CN103623036A - 三叶青直接口服饮片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种中药饮片，特别涉及一种三叶青直接口服饮片及其制备方法。一种三叶青直接口服饮片，其特征在于：该三叶青直接口服饮片为粒度≥500目的三叶青超微粉。作为优选，该三叶青直接口服饮片为粒度≥1000目的三叶青超微粉。一种所述的三叶青直接口服饮片的制备方法，其过程为：先将三叶青传统饮片粉碎成100-140目的粗粉，再根据18-22:1的球料比对粗粉以球磨的方式进行超微粉碎，取少量粉末测定粒度，当粉末粒度≥500目时，进行真空包装得到产品。目前的各种超微粉碎工艺较难达到1000目以上，本发明采用以上所述的特殊工艺可以实现1000目以上的三叶青超微粉制备，并且无毒性。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药饮片，特别涉及一种三叶青直接口服饮片及其制备方法。
背景技术
三叶青，为葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤，是中国特有的珍稀药用植物，但至今尚不能广泛推行人工种植。多年来人类对野生资源的过度使用，使野生资源日益减少，为了让有限的三叶青资源得到极限利用，三叶青的精华物质尽可能的保留，传统的三叶青加工工艺已无法满足要求。申请号：201310120685.9、申请日：2013-04-09的中国发明专利涉及一种三叶青含片，每1000g含片由以下重量份的原料制作：三叶青粉200～250g，糖料500～550g，预胶化淀粉250～300g，酸味剂1.5～2.5g，所述的三叶青粉为三叶青的叶片、藤、地下块茎的混合粉剂，按照叶片：藤：地下块茎=10%～15%：5%～10%：75%～80%的重量比配比制备得到。该发明提供的三叶青含片虽然携带方便、易被人接受，但是药物吸收并不理想。
发明内容
本发明提供一种三叶青直接口服饮片，旨在最大限度地保存原药的药效成份和还原生药的性能，使药效的性能更充分吸收，提高三叶青饮片的药效。三叶青直接口服饮片以超微粉碎为基础。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种三叶青直接口服饮片，其特征在于：该三叶青直接口服饮片为粒度≥500目的三叶青超微粉。作为优选，该三叶青直接口服饮片为粒度≥1000目的三叶青超微粉。
一种所述的三叶青直接口服饮片的制备方法，其过程为：先将三叶青传统饮片粉碎成100-140目的粗粉，再根据18-22:1的球料比对粗粉以球磨的方式进行超微粉碎，取少量粉末测定粒度，当粉末粒度≥500目时，进行真空包装得到产品。目前的各种超微粉碎工艺较难达到1000目以上，本发明采用以上所述的特殊工艺可以实现1000目以上的三叶青超微粉制备，并且无毒性。
作为优选，球磨时，控制粗粉的进料粒度为120目，粉碎时间为20h以上。
作为优选，球磨用的小球直径为0.5±0.1cm。最佳方案为0.5cm。
作为优选，该制备方法具体为：先用万能粉碎机将三叶青传统饮片粉碎成100-140目的粗粉，再根据20:1的球料比用振荡粉碎机对粗粉以球磨的方式进行超微粉碎，粉碎时间为20h以上，取少量粉末测定粒度，当粉末粒度≥500目时，进行真空包装得到产品。最佳方案是，当粉末粒度≥1000目时，进行真空包装得到产品。目前应用的超微粉碎技术和相关设备类型较多，应用范围和粉碎效果各不相同，对于植物性物料存在颗粒粒度、能耗较高和操作不便等问题。振荡粉碎机是利用研磨体（如钢球，石球，陶瓷球等）的相互冲击以及碰撞作用将物料粉碎。振荡粉碎机不会产生过多热量，粉碎过程中温度生高较少，而且占地面积少，干法和湿法都能适用，多用于热敏性物料的超微粉碎。
一种所述的三叶青直接口服饮片在保肝护肝方面的应用。肝脏是机体最大的代谢器官和消化腺体，同时也是机体重要的免疫器官。它在物质代谢，能量转换与供应方面起着至关重要的作用，如糖原储存，代谢，解毒等。因此，肝脏的损害会引起一些严重的后果。实验证明，本发明制得的三叶青直接口服饮片对化学性肝损伤的保护具有较好的作用。
目前市售的三叶青冻干粉，是新鲜的三叶青经冷冻干燥后在粉碎到250-300目而成的细粉，破壁不完全，而且价格高，一般病人承受不起。而本发明的三叶期直接口服饮片，是以传统三叶青饮片为原料，经过最佳粉碎研磨工艺，制成的完全破壁的超微粉。本产品和市售的三叶青冻干粉相比，在肝损伤保护上，从三叶青直接口服饮片对CCl4急性肝损伤小鼠肝脏系数的影响得知，本发明的产品优于市售的三叶青冻干粉；其他生化指标与冻干粉无明显差异。从价格上，本发明的产品与市售的三叶青冻干粉相比，成本将下降约52%。
附图说明
图1是本发明三叶青超微粉的显微图（100倍）；
图2是是本发明三叶青超微粉的显微图（400倍）。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
一、三叶青超微粉碎工艺的确定
本发明采用振荡粉碎机对三叶青传统饮片进行超微粉碎，并用粉末粒度为指标，以确定三叶青合理的超微粉碎工艺。
1仪器及试药
1.1仪器
TO-K型振荡粉碎机（日本）；
KQ-250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；
尼康200型显微镜（日本尼康科技有限公司）；
索尼DSC-T100数码照相机（日本索尼有限公司）；
1.2试药
三叶青传统饮片由浙江中医药大学中药饮片厂提供（产地：广西；批号：20120613），经浙江中医药大学中药饮片厂质检科鉴定为合格产品。
2方法与结果
2.1三叶青超微粉制法
先用万能粉碎机将三叶青传统饮片打成粗粉，根据球料比将一定量的粉末装于陶瓷罐中，同时放入小球，装好。经振荡粉碎机进行超微粉碎数小时后，取少量粉末测定粒度，真空包装。
2.3关键生产参数
药材质地不同，超微粉制备工艺参数不同，关键工艺参数是进料粒径，粉碎时间，小球重量，投料量。通过对不同质地药材的粉碎，证明上述工艺参数的影响非常大。因此本实验对这四个参数进行4因素3水平的正交设计，见表1。
表1正交因素水平表
2.4实验结果
以粒度作为考察指标，根据正交试验优选出最佳工艺，见表2。小于10μm的三叶青粉末分布图如图1和图2所示。
表2L9(34)正交试验表
直观分析：由极差（R）可以看出：对粉末小于10μm粒径的得率影响因素大小依次为A>B>C>D；对A因素IIIA＞IIA＞IA，B因素有IIIB＞IIB＞IB，C因素有IIIC＞IIC＞IC，D因素有ID>IID>IIID直观分析最佳工艺为A3B3C2D1。
3.结果讨论
从正交表试验结果可知进料粒度在粉碎中变化明显，随着目数的增加，粉碎率也相应的增大，而且波动幅度非常大。粉碎时间和小球加入量对超微粉碎影响程度差不多大，粉碎率均随着两个因素的增大而有所提高。投料量在此次粉碎中随着药量的增加粉碎率不断减小，几乎成直线性减小。综合以上分析，振荡粉碎机对三叶青传统饮片超微粉碎的最佳工艺参数为进料粒度120目，粉碎时间20h，小球重量1000g，进料重量50g。在此优化工艺参数组合下，得到粒度小于10μm的粉末占99.8%。
二、不同目数三叶青超微粉（本发明制得）对化学性肝损伤保护作用的研究
（一）、材料
1.实验动物
ICR小鼠，清洁级，体重18-22g，雄性，由浙江中医药大学实验动物中心提供，实验动物使用许可证号SYXK(浙)2003-0003，室温25±5℃，相对湿度60%-80%，自由饮食与饮水饲养。
2.药品与试剂
三叶青：购于广西，经浙江中医药大学中药饮片厂质检部鉴定为三叶青，
不同目数三叶青粉末：自制，
联苯双酯滴丸：浙江万邦药业股份有限公司，批号110907，
分析纯四氯化碳：购于广东市金华大化学试剂有限公司，批号20110413，
花生油为山东鲁花集团有限公司所生产，
ALT，AST试剂盒购自宁波美康生物科技有限公司，
SOD，MDA试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
3.仪器
万能粉碎机，振荡粉碎机，东芝全自动生化分析仪：Accute TBA-40FR东芝医疗系统株式会社，高速低温离心机，酶标仪，恒温孵育箱，可见分光光度仪，恒温水浴箱，离心机。
（二）、实验方法
1.三叶青粉混悬液的制备
称取适量的三叶青粉，放于研钵中，加入一部分的助悬剂1%羧甲基纤维素钠，充分研匀，再加入剩下部分的助悬剂，研匀，即得三叶青粉混悬液。
2.小鼠CCl4致急性肝损伤模型的建立
本试验采用新鲜无菌的花生油，将CCl4充分均匀的溶解于花生油中，配制成0.1%（V/V）CCl4。空白组口服灌胃花生油20ml/Kg，其余各组均口服灌胃20ml/Kg0.1%CCl4花生油。
①取150只小鼠（20±2g）,随机分成15组：空白组，0.1%CCl4模型组，阳性对照组（联苯双酯200mg/Kg）,200目三叶青粉小剂量组（0.3g/Kg）,200目三叶青粉中剂量组（0.6g/Kg），200目三叶青粉高剂量组（1.2g/Kg）,500目三叶青粉小剂量组（0.3g/Kg），500目三叶青粉中剂量组（0.6g/Kg），500目三叶青粉高剂量组（1.2g/Kg），1000目三叶青粉小剂量组（0.3g/Kg），1000目三叶青粉中剂量组（0.6g/Kg），1000目三叶青高剂量组（1.2g/Kg），市售三叶青粉低剂量组（0.3g/Kg），市售三叶青粉中剂量组（0.6g/Kg），市售三叶青高剂量组（1.2g/Kg）。上述三叶青粉除标明市售以外，均为本发明方法制得。
②按20ml/Kg剂量分别灌胃给药，每日一次，空白组和模型组给予同等体积的1%羧甲基纤维素钠，连续7天。
③第7天给药后隔1小时，各剂量组小鼠口服灌胃0.1%CCl4（20ml/kg），空白组口服灌胃等体积花生油，禁食，不禁水。
④16h后眼眶取血，将血液于4℃，3000rpm离心10分钟，制备血清，保存于-20℃，准备后续测定。
⑤处死小鼠，采集肝脏组织样品。
3.小鼠肝脏组织待测样品的采集
眼眶取血后，立即处死小鼠，迅速取出肝脏，置于冰冻生理盐水中反复漂洗，滤纸吸干，称肝重。同时用肉眼观察各组颜色，体积等的变化，并计算肝脏系数。公式为肝脏×100%。用手术刀切取每只小鼠相同部位小块肝组织，分别置于10%中性甲醛溶液中固定，用于组织病理学研究。剩下肝脏保存于-80℃，准备后续试验。
4.血清生化指标测定
血清中ALT和AST活性水平可以评价CCl4诱导的肝损伤的程度。实验中，严格按照试剂盒操作说明，对各组小鼠血清中的ALT，AST活性水平进行测定。
5.肝脏脂质过氧化水平测定
取肝脏右叶相同部位的一小块肝组织，以冰凉生理盐水制成10%肝匀浆，于低温，3000rpm，离心10分钟，取上清液-80℃冷冻以备生化检测。离心过的上清液按照南京建成试剂盒说明书测定MDA和SOD的含量。
6.组织病理学分析
用10%的福尔马林溶液固定肝组织,常规石蜡包埋切片(片厚5μm),HE染色,光镜下观察肝组织病理学变化。参照文献根据肝组织病变分四等级：0级，肝组织正常，无病变；1级，肝细胞疏松肿胀，有点坏死，可见少量炎性细胞浸润；2级，肝细胞脂肪变性，空泡坏死和灶性坏死，可见多个炎性细胞浸润；3级，广泛细胞空泡坏死和灶性坏死，炎性细胞浸润明显。
7.caspase-3活性测定
8.肝脏免疫组化化学分析
9.数据统计
实验数据用平均数±标准差
表示，应用SPSS17.0统计软件进行分析。组间样本比较采用t检验，多组间样本比较采用One-way-ANOVA方差分析；两两比较采用q检验，p<0.05，认为有显著性差异。
（三）、结果
1.本发明制得的三叶青超微粉对CCl4急性肝损伤小鼠肝脏系数的影响
根据表1可知，CCl4模型组肝脏系数明显增大，与空白组相比较差异极显著（p<0.01）,说明0.1%CCl4造模非常成功。阳性组和1000目高剂量组的肝脏系数，与模型组比较差异极显著（p<0.01）,市售三叶青粉高剂量组和1000目中剂量组的肝脏系数与模型组比较差异显著（p<0.05）,其余各治疗组与模型组比较差异不显著（p>0.05）。见表3。
表3不同目数三叶青超微粉对CCl4急性肝损伤小鼠肝脏系数的影响
| 组别 | 肝脏系数（%） |
| 空白组 | 4.73±0.126 |
| 阳性组 | 5.23±0.074## |
| 200目SYQ-低 | 5.37±0.130 |
| 200目SYQ-中 | 5.32±0.152 |
| 200目SYQ-高 | 5.19±0.309 |
| 500目SYQ-低 | 5.29±0.366 |
| 500目SYQ-中 | 5.25±0.142 |
| 500目SYQ-高 | 5.15±0.063 |
| 1000目SYQ-低 | 5.27±0.122 |
| 1000目SYQ-中 | 5.24±0.113# |
| 1000目SYQ-高 | 5.11±0.182## |
| 市售SYQ-低 | 5.34±0.309 |
| 市售SYQ-中 | 5.25±0.064 |
| 市售SYQ-高 | 5.14±0.119# |
| 模型组 | 5.42±0.066** |
注：与空白组比较：**p<0.01；与CCl4模型组比较：#p<0.05,##p<0.01；
2.本发明的三叶青超微粉对CCl4急性肝损伤小鼠生化指标的影响
与阳性组相比，1000目三叶青超微粉和市售三叶青处理组小鼠血清ALT，AST活性均无显著性差异（p>0.05）,而200目的低剂量组却有极大的显著性(p<0.01)。与模型组相比，除了200目的低剂量组无显著性差异，其他各组均有显著性差异（p<0.05）。同时，1000目三叶青超微粉与市售三叶青粉相比较，无显著性差异（p>0.05），见表4。
表4不同目数三叶青超微粉对CCl4急性肝损伤小鼠血清ALT和AST活性的影响
| 组别 | 给药剂量（g/kg） | ALT（U/L） | AST（U/L） |
| 空白组 | —— | 27±3## | 54.3±1.5## |
| 阳性组 | 200 | 42.8±17.9## | 82.2±18.7## |
| 200目SYQ-低 | 0.3 | 135.5±14.5**## | 123.2±25.7** |
| 200目SYQ-中 | 0.6 | 109.8±29.8**## | 93.7±13.5## |
| 200目SYQ-高 | 1.2 | 69.3±21.5*## | 82.5±10.9## |
| 500目SYQ-低 | 0.3 | 83.3±22.1**## | 76.7±16.7## |
| 500目SYQ-中 | 0.6 | 78.2±16.8**## | 72.5±14.7## |
| 500目SYQ-高 | 1.2 | 58.4±17.5## | 70.6±16.8## |
| 1000目SYQ-低 | 0.3 | 54.0±8.7## | 74.8±7.4## |
| 1000目SYQ-中 | 0.6 | 51.8±10.9## | 73.3±13.9## |
| 1000目SYQ-高 | 1.2 | 46.4±18.1## | 66.6±9.8## |
| 市售SYQ-低 | 0.3 | 54.8±11.4## | 75.8±16.4## |
| 市售SYQ-中 | 0.6 | 52.7±16.6## | 70.7±17.0## |
| 市售SYQ-高 | 1.2 | 43.3±7.6## | 66.7±9.6## |
| 模型组 | —— | 147.2±23.4 | 142.0±35.1 |
注：与阳性组比较：*p<0.05,**p<0.01；与模型组比较：#p<0.05，##p<0.01；
3.本发明三叶青超微粉对CCl4急性肝损伤小鼠肝组织抗氧化能力的影响
实验结果表明，与正常组比较，CCl4中毒后小鼠肝组织中的MDA含量明显增高（p<0.01），SOD活性明显降低(p<0.01)。与模型组比较，1000目和市售三叶青的中高剂量组均能显著的升高SOD活性（p<0.05），而200目与500目三叶青超微粉处理组无明显差异；与市售三叶青粉处理组相比，1000目三叶青粉处理组SOD活性，MDA含量没有显著的变化（p>0.05），见表5。
表5不同目数三叶青粉对CCl4急性肝损伤小鼠肝中SOD活性及MDA含量的影响
| 组别 | 给药剂量(g/kg) | SOD(U/mgprot) | MDA(mmol/mgprot) |
| 空白组 | —— | 38.54±6.23## | 3.23±0.40 |
| 阳性组 | 200 | 31.33±4.08 | 3.22±0.38 |
| 200目SYQ-低 | 0.3 | 26.16±1.35** | 8.40±1.60** |
| 200目SYQ-中 | 0.6 | 27.30±2.83** | 6.74±1.03** |
| 200目SYQ-高 | 1.2 | 31.90±4.02 | 6.45±0.86#** |
| 500目SYQ-低 | 0.3 | 27.91±2.91** | 8.09±0.78** |
| 500目SYQ-中 | 0.6 | 30.37±2.04* | 6.93±1.84** |
| 500目SYQ-高 | 1.2 | 37.46±9.8## | 6.81±1.67** |
| 1000目SYQ-低 | 0.3 | 28.2±2.00** | 6.31±0.23#** |
| 1000目SYQ-中 | 0.6 | 36.00±1.86# | 5.96±1.36#** |
| 1000目SYQ-高 | 1.2 | 36.07±5.10# | 5.39±0.30##* |
| 市售SYQ-低 | 0.3 | 32.53±5.55 | 6.23±1.64#** |
| 市售SYQ-中 | 0.6 | 38.05±1.83## | 5.44±0.95##* |
| 市售SYQ-高 | 1.2 | 39.82±5.85## | 5.24±0.58##* |
| 模型组 | —— | 26.81±2.90** | 8.46±1.19** |
注：与空白组比较：*p<0.05,**p<0.01；与模型组比较：#p<0.05，##p<0.01；
实施例1
一种三叶青直接口服饮片，其制备方法具体为：用万能粉碎机将三叶青传统饮片粉碎成120目的粗粉，再根据20:1的球料比用振荡粉碎机对粗粉以球磨的方式进行超微粉碎，球磨用的小球直径约为0.5cm，小球重量1000g，进料的粗粉重量50g，粉碎时间为20h，取少量粉末测定粒度，当粉末粒度≥1000目时，进行真空包装得到产品。产品中，粒度小于10μm的粉末占99.8%。
实施例2
一种三叶青直接口服饮片，其制备方法具体为：用万能粉碎机将三叶青传统饮片粉碎成120目的粗粉，再根据18:1的球料比用振荡粉碎机对粗粉以球磨的方式进行超微粉碎，球磨用的小球直径约为0.5cm，小球重量900g，进料的粗粉重量50g，取少量粉末测定粒度，当粉末粒度≥500目时，进行真空包装得到产品。
实施例3
一种三叶青直接口服饮片，其制备方法具体为：用万能粉碎机将三叶青传统饮片粉碎成140目的粗粉，再根据22:1的球料比用振荡粉碎机对粗粉以球磨的方式进行超微粉碎，球磨用的小球直径约为0.5cm，小球重量1100g，进料的粗粉重量50g，取少量粉末测定粒度，当粉末粒度≥1000目时，进行真空包装得到产品。产品中，粒度小于10μm的粉末占99.8%。
实施例4
一种三叶青直接口服饮片，其制备方法具体为：用万能粉碎机将三叶青传统饮片粉碎成100目的粗粉，再根据18:1的球料比用振荡粉碎机对粗粉以球磨的方式进行超微粉碎，球磨用的小球直径约为0.5cm，小球重量900g，进料的粗粉重量50g，取少量粉末测定粒度，当粉末粒度≥500目时，进行真空包装得到产品。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
Claims (8)
1. 一种三叶青直接口服饮片，其特征在于：该三叶青直接口服饮片为粒度≥500目的三叶青超微粉。
2. 根据权利要求1所述的三叶青直接口服饮片，其特征在于：该三叶青直接口服饮片为粒度≥1000目的三叶青超微粉。
3. 一种权利要求1所述的三叶青直接口服饮片的制备方法，其特征在于：
先将三叶青传统饮片粉碎成100-140目的粗粉，再根据18-22:1的球料比对粗粉以球磨的方式进行超微粉碎，取少量粉末测定粒度，当粉末粒度≥500目时，进行真空包装得到产品。
4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：球磨时，控制粗粉的进料粒度为120目，粉碎时间为20h以上。
5. 根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于该方法具体为：先用万能粉碎机将三叶青传统饮片粉碎成100-140目的粗粉，再根据20:1的球料比用振荡粉碎机对粗粉以球磨的方式进行超微粉碎，粉碎时间为20h以上，取少量粉末测定粒度，当粉末粒度≥500目时，进行真空包装得到产品。
6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于该方法具体为：先用万能粉碎机将三叶青传统饮片粉碎成100-140目的粗粉，再根据20:1的球料比用振荡粉碎机对粗粉以球磨的方式进行超微粉碎，粉碎时间为20h以上，取少量粉末测定粒度，当粉末粒度≥1000目时，进行真空包装得到产品。
7. 根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于：球磨用的小球直径为0.5±0.1cm。
8. 一种权利要求1所述的三叶青直接口服饮片在保肝护肝方面的应用。
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