CN103644845A - 一种核酸修饰的纳米纤维光学传感器及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核酸修饰的纳米纤维光学传感器,由纳米纤维、荧光猝灭物质和核酸荧光分子探针构成。纳米纤维薄膜作为基底,核酸荧光分子探针上的荧光分子与荧光猝灭物质作为传感器的换能器,将核酸荧光分子探针检测到的信号转换为光学信号。纳米纤维薄膜通过静电纺丝得到,核酸荧光分子探针物质通过化学法修饰到纳米纤维上。本发明还公开了核酸修饰的纳米纤维传光学感器的制备方法。本发明通过利用纳米纤维的高比表面积,提高了核酸荧光分子探针的荧光信号强度,从而提高了传感器检测的灵敏度和准确性。
Description
技术领域
本发明属于材料制备和检测分析技术领域,涉及一种传感器及其制作方法,尤其是一种静电纺丝与核酸荧光分子探针结合的光学传感器及其制备方法,应用于检测与监控制造技术领域。
背景技术
静电纺丝法利用高分子溶液或熔体,在高压静电场条件下制成亚微米或纳米纤维,是现今制备一维超细纤维最重要、最可行的方法。静电纺丝技术制备纳米纤维设备简单、操作容易、高效,最大特点是能够制备出直径低至几个纳米的连续纤维。随着加上条件不同,其典型数值一般在40~2000nm之间,制备的静电纺丝纳米纤维或膜具有比表面积大、孔隙率高、纤维直径和孔隙尺寸小等优点。近年来,静电纺丝纳米纤维于传感分析研究取得了许多重要进展。尤其是研究人员将静电纺丝纳米纤维引入到构建传感器平台,从而充分发挥其在催化、吸附等方面表现出的优良性能己成为分析工作者聚焦的热点。
核酸分子探针利用了杂交高特异性以及设计、合成、标记方面的便利,已在生物、医学等诸多领域得到越来越广泛的应用。核酸荧光分子探针由荧光基团、淬灭基团和核酸三部分组成。主要有单链核酸探针和互补配对的双链核酸探针两种。单链核酸探针依靠单链DNA自身形成互补配对的结构,有Padlock探针、分子信标(Molecular Beacon,MB)等。分子信标由于标简单而巧妙的设计,它在各种新型核酸探针中发展最为迅速。通常,分子信标包含一个1~30个碱基的目标识别区域和连在侧边的两段自身互补的茎部,使得整个分子信标形成茎—环结构,这样分子信标两端标记的荧光基团和荧光猝灭基团就能充分接近,导致荧光熄灭。当目标物存在时,目标物与分子信标的环状序列发生杂交,这种长序列的分子间杂交作用力更大,可以战胜短序列分子内杂交作用力,打开分子信标茎部结构,使其荧光基团和荧光猝灭基团在空间上分离,荧光恢复;双链核酸探针有相邻探针、阴阳探针等。双链核酸探针利用两条核酸链之间的碱基互补配对,控制荧光基团和荧光猝灭基团的距离,当目标物存在时荧光基团和荧光猝灭基团距离发生改变,从而实现对于目标物的检测。
核酸分子探针与目标分子的结合主要有传统的碱基互补配对型与核酸适配体(Aptamer)型。传统的碱基互补配对型核酸分子探针主要用来检测核酸类物质,如:DNA、RNA等。而核酸适配体型的核酸分子探针是通过SELEX技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)从RNA或单链DNA随机文库中筛选出来的可以与目标物高灵敏、高选择性结合的寡核苷酸片段。可以特异性地与核酸适体结合的目标物种类十分广泛,小到有机小分子、金属离子等,大到蛋白质、肽、药物,甚至病毒、细胞和组织。核酸适配体探针的出现极大地拓展了核酸探针的应用领域,在制药、诊断、治疗与分析等领域有着广泛应用前景。
发明内容
为了解决现有技术问题,本发明的目的在于克服已有技术存在的不足,提供一种核酸修饰的纳米纤维光学传感器,通过将核酸荧光分子探针修饰在纳米纤维上,提高了传感器的灵敏度,与传统核酸探针传感器相比,有更灵敏的检测效果,减小了最低检测浓度和检出限。
为达到上述目的,本发明采用下述技术方案:
一种核酸修饰的纳米纤维光学传感器,由纳米纤维薄膜、荧光猝灭物质和核酸荧光分子探针构成。纳米纤维薄膜作为基底,核酸荧光分子探针上的荧光分子与荧光猝灭物质作为传感器的换能器,将核酸荧光分子探针检测到的信号转换为光学信号。纳米纤维薄膜通过静电纺丝得到,核酸荧光分子探针物质通过化学法修饰到纳米纤维上。
本发明技术方案的核酸修饰的纳米纤维光学传感器的制备方法。
1、通过静电纺丝技术得到纳米纤维薄膜。
静电纺丝的过程如下:配置浓度适宜含有功能基团的物质的聚合物溶液,将聚合物溶液搅拌均匀后转移到静电纺丝装置的注射器中;利用注射泵将注射器中的聚合物溶液引入针头,控制高压电场电压与溶液的流速,使得针头尖端的液滴由半球形变成锥形(称为泰勒锥),当外加电压达到临界值时,静电排斥力克服溶液的表面张力,带电射流便从锥顶端喷出;然后经历鞭动,同时受到静电排斥力而持续伸长,最后沉积到接地收集装置上,收集装置为表面疏水的玻璃。控制针头与收集装置距离为15cm,静电纺丝时间30min;将纺好的纳米纤维薄膜用去离子水洗净后放到真空干燥箱中,室温下干燥过夜。
上述聚合物优选为:聚乳酸(PLA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚丙烯酸(PAA)、聚苯乙烯(PS)、醋酸纤维素(CA)、聚醋酸乙烯酯(PVA)、聚丙烯腈(PAN)、聚苯胺(PANI)、聚氧化乙烯(PEO)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚(二苯胺)(PDPA)、聚O-甲苯胺(POT)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚丙烯酰胺(PAM)、聚醚砜(poly(ether sul-fones),(PES))、壳聚糖(CTS)、纤维素(cellulose)、乙酰氧基丙基-纤维素(Acetoxypropyl-cellulose,APC)、羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose,CMC)、四[4-(烯丙氧基)苯基]卟啉(tetrakis(4-methoxylphenyl)porphyrin,TMOPP)中的任意一种或几种。
上述功能基团的物质优选为:含有巯基的化合物(如:十二烷基硫醇等)、含有羧基的化合物(如:十二烷酸等)、含有氨基的化合物(如:赖氨酸等)、含有硅烷基的物质(如:二氧化硅纳米粒子等)等含有功能基团的物质。
2、将核酸荧光分子探针修饰到纳米纤维薄膜上。
a、表面有巯基的纳米纤维可以通过氧化作用形成二硫键或者金硫键等容易形成的含硫化学键将核酸荧光分子探针修饰到纳米纤维薄膜上。具体步骤如下:将干燥好的纳米纤维薄膜取出,在其上滴加含有核酸荧光分子探针的溶液,空气中充分反应。为加速反应,也可加入催化剂。
进一步的,对于形成二硫键加入的催化剂可以是:二甲亚砜(DMSO)、N—碘代琥珀酰亚胺(NIS)、氰化碘(ICN)、碘、铁氰化钾[K3Fe(CN)6]和三氟乙酸铊[(CF3COO)3Tl]等氧化剂。
b、表面有羧基或者氨基的纳米纤维可以通过酸胺缩合反应将核酸荧光分子探针修饰到纳米纤维上。具体步骤如下:将干燥好的纳米纤维薄膜取出,在含有核酸荧光分子探针的溶液中加入少量酸胺缩合催化剂,然后滴加在纳米纤维上。
进一步的,对于酸胺缩合反应常用的催化剂有:HOBt、DCC、HBTU、DIC、EDC.HCl、CDI、BOP-Cl、BOP、Cl-HOBt、PyBrOP、EEDQ、HOSu、HCTU等。
c、表面有硅烷基的纳米纤维可以通过硅烷偶联剂将核酸荧光分子探针修饰到纳米纤维上。具体步骤如下:将干燥好的纳米纤维薄膜取出,含有核酸荧光分子探针的溶液中加入少量硅烷偶联剂,然后滴加在纳米纤维上。
进一步的,加入的硅烷偶联剂可以是:3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-巯丙基三乙氧基硅烷、3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷、乙烯基三乙氧基硅烷等。
上述酸荧光分子探针优选为:单链核酸、双链核酸、线状核酸、环状核酸、核酸类似物(如:钛核酸(PNA))中的一种或任意几种分子的混合体。
进一步的,上述荧光分子探针的荧光基团为有机荧光染料,如:荧烷衍生物类(包括罗丹明类)、1,8-萘酰亚胺类、香豆素类、三芳甲烷类、偶氮类、蒽醌类、二苯乙烯类、萘二甲酸衍生物、苯并蒽酮衍生物等
进一步的,上述荧光分子探针的荧光猝灭物质为荧光猝灭基团和荧光猝灭纳米粒子,其中荧光猝灭基团包括:TAMRA、BHQ、DABCYL、AM-10、NBC等通过能量转移、电子转移或某种化学途径使得荧光猝灭的基团;荧光猝灭纳米粒子包括:金属纳米颗粒、石墨烯等可以与荧光素发生偶极耦合作用的纳米粒子。
本发明与现有技术相比,具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点:
1、通过纳米纤维的高比表面积,增强了荧光探针检测信号,提高了检测的灵敏度,减小了最低检测浓度和检出限。
2、引入核酸适配体探针,不仅能检测DNA、RNA等核酸类物质,还可以检测蛋白质、多肽、金属离子、药物、病毒、细胞等,扩大了检测范围。
3、核酸荧光分子探针与目标物特异性高,检测更加准确,减少了假阳性反应。
附图说明
图1是本发明核酸修饰的纳米纤维光学传感器示意图;
图2是本发明实施例1所制备的酸修饰的纳米纤维乳腺癌易感基因BRCA I光学传感器的扫描电子显微镜(SEM)图片;
图3 是本发明实施例1所制备的酸修饰的纳米纤维光学传感器检测乳腺癌易感基因BRCA I的光谱图;
图4是发明实施例2制备的酸修饰的纳米纤维肌强直性营养不良激酶相关Cdc42-结合激酶(MRCKα)光学传感器的扫描电子显微镜(SEM)图片;
图5是本发明实施例2所制备的酸修饰的纳米纤维光学传感器检测肌强直性营养不良激酶相关Cdc42-结合激酶(MRCKα)的光谱图。
具体实施方式
实施例对本发明的技术方案进一步说明
实施例 1
1)、通过静电纺丝技术得到纳米纤维薄膜。
静电纺丝的过程如下:静电纺丝原料为醋酸纤维(CA),含有功能基团的物质为十二硫醇,将其以1:2的比例加入N,N-二甲基乙酰胺-丙酮溶液中。将上述聚合物溶液转移到静电纺丝装置的注射器中。
利用注射泵将注射器中的聚合物溶液引入针头,控制高压电场电压与溶液的流速,使得针头尖端的液滴由半球形变成锥形(称为泰勒锥),当外加电压达到临界值时(20.0kV),静电排斥力克服溶液的表面张力,带电射流便从锥顶端喷出。
然后经历鞭动,同时受到静电排斥力而持续伸长,最后沉积到接地收集装置上,收集装置为表面疏水的玻璃。
控制针头与收集装置距离为15cm,静电纺丝时间30min;将纺好的纳米纤维薄膜用去离子水洗净后放到真空干燥箱中,室温下干燥过夜。
2)、将核酸荧光分子探针修饰到纳米纤维薄膜上。
所用核酸荧光分子探针为双链DNA,荧光基团为羧基荧光素(FAM),荧光猝灭物质为金纳米粒子(AuNPs)。酸荧光分子探针的两条DNA链分别为(5’端至3’端):
AuNPs-S-S-TTTTTGCTTTGTTCTGGATTTCGCAGGT
GAAATCCAGAACAAAGCA-FAM
该核酸荧光分子探针用来检测乳腺癌易感基因BRCA I
将干燥好的纳米纤维薄膜取出,在其上滴加含有上述核酸荧光分子探针的溶液,空气中充分反应8h。
3)、将含有乳腺癌易感基因BRCA I的缓冲液(10nM)滴加在上面制得的核酸修饰的纳米纤维光学传感器上,进行分析检测。
本实例核酸修饰的纳米纤维光学传感器的性能分析:
参见图3,对于BRCA I目标基因的检测,在BRCA I基因浓度为10nM时在518nm出仍然有很强的吸收峰,说明制备的核酸修饰的纳米纤维光学传感器实现了高灵敏度的nM级的检测。
实施例 2
1)、通过静电纺丝技术得到纳米纤维薄膜。
静电纺丝的过程如下:静电纺丝原料为聚苯胺,含有功能基团的物质为十二硫醇,将其以1:2的比例加入N,N-二甲基乙酰胺-丙酮溶液中搅拌均匀。将上述聚合物溶液转移到静电纺丝装置的注射器中。
利用注射泵将注射器中的聚合物溶液引入针头,控制高压电场电压与溶液的流速,使得针头尖端的液滴由半球形变成锥形(称为泰勒锥),当外加电压达到临界值时(20.0kV),静电排斥力克服溶液的表面张力,带电射流便从锥顶端喷出。
然后经历鞭动,同时受到静电排斥力而持续伸长,最后沉积到接地收集装置上,收集装置为表面疏水的玻璃。
控制针头与收集装置距离为15cm,静电纺丝时间30min;将纺好的纳米纤维薄膜用去离子水洗净后放到真空干燥箱中,室温下干燥过夜。
2)、将核酸荧光分子探针修饰到纳米纤维薄膜上。
所用核酸荧光分子探针为分子信标核酸适配体,荧光基团为四甲基罗丹明(TAMRA),荧光猝灭物质为金纳米粒子(AuNPs)。酸荧光分子探针的链分别(5’端至3’端):
AuNPs-S-S-CCTACTAATGATAAACCACTGGTGAATCGCTCAAGTCAGTAGTAGG-TAMRA
该核酸荧光分子探针用来检测肌强直性营养不良激酶相关Cdc42-结合激酶(MRCKα)。当无MRCK时,探针本身形成颈环结构,TAMRA的荧光被AuNPs猝灭。
将干燥好的纳米纤维薄膜取出,在其上滴加含有上述核酸荧光分子探针的溶液,空气中充分反应8h。
3)、将含有肌强直性营养不良激酶相关Cdc42-结合激酶(MRCKα)的缓冲液(10nM)滴加在上面制得的核酸修饰的纳米纤维光学传感器上,进行分析检测。
本实例核酸修饰的纳米纤维光学传感器的性能分析:
参见图5,对于肌强直性营养不良激酶相关Cdc42-结合激酶(MRCKα)的检测,在MRCKα基因浓度为10nM时在573nm出仍然有很强的吸收峰,说明制备的核酸修饰的纳米纤维光学传感器实现了高灵敏度的nM级的检测。
Claims (8)
1.一种核酸修饰的纳米纤维光学传感器,由纳米纤维薄膜(1)和核酸荧光分子探针(2)构成,所述核酸荧光分子探针(2)作为识别原件与换能器,检测目标分子信号并且将其检测到的信号转换为光信号,其特征在于:用静电纺丝技术制备纳米纤维薄膜(1),用化学方法将核酸荧光分子探针修饰到纳米纤维上,实现强光学信号的传感器,包括如下步骤:
1)、通过静电纺丝技术得到纳米纤维薄膜
静电纺丝的过程如下:配置含有功能基团的物质的聚合物溶液,将聚合物溶液搅拌均匀后转移到静电纺丝装置的注射器中;利用注射泵将注射器中的聚合物溶液引入针头,控制高压电场电压与溶液的流速,使得针头尖端的液滴由半球形变成锥形,当外加电压达到临界值时,静电排斥力克服溶液的表面张力,带电射流便从锥顶端喷出;然后经历鞭动,同时受到静电排斥力而持续伸长,最后沉积到接地收集装置上,收集装置为表面疏水的玻璃,控制针头与收集装置距离,静电纺丝时间;将纺好的纳米纤维薄膜用去离子水洗净后放到真空干燥箱中,室温下干燥过夜;
2)、将核酸荧光分子探针修饰到纳米纤维薄膜上
a、表面有巯基的纳米纤维通过氧化作用形成二硫键或者金硫键将核酸荧光分子探针修饰到纳米纤维薄膜上,具体步骤如下:将干燥好的纳米纤维薄膜取出,在其上滴加含有核酸荧光分子探针的溶液,空气中充分反应;
b、表面有羧基或者氨基的纳米纤维通过酸胺缩合反应将核酸荧光分子探针修饰到纳米纤维上,具体步骤如下:将干燥好的纳米纤维薄膜取出,在含有核酸荧光分子探针的溶液中加入少量酸胺缩合催化剂,然后滴加在纳米纤维上;
c、表面有硅烷基的纳米纤维通过硅烷偶联剂将核酸荧光分子探针修饰到纳米纤维上,具体步骤如下:将干燥好的纳米纤维薄膜取出,含有核酸荧光分子探针的溶液中加入少量硅烷偶联剂,然后滴加在纳米纤维上。
2.根据权利要求1所述的纳米纤维光学传感器,其特征在于:用静电纺丝的方法制备的纳米纤维,静电纺丝原料是聚乳酸(PLA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚丙烯酸(PAA)、聚苯乙烯(PS)、醋酸纤维素(CA)、聚醋酸乙烯酯(PVA)、聚丙烯腈(PAN)、聚苯胺(PANI)、聚氧化乙烯(PEO)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚(二苯胺)(PDPA)、聚O-甲苯胺(POT)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚丙烯酰胺(PAM)、聚醚砜(poly(ether sul-fones),(PES))、壳聚糖(CTS)、纤维素(cellulose)、乙酰氧基丙基-纤维素(Acetoxypropyl-cellulose,APC)、羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose,CMC)、四[4-(烯丙氧基)苯基]卟啉(tetrakis(4-methoxylphenyl)porphyrin,TMOPP)中的任意一种或几种。
3.根据权利要求1所述的纳米纤维光学传感器,其特征在于:用静电纺丝的方法制备的纳米纤维,纳米纤维表面的功能基团主要依靠在纺丝溶液中加入含有巯基的化合物、含有羧基的化合物、含有氨基的化合物、含有硅烷基的物质。
4.根据权利要求1所述的纳米纤维光学传感器,其特征在于:核酸荧光分子探针为单链核酸、双链核酸、线状核酸、环状核酸、核酸类似物中的一种或任意几种分子的混合体。
5.根据权利要求1或4所述的纳米纤维光学传感器,其特征在于所述荧光基团为有机荧光染料,所述有机荧光染料为荧烷衍生物类、1,8-萘酰亚胺类、香豆素类、三芳甲烷类、偶氮类、蒽醌类、二苯乙烯类、萘二甲酸衍生物、苯并蒽酮衍生物;荧光猝灭物质为荧光猝灭基团和荧光猝灭纳米粒子,所述荧光猝灭基团包括:TAMRA、BHQ系列染料、DABCYL、AM-10、NBC、4-(4-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸;所述荧光猝灭纳米粒子包括:金属纳米颗粒、石墨烯、石墨、碳管、磁性纳米粒子。
6.根据权利要求3所述的纳米纤维光学传感器,其特征在于,所述的巯基化合物为十二烷基硫醇,所述的羧基化合物为十二烷酸,所述的含有氨基化合物为赖氨酸,所述的硅烷基物质为二氧化硅纳米粒子。
7.根据权利要求4所述的纳米纤维光学传感器,其中所述的核酸类似物为肽核酸(PNA)。
8.根据权利要求5所述的纳米纤维光学传感器,其特征在于,所述荧烷衍生物类为罗丹明类。
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