAAGTTCTGGAATCATGATAGTATTTTTGGCGATCTCAACATGGT

GGCTCTAGGATTTCGGATACTACGACTGAATAGATATGTCGCTTCTTCAGATGTTTTTAAAAAGTTCAAAGGT

GAAGAAGGACAATTCTCTGGTTTTGAATCTAGCGATCAAGATGCAAAATTAGAAATGATGTTAAATTTATATA

AAGCTTCAGAATTAGATTTTCCTGATGAAGATATCTTAAAAGAAGCAAGAGCGTTTGCTTCTATGTACCTGAA

ACATGTTATCAAAGAATATGGTGACATACAAGAATCAAAAAATCCACTTCTAATGGAGATAGAGTACACTTTT

AAATATCCTTGGAGATGTAGGCTTCCAAGGTTGGAGGCTTGGAACTTTATTCATATAATGAGACAACAAGATT

GCAATATATCACTTGCCAATAACCTTTATAAAATTCCAAAAATATATATGAAAAAGATATTGGAACTAGCAAT

ACTGGACTTCAATATTTTGCAGTCACAACATCAACATGAAATGAAATTAATATCCACATGGTGGAAAAATTCA

AGTGCAATTCAATTGGATTTCTTTCGGCATCGTCACATAGAAAGTTATTTTTGGTGGGCTAGTCCATTATTTG

AACCTGAGTTCAGTACATGTAGAATTAATTGTACCAAATTATCTACAAAAATGTTCCTCCTTGACGATATTTA

TGACACATATGGGACTGTTGAGGAATTGAAACCATTCACAACAACATTAACAAGATGGGATGTTTCCACAGTT

GATAATCATCCAGACTACATGAAAATTGCTTTCAATTTTTCATATGAGATATATAAGGAAATTGCAAGTGAAG

CCGAAAGAAAGCATGGTCCCTTTGTTTACAAATACCTTCAATCTTGCTGGAAGAGTTATATCGAGGCTTATAT

GCAAGAAGCAGAATGGATAGCTTCTAATCATATACCAGGTTTTGATGAATACTTGATGAATGGAGTAAAAAGT

AGCGGCATGCGAATTCTAATGATACATGCACTAATACTAATGGATACTCCTTTATCTGATGAAATTTTGGAGC

AACTTGATATCCCATCATCCAAGTCGCAAGCTCTTCTATCATTAATTACTCGACTAGTGGATGATGTCAAAGA

CTTTGAGGATGAACAAGCTCATGGGGAGATGGCATCAAGTATAGAGTGCTACATGAAAGACAACCATGGTTCT

ACAAGGGAAGATGCTTTGAATTATCTCAAAATTCGTATAGAGAGTTGTGTGCAAGAGTTAAATAAGGAGCTTC

TCGAGCCTTCAAATATGCATGGATCTTTTAGAAACCTATATCTCAATGTTGGCATGCGAGTAATATTTTTTAT

GCTCAATGATGGTGATCTCTTTACACACTCCAATAGAAAAGAGATACAAGATGCAATAACAAAATTTTTTGTG

GAACCAATCATTCCATAG

SEQ ID NO：2

ValC

黄扁柏(Chamaecyparis nootkatensis)

氨基酸序列

MAEMFNGNSSNDGSSCMPVKDALRRTGNHHPNLWTDDFIQSLNSPYSDSSYHKHREILIDEIRDMFSNGEGDE

FGVLENIWFVDVVQRLGIDRHFQEEIKTALDYIYKFWNHDSIFGDLNMVALGFRILRLNRYVASSDVFKKFKG

EEGQFSGFESSDQDAKLEMMLNLYKASELDFPDEDILKEARAFASMYLKHVIKEYGDIQESKNPLLMEIEYTF

KYPWRCRLPRLEAWNFIHIMRQQDCNISLANNLYKIPKIYMKKILELAILDFNILQSQHQHEMKLISTWWKNS

SAIQLDFFRHRHIESYFWWASPLFEPEFSTCRINCTKLSTKMFLLDDIYDTYGTVEELKPFTTTLTRWDVSTV

DNHPDYMKIAFNFSYEIYKEIASEAERKHGPFVYKYLQSCWKSYIEAYMQEAEWIASNHIPGFDEYLMNGVKS

SGMRILMIHALILMDTPLSDEILEQLDIPSSKSQALLSLITRLVDDVKDFEDEQAHGEMASSIECYMKDNHGS

TREDALNYLKIRIESCVQELNKELLEPSNMHGSFRNLYLNVGMRVIFFMLNDGDLFTHSNRKEIQDAITKFFV

EPIIP

SEQ ID NO：3

MAEMFNGNSSNDGSSXMPVKDALRRTGNHHPNLWTDDFIQSLNSPYSDSSYHKHREILIDEIRDMFSNGEGDE

FGVLENIWFVDVVQRLGIDRHFQEEIKTALDYIYKFWNHDSIFGDLNMVALGFRXLRLNRYVASSDVFKKFKG

EEGQFSGFESSDQDAKLEMMLNLYXASELDFPDEDILKEAXAFASMYLKHVIKEYGDIQESKNPLLMEIEYTF

KYPWRXRLPRLEAWNFIHIMRQQDXNISLANNLYKIPKIYMKKILELAILDFNILQSQHQHEMKLISTWWKNS

SAIQLDFXRXRHIEXYFWWASPLFEPXFSTXRINXTKLXTKXFLLDDIYDTYGTVEELKPFTTTLTRWDVSTV

DNHPDYMKIAFNFSYEIYKEIASEAERKHGPFXYKYLQSXWKSXXEXYMQEAEWIASNHIPGFDEYLMNGXKX

XGMRIXMIHXXXLMDTPLSDEILEXLDIPSSKSQALLSLITRLVDDVKDXEXEXAHGEMASSIXXYMKXNHGS

TREDALNYLKIRIESXVQELNKELLEPSNM HGSFRNLYLNVGMRXIFXXLNDGDXFXXXNRKEIQDAITKFFV

EPIIP

SEQ ID NO：4

MAEMFNGNSSNDGSS(CATS)MPVKDALRRTGNHHPNLWTDDFIQSLNSPYSDSSYHKHREILIDEIRDMFSN

GEGDEFGVLENIWFVDVVQRLGIDRHFQEEIKTALDYIYKFWNHDSIFGDLNMVALGFR(IL)LRLNRYVASS

DVFKKFKGEEGQFSGFESSDQDAKLEMMLNLY(KR)ASELDFPDEDILKEA(RK)AFASMYLKHVIKEYGDIQ

ESKNPLLMEIEYTFKYPWR(CS)RLPRLEAWNFIHIMRQQD(CST)NISLANNLYKIPKIYMKKILELAILDF

NILQSQHQHEMKLISTWWKNSSAIQLDF(FY)R(HD)RHIE(STA)YFWWASPLFEP(EQ)FST(CA)RIN(C

L)TKL(SG)TK(ML)FLLDDIYDTYGTVEELKPFTTTLTRWDVSTVDNHPDYMKIAFNFSYEIYKEIASEAER

KHGPF(VIMT)YKYLQS(CTV)WKS(YF)(IFVL)E(AG)YMQEAEWIASNHIPGFDEYLMNG(VLKTW)K(S

T)(SGA)GMRI(LIV)MIH(AS)(LFIY)(ILMV)LMDTPLSDEILE(QESGW)LDIPSSKSQALLSLITRLV

DDVKD(FYHS)E(DNATF)E(QAK)AHGEMASSI(EQ)(CS)YMK(DEQ)NHGSTREDALNYLKIRIES(CTS

A)VQELNKELLEPSNMHGSFRNLYLNVGMR(VT)IF(FHLV)(ML)LNDGD(LSAG)F(TS)(HIV)(SGAPT

)NRKEIQDAITKFFVEPIIP

SEQ ID NO：5

pACYCDuet：ValC_wt

带有编码野生型朱栾倍半萜合酶的密码子优化基因(valC-opt)的大肠杆菌表达载体pACYCDuet-1

核苷酸序列

GGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTGTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAATAAGGAGATATACCATG

GGCAGCAGCCATCACCATCATCACCACAGCCAGGATCCGCATATGGCCGAAATGTTCAATGGCAATTCCAGCA

ATGATGGCAGCTCCTGCATGCCGGTCAAGGACGCGCTGCGCCGCACCGGGAACCACCATCCGAACCTCTGGAC

CGACGATTTCATCCAGTCGCTGAACTCCCCCTATTCGGATTCCTCGTATCATAAACATCGCGAGATCCTGATC

GATGAGATCCGGGACATGTTCTCCAACGGCGAGGGGGATGAGTTCGGGGTCCTCGAGAACATCTGGTTCGTCG

ACGTGGTCCAGCGGCTGGGCATCGATCGGCACTTCCAGGAAGAGATCAAGACGGCCCTGGATTATATCTATAA

GTTCTGGAACCATGATAGCATCTTCGGCGACCTCAACATGGTGGCGCTGGGGTTCCGCATCCTGCGGCTCAAT

CGCTACGTGGCGTCGTCGGACGTGTTCAAGAAGTTCAAGGGCGAGGAGGGCCAGTTCTCGGGGTTCGAGAGCA

GCGATCAGGACGCCAAGCTGGAGATGATGCTGAACCTCTACAAGGCCTCGGAACTCGACTTCCCGGATGAGGA

CATCCTCAAGGAAGCGCGGGCCTTCGCGTCGATGTATCTCAAGCATGTCATCAAGGAGTATGGGGACATCCAG

GAATCGAAGAACCCCCTGCTCATGGAGATCGAGTACACCTTCAAGTACCCCTGGCGCTGCCGCCTCCCGCGGC

TGGAGGCGTGGAACTTCATCCACATCATGCGGCAGCAGGACTGCAATATCTCGCTCGCCAACAACCTCTATAA

GATCCCGAAGATCTATATGAAGAAGATCCTGGAGCTGGCGATCCTCGACTTCAACATCCTCCAGAGCCAGCAT

CAGCATGAGATGAAACTGATCAGCACGTGGTGGAAGAACTCGTCCGCGATCCAGCTCGACTTCTTCCGCCACC

GCCATATCGAGAGCTACTTCTGGTGGGCCAGCCCGCTGTTCGAGCCCGAGTTCTCCACCTGCCGCATCAACTG

CACCAAGCTGTCCACCAAGATGTTCCTCCTGGACGACATCTATGACACGTACGGGACCGTCGAGGAACTCAAG

CCGTTCACGACCACCCTCACGCGCTGGGATGTCAGCACGGTGGACAATCACCCGGACTACATGAAGATCGCGT

TCAATTTCTCCTACGAGATCTACAAGGAGATCGCGTCCGAGGCCGAGCGCAAGCACGGCCCGTTCGTGTATAA

GTATCTCCAGTCGTGCTGGAAGTCGTATATCGAGGCGTATATGCAGGAGGCCGAGTGGATCGCCTCCAACCAC

ATCCCCGGCTTCGACGAGTACCTGATGAATGGCGTGAAGAGCTCGGGGATGCGCATCCTCATGATCCATGCGC

TGATCCTGATGGATACGCCCCTGTCCGACGAGATCCTCGAGCAGCTCGACATCCCGAGCAGCAAGAGCCAGGC

CCTGCTGTCGCTCATCACGCGGCTCGTCGATGATGTGAAGGATTTCGAGGACGAGCAGGCGCATGGGGAGATG

GCCTCGTCGATCGAATGCTATATGAAGGATAATCACGGCTCCACGCGCGAGGACGCCCTGAACTACCTGAAAA

TCCGCATCGAGAGCTGCGTGCAGGAGCTCAACAAGGAACTCCTCGAACCGAGCAACATGCATGGCAGCTTCCG

CAACCTGTACCTCAACGTGGGCATGCGGGTGATCTTCTTCATGCTGAACGACGGGGACCTCTTCACCCATTCG

AATCGGAAGGAGATCCAGGATGCGATCACGAAGTTCTTCGTGGAACCGATCATCCCGTGATAAGGATCCCTGC

AGGTCGACAAGCTTGCGGCCGCATAATGCTTAAGTCGAACAGAAAGTAATCGTATTGTACACGGCCGCATAAT

CGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCATCTTAGTATATTAGTTAAGT

ATAAGAAGGAGATATACATATGGCAGATCTCAATTGGATATCGGCCGGCCACGCGATCGCTGACGTCGGTACC

CTCGAGTCTGGTAAAGAAACCGCTGCTGCGAAATTTGAACGCCAGCACATGGACTCGTCTACTAGCGCAGCTT

AATTAACCTAGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAG

GGGTTTTTTGCTGAAACCTCAGGCATTTGAGAAGCACACGGTCACACTGCTTCCGGTAGTCAATAAACCGGTA

AACCAGCAATAGACATAAGCGGCTATTTAACGACCCTGCCCTGAACCGACGACCGGGTCGAATTTGCTTTCGA

ATTTCTGCCATTCATCCGCTTATTATCACTTATTCAGGCGTAGCACCAGGCGTTTAAGGGCACCAATAACTGC

CTTAAAAAAATTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTGTAATTCATTAAGCATTCTGCCGACATG

GAAGCCATCACAGACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATAT

TTGCCCATAGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCA

CCCAGGGATTGGCTGAGACGAAAAACATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTA

ACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAA

AACGTTTCAGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTT

TCATTGCCATACGGAACTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTT

GTGCTTATTTTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGA

GCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGA

TTTTTTTCTCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCGATAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGTGATCT

TATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCGATCAACGTCTCATTTTCGCCAAAAGTTGGCCCAG

GGCTTCCCGGTATCAACAGGGACACCAGGATTTATTTATTCTGCGAAGTGATCTTCCGTCACAGGTATTTATT

CGGCGCAAAGTGCGTCGGGTGATGCTGCCAACTTACTGATTTAGTGTATGATGGTGTTTTTGAGGTGCTCCAG

TGGCTTCTGTTTCTATCAGCTGTCCCTCCTGTTCAGCTACTGACGGGGTGGTGCGTAACGGCAAAAGCACCGC

CGGACATCAGCGCTAGCGGAGTGTATACTGGCTTACTATGTTGGCACTGATGAGGGTGTCAGTGAAGTGCTTC

ATGTGGCAGGAGAAAAAAGGCTGCACCGGTGCGTCAGCAGAATATGTGATACAGGATATATTCCGCTTCCTCG

CTCACTGACTCGCTACGCTCGGTCGTTCGACTGCGGCGAGCGGAAATGGCTTACGAACGGGGCGGAGATTTCC

TGGAAGATGCCAGGAAGATACTTAACAGGGAAGTGAGAGGGCCGCGGCAAAGCCGTTTTTCCATAGGCTCCGC

CCCCCTGACAAGCATCACGAAATCTGACGCTCAAATCAGTGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACC

AGGCGTTTCCCCTGGCGGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCTGCCTTTCGGTTTACCGGTGTCATTCCGCTG

TTATGGCCGCGTTTGTCTCATTCCACGCCTGACACTCAGTTCCGGGTAGGCAGTTCGCTCCAAGCTGGACTGT

ATGCACGAACCCCCCGTTCAGTCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGAAA

GACATGCAAAAGCACCACTGGCAGCAGCCACTGGTAATTGATTTAGAGGAGTTAGTCTTGAAGTCATGCGCCG

GTTAAGGCTAAACTGAAAGGACAAGTTTTGGTGACTGCGCTCCTCCAAGCCAGTTACCTCGGTTCAAAGAGTT

GGTAGCTCAGAGAACCTTCGAAAAACCGCCCTGCAAGGCGGTTTTTTCGTTTTCAGAGCAAGAGATTACGCGC

AGACCAAAACGATCTCAAGAAGATCATCTTATTAATCAGATAAAATATTTCTAGATTTCAGTGCAATTTATCT

CTTCAAATGTAGCACCTGAAGTCAGCCCCATACGATATAAGTTGTAATTCTCATGTTAGTCATGCCCCGCGCC

CACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCCCGGTGCCTAATGAGTGAGCT

AACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATG

AATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGAC

GGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCC

AGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATC

CCACTACCGAGATGTCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTG

ATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGAC

ATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAG

CCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGAC

CAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAG

ACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGAT

AGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCT

TCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGC

GACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTG

CCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTG

GCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTT

ACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGC

GCCATTCGATGGTGTCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAATTAATACGACTCA

CTATA

SEQ ID NO：6

pJ241-59440-mev_A2415_T4088_mod1

具有克隆至载体pJ241中的修饰形式的产玉米黄素副球菌甲羟戊酸操纵子的DNA合成片段

核苷酸序列

TAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAA

AAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTC

TGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAG

AAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAA

CAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTG

AGCGAGGCGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAGTGCAACCGGCGCAGGAAC

ACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAACGCTGTTTTTCCGG

GGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGTGGCATAAA

TTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGA

AACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAAGCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAG

CCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGACGTTTCCCGTTGAATATG

GCTCATATTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTT

GAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGAACATTATCGCGA

GCCCATTTATACCTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCACCTG

ACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGACTCCCCATGCGAGAGTAGG

GAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGCCCGGGCTAATTAGGGGG

TGTCGCCCTTATTCGACTCTATAGTGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCTGAAGTGGGGACGT

CTCGATTCTGCCCGCGAAGAATGCGATGCATCCAGATGATGCAGAACGAAGAAGCGGAAGCGCCCGTGAAAGA

CCAGATGATTTCCCATACCCCGGTGCCCACGCAATGGGTCGGCCCGATCCTGTTCCGCGGCCCCGTCGTCGAG

GGCCCGATCAGCGCGCCGCTGGCCACCTACGAGACGCCGCTCTGGCCCTCGACCGCGCGGGGGGCAGGGGTTT

CCCGGCATTCGGGCGGCATCCAGGTCTCGCTGGTCGACGAACGCATGAGCCGCTCGATCGCGCTGCGGGCGCA

TGACGGGGCGGCGGCGACCGCCGCCTGGCAGTCGATCAAGGCCCGCCAGGAAGAGGTCGCGGCCGTGGTCGCC

ACCACCAGCCGCTTCGCCCGCCTTGTCGAGCTGAATCGCCAGATCGTGGGCAACCTGCTTTACATCCGCATCG

AATGCGTGACGGGCGACGCCTCGGGTCACAACATGGTCACCAAGGCCGCCGAGGCCGTGCAGGGCTGGATTCT

GTCGGAATACCCGATGCTGGCCTATTCCACGATCTCGGGGAACCTGTGCACCGACAAGAAGGCGTCGGCGGTC

AACGGCATCCTGGGCCGCGGCAAATACGCCGTCGCCGAGGTCGAGATCCCGCGCAAGATCCTGACCCGCGTGC

TGCGCACCAGCGCCGAGAAGATGGTCCGCCTGAACTACGAGAAGAACTATGTCGGGGGTACGCTGGCGGGGTC

GCTGCGCAGTGCGAACGCGCATTTCGCCAACATGCTGCTGGGCTTCTACCTGGCGACGGGGCAGGACGCGGCC

AACATCATCGAGGCCAGCCAGGGCTTCGTCCATTGCGAGGCCCGCGGCGAGGATCTGTATTTCTCGTGCACGC

TGCCCAACCTCATCATGGGCTCGGTCGGTGCCGGCAAGGGCATCCCCTCGATCGAGGAGAACCTGTCGCGGAT

GGGCTGCCGCCAGCCGGGCGAACCCGGCGACAACGCGCGCCGTCTTGCGGCGATCTGCGCGGGCGTCGTGCTG

TGTGGTGAATTGTCGCTGCTTGCGGCCCAGACCAACCCCGGAGAGTTGGTCCGCACCCACATGGAGATGGAGC

GATGACCGACAGCAAGGATCACCATGTCGCGGGGCGCAAGCTGGACCATCTGCGTGCATTGGACGACGATGCG

GATATCGACCGGGGCGACAGCGGCTTCGACCGCATCGCGCTGACCCATCGCGCCCTGCCCGAGGTGGATTTCG

ACGCCATCGACACGGCGACCAGCTTCCTGGGCCGTGAACTGTCCTTCCCGCTGCTGATCTCGTCCATGACCGG

CGGCACCGGCGAGGAGATCGAGCGCATCAACCGCAACCTGGCCGCTGGTGCCGAGGAGGCCCGCGTCGCCATG

GCGGTGGGCTCGCAGCGCGTGATGTTCACCGACCCCTCGGCGCGGGCCAGCTTCGACCTGCGCGCCCATGCGC

CCACCGTGCCGCTGCTGGCCAATATCGGCGCGGTGCAGCTGAACATGGGGCTGGGGCTGAAGGAATGCCTGGC

CGCGATCGAGGTGCTGCAGGCGGACGGCCTGTATCTGCACCTGAACCCCCTGCAAGAGGCCGTCCAGCCCGAG

GGGGATCGCGACTTTGCCGATCTGGGCAGCAAGATCGCGGCCATCGCCCGCGACGTTCCCGTGCCCGTCCTGC

TGAAGGAGGTGGGCTGCGGCCTGTCGGCGGCCGATATCGCCATCGGGCTGCGCGCCGGCATCCGGCATTTCGA

CGTGGCCGGTCGCGGCGGCACATCCTGGAGCCGGATCGAGTATCGCCGCCGCCAGCGGGCCGATGACGACCTG

GGCCTGGTCTTCCAGGACTGGGGCCTGCAGACCGTGGACGCCCTGCGCGAGGCGCGGCCCGCGCTTGCGGCCC

ATGATGGAACCAGCGTGCTGATCGCCAGCGGCGGCATCCGCAACGGTGTCGACATGGCGAAATGCGTCATCCT

GGGGGCCGACATGTGCGGGGTCGCCGCGCCCCTGCTGAAAGCGGCCCAAAACTCGCGCGAGGCGGTTGTATCC

GCCATCCGGAAACTGCATCTGGAGTTCCGGACAGCCATGTTCCTCCTGGGTTGCGGCACGCTTGCCGACCTGA

AGGACAATTCCTCGCTTATCCGTCAATGAAAGTGCCTAAGATGACCGTGACAGGAATCGAAGCGATCAGCTTC

TACACCCCCCAGAACTACGTGGGACTGGATATCCTTGCCGCGCATCACGGGATCGACCCCGAGAAGTTCTCGA

AGGGGATCGGGCAGGAGAAAATCGCACTGCCCGGCCATGACGAGGATATCGTGACCATGGCCGCCGAGGCCGC

GCTGCCGATCATCGAACGCGCGGGTACCCAGGGCATCGACACGGTTCTGTTCGCCACCGAGAGCGGGATCGAC

AAGTCGAAGGCCGCCGCCATCTATCTGCGCCGCCTGCTGGACCTGTCGCCCAACTGCCGTTGCGTCGAGCTGA

AGCAGGCCTGCTATTCCGCGACGGCGGCGCTGCAGATGGCCTGCGCGCATGTCGCCCGCAAGCCCGACCGCAA

GGTGCTGGTGATCGCGTCCGATGTCGCGCGCTATGACCGCGAAAGCTCGGGCGAGGCGACGCAGGGTGCGGGC

GCCGTCGCCATCCTTGTCAGCGCCGATCCCAAGGTGGCCGAGATCGGCACCGTCTCGGGGCTGTTCACCGAGG

ATATCATGGATTTCTGGCGGCCGAACCACCGCCGCACGCCCCTGTTCGACGGCAAGGCATCGACGCTGCGCTA

TCTGAACGCGCTGGTCGAGGCGTGGAACGACTATCGCGCGAATGGCGGCCACGAGTTCGCCGATTTCGCGCAT

TTCTGCTATCACGTGCCGTTCTCGCGGATGGGCGAGAAGGCGAACAGCCACCTGGCCAAGGCGAACAAGACGC

CGGTGGACATGGGGCAGGTGCAGACGGGCCTGATCTACAACCGGCAGGTCGGGAACTGCTATACCGGGTCGAT

CTACCTGGCATTCGCCTCGCTGCTGGAGAACGCTCAGGAGGACCTGACCGGCGCGCTGGTCGGTCTGTTCAGC

TATGGCTCGGGTGCGACGGGCGAGTTCTTCGATGCGCGGATCGCGCCCGGTTACCGCGACCACCTGTTCGCGG

AACGCCATCGCGAATTGCTGCAGGATCGCACGCCCGTCACGTATGACGAATACGTTGCCCTGTGGGACGAGAT

CGACCTGACGCAGGGCGCGCCCGACAAGGCGCGCGGTCGTTTCAGGCTGGCAGGTATCGAGGACGAGAAGCGC

ATCTATGTCGACCGGCAGGCCTGAAGCAGGCGCCCATGCCCCGGGCAAGCTGATCCTGTCCGGGGAACATTCC

GTGCTCTATGGTGCGCCCGCGCTTGCCATGGCCATCGCCCGCTATACCGAGGTGTGGTTCACGCCGCTTGGCA

TTGGCGAGGGGATACGCACGACATTCGCCAATCTCTCGGGCGGGGCGACCTATTCGCTGAAGCTGCTGTCGGG

GTTCAAGTCGCGGCTGGACCGCCGGTTCGAGCAGTTCCTGAACGGCGACCTAAAGGTGCACAAGGTCCTGACC

CATCCCGACGATCTGGCGGTCTATGCGCTGGCGTGGCTTCTGCACGACAAGCCGCCGGGGACCGCCGCGATGC

CGGGCATCGGCGCGATGCACCACCTGCCGCGACCGGGTGAGCTGGGCAGCCGGACGGAGCTGCCCATCGGCGC

GGGCATGGGGTCGTCTGCGGCCATCGTCGCGGCCACCACGGTCCTGTTCGAGACGCTGCTGGACCGGCCCAAG

ACGCCCGAACAGCGCTTCGACCGCGTCCGCTTCTGCGAGCGGTTGAAGCACGGCAAGGCCGGTCCCATCGACG

CGGCCAGCGTCGTGCGCGGCGGGCTTGTCCGCGTGGGCGGGAACGGGCCGGGTTCGATCAGCAGCTTCGATTT

GCCCGAGGATCACGACCTTGTCGCGGGACGCGGCTGGTACTGGGTACTGCACGGGCGCCCCGTCAGCGGGACC

GGCGAATGCGTCAGCGCGGTCGCGGCGGCGCATGGTCGCGATGCGGCGCTGTGGGACGCCTTCGCAGTCTGCA

CCCGCGCGTTGGAGGCCGCGCTGCTGTCTGGGGGCAGCCCCGACGCCGCCATCACCGAGAACCAGCGCCTGCT

CGAGCGCATCGGCGTCGTGCCGGCAGCGACGCAGGCCCTCGTGGCCCAGATCGAGGAGGCGGGTGGCGCGGCC

AAAATCTGCGGCGCAGGTTCCGTGCGGGGCGATCACGGCGGGGCGGTCCTCGTGCGGATTGACGACGCGCAGG

CGATGGCTTCGGTCATGGCGCGCCATCCCGACCTCGACTGGGCGCCCCTGCGCATGTCGCGCACGGGGGCGGC

ACCCGGCCCCGCGCCGCGTGCGCAACCGCTGCCGGGGCAGGGCTGATGGATCAGGTCATCCGCGCCAGCGCGC

CGGGTTCGGTCATGATCACGGGCGAACATGCCGTGGTCTATGGACACCGCGCCATCGTCGCCGGGATCGAGCA

GCGCGCCCATGTGACGATCGTCCCGCGTGCCGACCGCATGTTTCGCATCACCTCGCAGATCGGGGCGCCGCAG

CAGGGGTCGCTGGACGATCTGCCTGCGGGCGGGACCTATCGCTTCGTGCTGGCCGCCATCGCGCGACACGCGC

CGGACCTGCCTTGCGGGTTCGACATGGACATCACCTCGGGGATCGATCCGAGGCTCGGGCTTGGGTCCTCGGC

GGCGGTGACGGTCGCCTGCCTCGGCGCGCTGTCGCGGCTGGCGGGGCGGGGGACCGAGGGGCTGCATGACGAC

GCGCTGCGCATCGTCCGCGCCATCCAGGGCAGGGGCAGCGGGGCCGATCTGGCGGCCAGCCTGCATGGCGGCT

TCGTCGCCTATCGCGCGCCCGATGGCGGTGCCGCGCAGATCGAGGCGCTTCCGGTGCCGCCGGGGCCGTTCGG

CCTGCGCTATGCGGGCTACAAGACCCCGACAGCCGAGGTGCTGCGCCTTGTGGCCGATCGGATGGCGGGCAAC

GAGGCCGCTTTCGACGCGCTCTACTCCCGGATGGGCGCAAGCGCAGATGCCGCGATCCGCGCGGCGCAAGGGC

TGGACTGGGCTGCATTCCACGACGCGCTGAACGAATACCAGCGCCTGATGGAGCAGCTGGGCGTGTCCGACGA

CACGC TGGACGCGATCATCCGCGAGGCGCGCGACGCGGGCGCCGCAGTCGCCAAAATCTCCGGCTCGGGGC TG

GGGGATTGCGTGCTGGCACTGGGCGACCAGCCCAAGGGTTTCGTGCCCGCAAGCATTGCCGAGAAGGGACTTG

TTTTCGATGACTGATGCCGTCCGCGACATGATCGCCCGTGCCATGGCGGGCGCGACCGACATCCGAGCAGCCG

AGGCTTATGCGCCCAGCAACATCGCGCTGTCGAAATACTGGGGCAAGCGCGACGCCGCGCGGAACCTTCCGCT

GAACAGCTCCGTCTCGATCTCGTTGGCGAACTGGGGCTCTCATACGCGGGTCGAGGGGTCCGGCACGGGCCAC

GACGAGGTGCATCACAACGGCACGCTGCTCGATCCGGGCGACGCCTTCGCGCGCCGCGCGTTGGCATTCGCTG

ACCTGTTCCGGGGGGGGAGGCACCTGCCGCTGCGGATCACGACGCAGAACTCGATCCCGACGGCGGCGGGGCT

TGCCTCGTCGGCCTCGGGGTTCGCGGCGCTGACCCGTGCGCTGGCGGGGGCGTTCGGGCTGGATCTGGACGAC

ACGGATCTGAGCCGCATCGCCCGGATCGGCAGTGGCAGCGCCGCCCGCTCGATCTGGCACGGCTTCGTCCGCT

GGAACCGGGGCGAGGCCGAGGATGGGCATGACAGCCACGGCGTCCCGCTGGACCTGCGCTGGCCCGGCTTCCG

CATCGCGATCGTGGCCGTGGACAAGGGGCCCAAGCCTTTCAGTTCGCGCGACGGCATGAACCACACGGTCGAG

ACCAGCCCGCTGTTCCCGCCCTGGCCTGCGCAGGCGGAAGCGGATTGCCGCGTCATCGAGGATGCGATCGCCG

CCCGCGACATGGCCGCCCTGGGTCCGCGGGTCGAGGCGAACGCCCTTGCGATGCACGCCACGATGATGGCCGC

GCGCCCGCCGCTCTGCTACCTGACGGGCGGCAGCTGGCAGGTGCTGGAACGCCTGTGGCAGGCCCGCGCGGAC

GGGCTTGCGGCCTTTGCGACGATGGATGCCGGCCCGAACGTCAAGCTGATCTTCGAGGAAAGCAGCGCCGCCG

ACGTGCTGTACCTGTTCCCCGACGCCAGCCTGATCGCGCCGTTCGAGGGGCGTTGAACGCGTAAGACGACCAC

TGGGTAAGGTTCTGCCGCGCGTGGTCTCGACTGCCTGCAAAGAGGTGCTTGAGTTGCCGCGTGACTGCGGCGG

CCGACTTCGTGGGACTTGCCCGCCACGCTGACGAAGGGCGTAATCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTTTC

AGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGGGCGGCACCTCGCTAACGGATTCACCGTTTTTATCAGGCTCTGGGAGGC

AGAATAAATGATCATATCGTCAATTATTACCTCCACGGGGAGAGCCTGAGCAAACTGGCCTCAGAATTCAAAA

TGAAGTGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCTATAGTGAGTCGAATAAGGGCGACACAAAATTT

ATTCTAAATGCATAATAAATACTGATAACATCTTATAGTTTGTATTATATTTTGTATTATCGTTGACATGTAT

AATTTTGATATCAAAAACTGATTTTCCCTTTATTATTTTCGAGATTTATTTTCTTAATTCTCTTTAACAAACT

AGAAATATTGTATATACAAAAAATCATAAATAATAGATGAATAGTTTAATTATAGGTGTTCATCAATCGAAAA

AGCAACGTATCTTATTTAAAGTGCGTTGCTTTTTTCTCATTTATAAGGTTAAATAATTCTCATATATCAAGCA

AAGTGACAGGGGCCCTTAAATATTCTGACAAATGCTCTTTCCCTAAACTCCCCCCATAAAAAAACCCGGCGAA

GCGGGTTTTTACGTTATTTGCGGATTAACGATTACTCGTTATCAGAACCGCCCAGGGGGCCCGAGCTTAAGAC

TGGCCGTCGTTTTACAACACAGAAAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGGCCATCCGTCAGGGGCCTTCTGCTTA

GTTTGATGCCTGGCAGTTCCCTACTCTCGCCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCG

GCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGA

AAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATA

GGC TCCGCCCCCC TGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATA

AAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATAC

CTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGT

AGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAA

CTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGC

AGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGGCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAG

TATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACA

AACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAA

GATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGACGCGCGCGTAACTCACGTTAAGGGATTTT

GGTCATGAGCTTGCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATGCTCTGCTTT

SEQ ID NO：7

pJ201：ValC_wt

带有编码野生型朱栾倍半萜合酶的密码子优化基因(valC-opt)的大肠杆菌克隆载体pJ201

核苷酸序列

TAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAA

AAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTC

TGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAG

AAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAA

CAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTG

AGCGAGGCGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAGTGCAACCGGCGCAGGAAC

ACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAACGCTGTTTTTCCGG

GGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGTGGCATAAA

TTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGA

AACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAAGCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAG

CCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGGCTCGACGTTTCCCGTTGAATATG

GCTCATATTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTT

GAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGAACATTATCGCGA

GCCCATTTATACCTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCACCTG

ACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGACTCCCCATGCGAGAGTAGG

GAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGCCCGGGCTAATTAGGGGG

TGTCGCCCTTAGGTACGAACTCGATTGACGGGTCTCAAGCTTGTCGACCTGCAGGGATCCTTATCACGGGATG

ATCGGTTCCACGAAGAACTTCGTGATCGCATCCTGGATCTCCTTCCGATTCGAATGGGTGAAGAGGTCCCCGT

CGTTCAGCATGAAGAAGATCACCCGCATGCCCACGTTGAGGTACAGGTTGCGGAAGCTGCCATGCATGTTGCT

CGGTTCGAGGAGTTCCTTGTTGAGCTCCTGCACGCAGCTCTCGATGCGGATTTTCAGGTAGTTCAGGGCGTCC

TCGCGCGTGGAGCCGTGATTATCCTTCATATAGCATTCGATCGACGAGGCCATCTCCCCATGCGCCTGCTCGT

CCTCGAAATCCTTCACATCATCGACGAGCCGCGTGATGAGCGACAGCAGGGCCTGGCTCTTGCTGCTCGGGAT

GTCGAGCTGCTCGAGGATCTCGTCGGACAGGGGCGTATCCATCAGGATCAGCGCATGGATCATGAGGATGCGC

ATCCCCGAGCTCTTCACGCCATTCATCAGGTACTCGTCGAAGCCGGGGATGTGGTTGGAGGCGATCCACTCGG

CCTCCTGCATATACGCCTCGATATACGACTTCCAGCACGACTGGAGATACTTATACACGAACGGGCCGTGCTT

GCGCTCGGCCTCGGACGCGATCTCCTTGTAGATCTCGTAGGAGAAATTGAACGCGATCTTCATGTAGTCCGGG

TGATTGTCCACCGTGCTGACATCCCAGCGCGTGAGGGTGGTCGTGAACGGCTTGAGTTCCTCGACGGTCCCGT

ACGTGTCATAGATGTCGTCCAGGAGGAACATCTTGGTGGACAGCTTGGTGCAGTTGATGCGGCAGGTGGAGAA

CTCGGGCTCGAACAGCGGGCTGGCCCACCAGAAGTAGCTCTCGATATGGCGGTGGCGGAAGAAGTCGAGCTGG

ATCGCGGACGAGTTCTTCCACCACGTGCTGATCAGTTTCATCTCATGCTGATGCTGGCTCTGGAGGATGTTGA

AGTCGAGGATCGCCAGCTCCAGGATCTTCTTCATATAGATCTTCGGGATCTTATAGAGGTTGTTGGCGAGCGA

GATATTGCAGTCCTGCTGCCGCATGATGTGGATGAAGTTCCACGCCTCCAGCCGCGGGAGGCGGCAGCGCCAG

GGGTACTTGAAGGTGTACTCGATCTCCATGAGCAGGGGGTTCTTCGATTCCTGGATGTCCCCATACTCCTTGA

TGACATGCTTGAGATACATCGACGCGAAGGCCCGCGCTTCCTTGAGGATGTCCTCATCCGGGAAGTCGAGTTC

CGAGGCCTTGTAGAGGTTCAGCATCATCTCCAGCTTGGCGTCCTGATCGCTGCTCTCGAACCCCGAGAACTGG

CCCTCCTCGCCCTTGAACTTCTTGAACACGTCCGACGACGCCACGTAGCGATTGAGCCGCAGGATGCGGAACC

CCAGCGCCACCATGTTGAGGTCGCCGAAGATGCTATCATGGTTCCAGAACTTATAGATATAATCCAGGGCCGT

CTTGATCTCTTCCTGGAAGTGCCGATCGATGCCCAGCCGCTGGACCACGTCGACGAACCAGATGTTCTCGAGG

ACCCCGAACTCATCCCCCTCGCCGTTGGAGAACATGTCCCGGATCTCATCGATCAGGATCTCGCGATGTTTAT

GATACGAGGAATCCGAATAGGGGGAGTTCAGCGACTGGATGAAATCGTCGGTCCAGAGGTTCGGATGGTGGTT

CCCGGTGCGGCGCAGCGCGTCCTTGACCGGCATGCAGGAGCTGCCATCATTGCTGGAATTGCCATTGAACATT

TCGGCCATATGCGGATCTGAGACCTTCAGCGACTAAGTACGTGTAAAGGGCGACACAAAATTTATTCTAAATG

CATAATAAATACTGATAACATCTTATAGTTTGTATTATATTTTGTATTATCGTTGACATGTATAATTTTGATA

TCAAAAACTGATTTTCCCTTTATTATTTTCGAGATTTATTTTCTTAATTCTCTTTAACAAACTAGAAATATTG

TATATACAAAAAATCATAAATAATAGATGAATAGTTTAATTATAGGTGTTCATCAATCGAAAAAGCAACGTAT

CTTATTTAAAGTGCGTTGCTTTTTTCTCATTTATAAGGTTAAATAATTCTCATATATCAAGCAAAGTGACAGG

CGCCCTTAAATATTCTGACAAATGCTCTTTCCCTAAACTCCCCCCATAAAAAAACCCGCCGAAGCGGGTTTTT

ACGTTATTTGCGGATTAACGATTACTCGTTATCAGAACCGCCCAGGGGGCCCGAGCTTAAGACTGGCCGTCGT

TTTACAACACAGAAAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGGCCATCCGTCAGGGGCCTTCTGCTTAGTTTGATGCC

TGGCAGTTCCCTACTCTCGCCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGA

GCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGT

GAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCC

CCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAG

GCGTTTCGCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCT

TTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCG

CTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTT

GAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGT

ATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGGCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTAT

CTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCT

GGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGA

TCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGACGCGCGCGTAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGC

TTGCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATGCTCTGCTTT

Claims (16)

1.朱栾倍半萜合酶，与SEQ ID NO:2代表的朱栾倍半萜合酶相比，所述朱栾倍半萜合酶具有增加的法呢基二磷酸转化成朱栾倍半萜的生产率(表示为每小时形成的朱栾倍半萜的摩尔量)，或所述朱栾倍半萜合酶包含SEQ ID NO:3代表的氨基酸序列，条件是SEQ ID NO:3中至少一个标注为′X′的位置与SEQ ID NO:2中的相应位置不同。

2.根据权利要求1所述的朱栾倍半萜合酶，其中与SEQ ID NO:2代表的朱栾倍半萜合酶相比，所述朱栾倍半萜合酶具有增加的比生产率、增加的稳定性、增加的产物特异性(相对于法呢基二磷酸转化成大根香叶烯A)或增加的宿主细胞中的表达。

3.根据权利要求2所述的朱栾倍半萜合酶，其中产物特异性，表示为从法呢基二磷酸形成的朱栾倍半萜对从法呢基二磷酸形成的大根香叶烯的摩尔比(在测试条件下)，是10或高，更优选地13-30，特别地是15-25。

4.根据前述权利要求中任一项所述的朱栾倍半萜合酶，其中所述朱栾倍半萜合酶的比生产率，表示为每份量的朱栾倍半萜合酶每小时形成的朱栾倍半萜的摩尔量，是SEQ ID NO:2代表的朱栾倍半萜合酶的比生产率的至少1.5倍，优选地2.0至10倍，特别地2.5至5倍。

5.根据前述权利要求中任一项所述的朱栾倍半萜合酶，其中与SEQ ID NO:2代表的朱栾倍半萜合酶相比，所述朱栾倍半萜合酶在朱栾倍半萜合酶的第二壳中具有至少一个修饰，特别地至少一个置换，或在朱栾倍半萜合酶的第一壳中具有至少一个修饰，特别地至少一个置换。

6.根据前述权利要求中任一项所述的朱栾倍半萜合酶，其中在与SEQ ID NO:2中具有半胱氨酸的位置相对应的位置处存在不同的氨基酸。

7.根据前述权利要求中任一项所述的朱栾倍半萜合酶，其中与SEQ ID NO:2代表的朱栾倍半萜合酶相比，所述朱栾倍半萜合酶在与选自SEQ ID NO:2的16、128、171、187、225、244、300、302、307、319、323、327、331、334、398、405、409、410、412、436、438、439、444、448、449、450、463、488、490、492、502、503、507、527、556、559、560、566、568、569和570的位置相对应的氨基酸位置处具有一个或多个修饰，特别地一个或多个置换。

8.根据权利要求6或7所述的朱栾倍半萜合酶，其中一个或多个修饰选自以下组:16A、16T、16S、128L、171R、187K、225S、244S、244T、300Y、302D、307T、307A、319Q、323A、327L、331G、334L、398I、398M、398T、405T、405V、409F、410F、410V、410L、412G、436L、436K、436T、436W、438T、439G、439A、444I、444V、448S、449F、449I、449Y、450L、450M、450V、463E、463S、463G、463W、488Y、488H、488S、490N、490A、490T、490F、492A、492K、502Q、503S、507E、507Q、527T、527S、527A、556T、559H、559L、559V、560L、566S、566A、566G、568S、569I、569V、570T、570G、570A和570P。

9.根据前述权利要求中任一项所述的朱栾倍半萜合酶，其中所述朱栾倍半萜合酶包含与SEQ ID NO:2具有至少55%、至少65%、至少75%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的氨基酸序列。

10.根据前述权利要求中任一项所述的朱栾倍半萜合酶，其中所述朱栾倍半萜合酶包含第一多肽区段和第二多肽区段，所述第一区段包含标签肽并且所述第二区段包含具有朱栾倍半萜合酶活性的多肽。

11.核酸，其包含编码根据前述权利要求中任一项所述的朱栾倍半萜合酶的核酸序列、其互补序列，或包含在严格条件下与编码根据前述权利要求中任一项所述的朱栾倍半萜合酶的核酸序列杂交的核酸序列。

12.表达载体，其包含根据权利要求11所述的核酸。

13.针对根据权利要求1至10中任一项所述的朱栾倍半萜合酶具有特异性结合活性的抗体，或对所述抗体的抗原结合部分具有特异性结合亲和力的蛋白质。

14.宿主细胞，其可以是生物本身或多细胞生物的部分，所述宿主细胞包含根据权利要求12所述的表达载体，所述宿主细胞优选地选自细菌细胞、真菌细胞和植物细胞，并且更优选地是：

选自革兰氏阴性细菌的细菌细胞，如红细菌属(Rhodobacter)、副球菌属(Paracoccus)或埃希氏菌属(Escherichia)；

选自曲霉属(Aspergillus)、布拉霉属(Blakeslea)、青霉属(Penicillium)、法夫酵母属(Phaffia(Xanthophyllomyces))、毕赤酵母属(Pichia)、糖酵母属(Saccharomyces)和耶罗维亚酵母属(Yarrowia)的真菌细胞；

包含转基因植物细胞的转基因植物或培养物，其中所述宿主细胞是转基因植物的细胞，所述转基因植物选自烟草属某些物种(Nicotianaspp)、茄属某些物种(Solanum spp)、菊苣(Cichorum intybus)，莴苣(Lactuca sativa)，薄荷属某些物种(Mentha spp)、黄花蒿(Artemisiaannua)、块茎形成植物、油料作物和树；或

包含转基因蘑菇细胞的转基因蘑菇或培养物，其中所述宿主细胞选自裂褶菌属(Schizophyllum)、伞菌属(Agaricus)和侧耳属(Pleurotisi)。

15.用于制备朱栾倍半萜的方法，其包括在根据权利要求1-10中任一项所述的朱栾倍半萜合酶存在下将法呢基二磷酸转化成朱栾倍半萜，其中优选地使用根据权利要求14所述的宿主细胞制备朱栾倍半萜。

16.用于制备诺卡酮的方法，其中将在根据权利要求15所述的方法中制备的朱栾倍半萜转化成诺卡酮，所述转化可以包括区域特异性羟化朱栾倍半萜，随后氧化，从而形成诺卡酮。