CN103621401A - 老鸦瓣无性快繁体系的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种老鸦瓣无性快繁体系的建立方法，包括步骤：准备外植体、外植体消毒、初代诱导、诱导愈伤组织、生成不定芽、丛生芽增殖和壮苗、诱导具鳞茎试管苗、诱导试管鳞茎。本发明以冷藏芯芽为初始外植体，利用产生的中间繁殖体材料芽茎和鳞芽，分别经愈伤组织途径和器官发生途径获得丛生芽；可以通过愈伤组织和芽的循环增殖来提高老鸦瓣的繁殖系数；得到带根的基部膨大试管苗和试管鳞茎，有利于提高移栽成活率、提高耐贮藏、耐运输能力和缩短繁殖周期，且方法简单，成本较低，适宜于生产应用，对实现老鸦瓣的可持续利用具有重要意义。

Description

老鸦瓣无性快繁体系的建立方法

技术领域

本发明属于中药材栽培技术领域，具体地说，本发明涉及一种老鸦瓣无性快繁体系的建立方法。

背景技术

老鸦瓣Tulipa edulis(Miq.)Baker.为百合科(Liliaceae)郁金香属(Tulipa L.)药用植物，分布于江苏、安徽、浙江、江西、湖北、湖南、辽宁、山东和陕西等省，朝鲜和日本也有分布。其除去膜质皮及绒毛后的干燥鳞茎为中药材光慈菇。据本草考证，老鸦瓣历史上曾长期作为中药材山慈菇的主要基原植物。传统中医认为，光慈菇味甘、辛，性寒，有小毒，清热解毒，散结消肿，主治咽喉肿痛、瘰疬结核，瘀滞疼痛，痈疖肿毒，蛇虫咬伤。目前也是治疗多种肿瘤的常用药，如咽喉癌、淋巴瘤、乳腺癌等。

野外观察发现老鸦瓣生长期短，地上茎叶生长时间100d左右。有性繁殖存在“花而不实”现象，种子自然萌发率低。无性繁殖通过母鳞茎鳞片上的腋芽、母鳞茎基部芽茎等进行，但母鳞茎存在更替现象，当年母鳞茎消失，导致繁殖系数偏低。目前光慈菇药材主要来源于野生，已满足不了市场需求，急需一种快速繁殖老鸦瓣的技术。

发明内容

基于此，本发明提供了一种老鸦瓣无性快繁体系的建立方法。

一种老鸦瓣无性快繁体系的建立方法，包括以下步骤：

(1)外植体准备

7月底至8月上旬采集自然休眠的老鸦瓣鳞茎，冲洗，于0～2℃进行湿沙冷藏层积处理，3.5～4.5个月取出作为外植体；

(2)外植体消毒

取外植体，除去绒毛层，饱和洗衣粉溶液清洗后，剖取保留完整基部的芯芽，先用酒精，再用升汞浸泡消毒，无菌水冲洗，吸干表面水分，备用；

(3)初代诱导

将消毒后的外植体接种于初代诱导培养基中，1～2个月后形成鳞芽和芽茎；所述初代诱导培养基为：含蔗糖30g·L^-1、琼脂5-7g·L^-1、pH5-6的MS培养基；所述初代诱导的培养条件为：光照1500-3000lx，温度22±1℃，光照时间8-16h/d，湿度70％～80％；

(4)诱导愈伤组织、生成不定芽

将芽茎切段接种于愈伤组织诱导培养基中培养，30～50天得到愈伤组织；将愈伤组织接种于继代增殖培养基中进行继代增殖；1～2个月后将增殖后的芽茎愈伤组织切块接种于不定芽分化培养基中培养2-3个月，完成不定芽、丛生芽分化，生成不定芽和丛生芽；所述愈伤组织诱导培养基为：含6-BA 0.5-1.0mg·L^-1、NAA1.0-2.0mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂5-7g·L^-1、pH5-6的MS培养基；所述愈伤组织继代增殖培养基为：含6-BA 0.2-1.0mg·L^-1、NAA 0.5-2.0mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂5-7g·L^-1、pH5-7的MS培养基；所述愈伤组织不定芽分化培养基为：含6-BA1.0-2.0mg·L^-1、NAA 0-0.5mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂5-7g·L^-1、pH5-6的MS培养基；

或者将鳞芽接入不定芽诱导培养基中，直接诱导生成不定芽；所述不定芽诱导培养基为：含6-BA 0.5-2mg·L^-1、NAA 0.01-0.5mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂5-7g·L^-1、pH5-6的MS培养基；

(5)增殖和壮苗

将步骤(4)获得的不定芽中的细弱不定芽转入增殖培养基中增殖，得到再生不定芽，再转入壮苗培养基中壮苗得到生根的基部膨大的试管苗，即为老鸦瓣无性快繁体系；

将步骤(4)获得的不定芽中的短壮不定芽直接转入壮苗培养基中进行壮苗，得到生根的基部膨大的试管苗，即为老鸦瓣无性快繁体系；

所述不定芽增殖培养基为：含6-BA 0.2～1.0mg·L^-1、NAA 0-0.2mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂5-7g·L^-1、pH5-6的MS培养基；所述壮苗培养基为：含6-BA0-0.2mg·L^-1、NAA 0-0.2mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂5-7·L^-1、pH5-6的MS培养基；

经壮苗后的不定芽或试管苗的根呈黄白色，含白色根毛，根数一般为6-10条；

(6)诱导基部膨大呈鳞茎状的试管苗

将步骤(3)中的鳞芽和芽茎接入含蔗糖30g·L^-1、琼脂5-7g·L^-1、pH5-6的MS培养基中培养，1.5～2.5个月后，芽茎顶端直接形成小鳞茎或芽茎顶端爆开形成粗壮试管苗，鳞芽直接形成试管苗；1.5～2.5个月后形成基部膨大呈鳞茎状的试管苗，即为老鸦瓣无性快繁体系；

(7)诱导试管鳞茎

将步骤(4)中增殖得到的丛生芽于3-6℃暗处理1-3个月后，转入含30-90g·L^-1蔗糖的无激素MS培养基中，于22-24℃、光照8-16h/d培养2-3个月，得到膨大、成熟的试管鳞茎，即为老鸦瓣无性快繁体系。

以上经步骤(1)-(7)获得的生根的基部膨大的试管苗、基部膨大呈鳞茎状的试管苗和典型膨大、成熟的试管鳞茎的方法即为老鸦瓣无性快繁体系的建立过程。

在其中一个实施例中，步骤(1)中，所述湿沙冷藏层积处理为：将鳞茎与灭过菌的河沙以1∶2-4的体积比混匀后放入不完全密封的自封袋中，所述河沙的含水量为6wt％～8wt％。自封袋不密闭，使鳞茎能透气。河沙的含水量保持在6wt％～8wt％的范围，此时，河沙用手攥就成团，手松开沙团就裂开。

在其中一个实施例中，步骤(3)中，所述初代诱导培养基为：含蔗糖30g·L^-1、琼脂6.5g·L^-1、pH5.8的MS培养基。

在其中一个实施例中，步骤(4)中，所述愈伤组织诱导培养基为：含6-BA0.5mg·L^-1、NAA 2.0mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂6.5g·L^-1、pH5.8的MS培养基；所述愈伤组织继代增殖培养基为：含6-BA 0.5mg·L^-1、NAA 2.0mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂6.5g·L^-1、pH5.8的MS培养基；所述愈伤组织不定芽分化培养基为：含6-BA 2mg·L^-1、NAA 0.2mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂6.5g·L^-1、pH5.8的MS培养基；所述鳞芽不定芽诱导培养基为：含6-BA 1mg·L^-1、NAA 0.01mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂6.5g·L^-1、pH5.8的MS培养基。

在其中一个实施例中，所述步骤(4)中用于诱导愈伤组织的芽茎为短缩芽茎的芽茎顶端，用于增殖的愈伤组织为愈伤组织类型II。

在其中一个实施例中，步骤(5)中，所述不定芽增殖培养基为：含6-BA 0.2～0.5mg·L^-1、NAA 0.2mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂6.5g·L^-1、pH5.8的MS培养基；所述壮苗培养基为：含6-BA 0mg·L^-1、NAA 0.2mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂6.5g·L^-1、pH5.8的MS培养基。

在其中一个实施例中，步骤(6)中所述培养基为含蔗糖30g·L^-1、琼脂6.5g·L^-1、pH5.8的MS培养基。

在其中一个实施例中，步骤(7)中所述试管鳞茎诱导的处理方法为：将步骤(4)中增殖得到的丛生芽于5℃暗处理2-3个月后，转入含60g·L^-1蔗糖的无激素MS培养基中，于23℃、光照16h/d培养2-3个月，得到膨大、成熟的试管鳞茎。

本发明通过快速筛选不同外植体、培养基激素配比和多种诱导途径，建立老鸦瓣无性快繁体系，使冷藏后的老鸦瓣芯芽外植体在约30-40d诱导出芽茎，芽茎经约20-40d诱导出愈伤组织，愈伤组织约1-2个月分化出丛生芽；丛生芽在2-3个月内通过增殖和壮苗得到基部膨大的试管苗；增殖后的丛生芽低温处理2-3个月后，转无激素培养基培养2-3个月形成典型、成熟试管鳞茎。也可通过冷藏芯芽形成的芽茎中间体直接诱导光滑小鳞茎或经鳞芽中间体直接长成基部膨大的试管苗。

本发明具有以下有益效果：

本发明的老鸦瓣无性快繁体系的建立方法是以冷藏芯芽为初始外植体，利用产生的中间繁殖体材料芽茎和鳞芽，分别经愈伤组织途径和器官发生途径获得丛生芽；芽茎的愈伤组织途径可通过愈伤组织增殖提高繁殖系数，且芽茎材料可经愈伤组织分化重新获得，减少了初始外植体的严重污染问题；鳞芽的器官发生途径可直接再生不定芽，既缩短了芽诱导程序和时间，又避免了愈伤组织途径可能带来的变异率高的缺点；通过变温过程及合适的培养基得到试管鳞茎，提高了耐贮藏、耐运输能力和移栽成活率。

本发明的老鸦瓣无性快繁体系的建立方法可以通过愈伤组织和芽的循环增殖来提高老鸦瓣的繁殖系数；得到带根的基部膨大呈鳞茎状试管苗和典型、成熟试管鳞茎，有利于提高移栽成活率、提高耐贮藏、耐运输能力和缩短繁殖周期，且方法简单，成本较低，适宜于生产应用，对实现老鸦瓣的可持续利用具有重要意义。

具体实施方式

以下通过具体实施例来详细说明本发明。

实施例1老鸦瓣无性快繁体系的建立方法

包括以下步骤：

(1)外植体准备

7月底至8月上旬采集自然休眠的老鸦瓣鳞茎，洗去泥沙，沥干水分，400倍液50％多菌灵可稀释粉剂浸泡20～30min，清水洗去药液，室内晾3～5d，将鳞茎与经135℃干热灭菌4h的湿河沙以体积比1∶3混匀，放于不完全密封的自封袋中在0～2℃温度条件下冷藏保存。4个月后取出作为外植体。

(2)外植体消毒

取冷藏后的老鸦瓣鳞茎外植体，除去绒毛层，饱和洗衣粉溶液清洗3次，剖取保留完整基部的芯芽，饱和洗衣粉溶液清洗3次，自来水冲洗1～2h，超净工作台上吸干芯芽表面水分，75％酒精消毒30～40s，0.1％升汞消毒18min，无菌水冲洗5～6遍，无菌吸水纸吸干表面水分，备用。

(3)初代诱导

将消毒后的外植体接种于初代诱导培养基(含蔗糖30g·L^-1、琼脂6.5g·L^-1、pH5.8的MS培养基)中，培养条件为光照2000lx，温度22±1℃，光照时间12h/d，湿度70％～80％，40天后形成鳞芽和芽茎；(其他阶段如不特殊说明，培养条件均同初代诱导阶段)。

(4)诱导愈伤组织、生成不定芽

取短缩芽茎顶端作为初代诱导外植体，分割成1cm切段接入愈伤组织诱导培养基(含6-BA 0.5mg·L^-1、NAA 2.0mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂6.5g·L^-1、pH5.8的MS培养基)中，40天后得到愈伤组织；将愈伤组织类型II接入继代培养基(含6-BA 0.5mg·L^-1、NAA 2.0mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂6.5g·L^-1、pH5.8的MS培养基)中继代增殖；1～2个月后再转入不定芽分化培养基(含6-BA 2mg·L^-1、NAA0.2mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂6.5g·L^-1、pH5.8的MS培养基)中进行不定芽分化，生成不定芽；

或者将鳞芽接入不定芽诱导培养基(含6-BA 1mg·L^-1、NAA 0.01mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂6.5g·L^-1、pH5.8的MS培养基)中，直接诱导生成不定芽；

(5)增殖和壮苗

将步骤(4)获得的不定芽中的细弱不定芽转入增殖培养基(含6-BA 0.2～0.5mg·L^-1、NAA 0.2mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂6.5g·L^-1、pH5.8的MS培养基)中增殖，得到丛生不定芽，再转入壮苗培养基(含6-BA 0mg·L^-1、NAA 0.2mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂6.5g·L^-1、pH5.8的MS培养基)中壮苗得到生根的基部膨大的试管苗；

将步骤(4)获得的不定芽中的短壮不定芽或增殖后的丛生芽直接转入壮苗培养基(含6-BA 0mg·L^-1、NAA 0.2mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂6.5g·L^-1、pH5.8的MS培养基)中壮苗得到生根的基部膨大的试管苗；

经壮苗后的不定芽或试管苗的根呈黄白色，含白色根毛，根数一般为6-10条；

(6)诱导基部膨大呈鳞茎状的试管苗

将步骤(3)中的鳞芽和芽茎接入含蔗糖30g·L^-1、琼脂6.5g·L^-1、pH5.8的MS培养基中培养，1.5～2.5个月后，芽茎顶端直接形成小鳞茎或芽茎顶端爆开形成粗壮试管苗，鳞芽直接形成试管苗；1.5～2.5个月后形成基部膨大呈鳞茎状的试管苗；

(7)诱导试管鳞茎

将步骤(4)中增殖得到的丛生芽于5℃暗处理2-3个月后，转入含60g·L^-1蔗糖的无激素MS培养基中，于23℃、光照16h/d培养2-3个月，得到膨大、成熟的试管鳞茎，即为老鸦瓣无性快繁体系。

经以上步骤(1)-(7)获得的生根的基部膨大的试管苗、基部膨大呈鳞茎状的试管苗和典型膨大、成熟试管鳞茎的过程即为老鸦瓣无性快繁体系的建立方法。

试验例1

以下通过比较不同的外植体、培养基和多种诱导途径，来筛选老鸦瓣无性快繁体系的最合适的建立方法。

(1)不同外植体愈伤组织和不定芽的诱导情况(筛选芽茎愈伤组织诱导培养基和鳞芽不定芽诱导培养基)

将不同外植体接入不同的培养基中，40天后统计愈伤组织和不定芽诱导率，其中，愈伤组织诱导率(％)＝形成愈伤组织的外植体数/接种的芽茎切段数×100；不定芽诱导率(％)＝形成不定芽的外植体数/接种的鳞芽单芽数×100；不定芽数(个/外植体)＝形成的不定芽总数/接种的鳞芽单芽总数。结果见表1。

表1不同外植体愈伤组织和不定芽诱导情况(

n＝2)

注：数据后不同小写字母代表处理间在p＝0.05水平上差异显著，不同大写字母代表处理间在p＝0.01水平上差异显著.

表1结果表明：芽茎外植体在处理2(6-BA0.5mg/L、NAA2.0mg/L，即实施例1中步骤4的愈伤组织诱导培养基)中具较高的愈伤组织诱导率，为78.54％；鳞芽外植体在处理4(6BA 1.0mg/L、NAA 0.01mg/L，即实施例1中步骤4的不定芽诱导培养基)具有较高的不定芽诱导率和不定芽数，分别为89.53％和2.3个/鳞芽。

(2)不同芽茎部位愈伤组织诱导情况(筛选初代诱导外植体)

利用愈伤组织分化不定芽期间产生的芽茎外植体(初代诱导外植体)进行循环诱导愈伤组织，并比较了芽茎不同部位诱导愈伤组织的效果，结果如表2所示。

表2不同芽茎部位愈伤组织诱导情况比较

表2结果表明：芽茎顶端和短缩芽茎顶端愈伤组织诱导率高于芽茎中段切段，但芽茎中段和顶端诱导的愈伤组织多为黄白至黄绿色松脆愈伤组织，而短缩芽茎顶端(即实施例1中步骤3的初代诱导外植体)则多诱导黄白致密愈伤组织，黄白致密愈伤组织分化不定芽效果较好，故取短缩芽茎顶端外植体诱导愈伤组织最好。

(3)不同继代培养基对芽茎部位愈伤组织诱导情况(筛选继代培养基)

芽茎顶端外植体形成的愈伤组织再接入不同的培养基中进行继代增殖，2个月后通过愈伤组织的色泽、状态、分化、生根、芽茎产生情况等比较不同继代培养基的增殖效果。结果如表3所示。

表3不同继代培养基的增殖效果

注：“+”的多少表示愈伤组织增殖效果的强弱

由表3可以看出，老鸦瓣愈伤组织在处理2、3、4、5、6中都有增殖生长现象，且在6-BA/NAA≤1情况下，随着生长素和细胞分裂素水平的提高，愈伤组织量增加明显，且随着生长素比例的提高愈伤组织状态更趋向松脆的颗粒性，其中以处理6(6-BA0.5mg/L、NAA2.0mg/L，即实施例1中步骤4的继代培养基)培养基增殖效果最好，其次是处理5(6-BA0.5mg/L、NAA1.0mg/L)培养基。

(4)增殖后的芽茎愈伤组织不定芽分化情况(筛选芽茎不定芽分化培养基)

将增殖1-2个月后的芽茎愈伤组织，切分成约0.5-1.0cm见方的切块，转入不同的不定芽分化培养基中进行诱导不定芽。2个月后观察统计愈伤组织分化不定芽情况。

短壮不定芽：指芽体较短、壮实、多圆锥形、芽体多实心、黄白至黄绿色，伸长生长不明显、主要为加粗生长，芽体基部多不形成芽茎的一类不定芽；

细弱不定芽(试管苗)：指芽或苗较细弱、瘦长、多葱叶型、中空、黄绿色至绿色，主要表现为伸长生长，芽或苗基部多能形成芽茎的一类不定芽；

总不定芽数(个/愈伤组织)＝(短壮不定芽数+细弱不定芽数)/接种的愈伤组织块数；

总不定芽率(％)＝诱导形成短壮不定芽和细弱不定芽的愈伤组织块数/接种的愈伤组织块数×100；

短壮(或细弱)不定芽数(个/愈伤数)＝短壮(或细弱)不定芽数/接种的总愈伤组织块数；

芽茎诱导率(％)＝分化产生的芽茎的愈伤组织块数/接种的总愈伤组织块数×100；

芽茎数(个/愈伤组织)＝分化形成的芽茎条数/接种的愈伤组织块数；

结果发现：MS+6-BA 2mg·L^-1+NAA 0.2mg·L^-1+蔗糖30g/L+琼脂6g/L、pH5.8的培养基(即实施例1中步骤4的不定芽分化培养基)不定芽诱导效果较好，该培养基处理愈伤组织分化不定芽率为66.21％，芽茎诱导率32.97％，平均每个愈伤组织形成1.73个不定芽、0.51条芽茎。

(5)增殖后不同类型的愈伤组织不定芽分化情况(筛选用于增殖的愈伤组织种类)

将步骤(4)增殖后的芽茎愈伤组织分成4种愈伤组织类型，并接入到不定芽分化培养基中，2个月后观察不定芽分化效果。结果如表4所示。

表4不同类型愈伤组织分化不定芽效果比较

注：愈伤类型I(致密，多黄绿色，表面略干燥、粗糙、具褶皱状不规则突起)；愈伤II(黄白、致密、表面光滑湿润、团块状)；愈伤III(多疏松易碎，黄绿色至绿色，表面具颗粒性突起)；愈伤IV(黄白(绿)色至半透明，表面湿润，极松散或至半透明的不规则絮状)。

表4结果表明：愈伤组织类型II不定芽分化效果最好，表现为不定芽分化率高、总不定芽数多，主要为芽基部不形成芽茎的短壮不定芽，利于壮苗。愈伤组织类型II不定芽率为68.75％，每愈伤组织块含总不定芽数3.375个，其中总不定芽中短壮不定芽数为2.625个。

(6)不同类型和不同培养基的不定芽增殖情况(筛选不定芽增殖培养基和用于增殖的不定芽种类)

将老鸦瓣无性快繁体系建立方法的步骤4中所得不定芽分割成单芽后转入不同的增殖培养基中，40-50d时更换一次新鲜培养基，3个月后统计不定芽增殖情况，结果见表5。

表5不同培养基对不定芽的增殖效果比较

注：每处理样本数在20-30个；增殖系数＝增殖后芽数/增殖前芽数；处理2-4为实施例1。

表5结果表明：在2-4处理的MS+6-BA 0.5mg·L^-1+NAA 0.2mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+6.5g·L^-1琼脂培养基(即实施例1中步骤5的增殖培养基)中，不定芽增殖效果最好，新生不定芽率为79.808％，增殖系数为2.47；其次为2-3处理：MS+6-BA 0.2mg·L^-1+NAA 0.2mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+6.5g·L^-1琼脂培养基，新生不定芽率72.38％，不定芽增殖系数1.54。

还比较了不同类型不定芽的增殖效果，结果见表6。

表6不同类型的不定芽增殖效果

从表6可以看出：细弱不定芽增殖系数高于短壮不定芽，但同时细弱不定芽也常在基部形成芽茎，影响了芽本身的生长和增壮。故在增殖方面细弱不定芽好于短壮不定芽，但在壮苗方面则短壮不定芽好于细弱不定芽。

(7)诱导试管鳞茎

表7丛生芽诱导试管鳞茎

注：各处理分别为：1：丛生芽不经低温处理转入含30g·L^-1蔗糖的无激素MS培养基中光照16h/d、23±1℃培养；2：不经低温处理转入含60g·L^-1蔗糖的无激素MS培养基中光照16h/d、23±1℃培养；3：不经低温处理转入含90g·L^-1蔗糖的无激素MS培养基中光照16h/d、23±1℃培养；4：5℃低温处理3个月后转入含60g·L^-1蔗糖的无激素MS培养基中光照16h/d、23±1℃培养。

从表7可以看出，老鸦瓣丛生芽不经低温处理而单进行不同蔗糖浓度处理无法得到试管鳞茎，丛生芽诱导试管鳞茎需经2-3个月的5℃左右低温预处理过程然后再转入到含60g·L^-1蔗糖的无激素MS培养基中23±1℃、16h/d光照条件培养2-3个月即可得到试管鳞茎。

从试验例1可以得出，采用实施例1中的外植体、培养基和诱导途径，建立的老鸦瓣无性快繁体系效果最好，且经丛生芽可得到典型的试管鳞茎，老鸦瓣试管苗的繁殖系数大，繁殖周期短，试管鳞茎还具有耐贮藏、耐运输、移栽成活率高的优点，能保证种苗的数量和质量，最终解决种苗的生产及供应问题，实现了老鸦瓣的可持续利用。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种老鸦瓣无性快繁体系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)外植体准备

采集自然休眠的老鸦瓣鳞茎，冲洗消毒，于0～2℃进行湿沙冷藏层积处理，3.5～4.5个月取出作为外植体；

(2)外植体消毒

除去外植体绒毛层，饱和洗衣粉溶液清洗后，剖取保留完整基部的芯芽，先用酒精，再用升汞浸泡消毒，无菌水冲洗，吸干表面水分；

(3)初代诱导

将消毒后的外植体接种于初代诱导培养基中培养，1～2个月后形成鳞芽和芽茎；所述初代诱导培养基为：含蔗糖30g·L^-1、琼脂5-7g·L^-1、pH5-6的MS培养基；所述初代诱导的培养条件为：光照1500-3000lx，温度22±1℃，光照时间8-16h/d，湿度70％～80％；

(4)诱导愈伤组织、生成不定芽

将芽茎切段接种于愈伤组织诱导培养基中培养，30～50天得到愈伤组织；将愈伤组织接种于继代增殖培养基中进行继代增殖；1～2个月后将增殖后的芽茎愈伤组织切块接种于不定芽分化培养基中培养2-3个月，完成不定芽、丛生芽分化，生成不定芽和丛生芽；所述愈伤组织诱导培养基为：含6-BA 0.5-1.0mg·L^-1、NAA1.0-2.0mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂5-7g·L^-1、pH5-6的MS培养基；所述愈伤组织继代增殖培养基为：含6-BA 0.2-1.0mg·L^-1、NAA 0.5-2.0mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂5-7g·L^-1、pH5-7的MS培养基；所述愈伤组织不定芽分化培养基为：含6-BA1.0-2.0mg·L^-1、NAA 0-0.5mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂5-7g·L^-1、pH5-6的MS培养基；

或者将鳞芽接入不定芽诱导培养基中，直接诱导生成不定芽；所述不定芽诱导培养基为：含6-BA 0.5-2.0mg·L^-1、NAA 0.01-0.5mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂5-7g·L^-1、pH5-6的MS培养基；

(5)增殖和壮苗

将步骤(4)获得的不定芽中的细弱不定芽转入增殖培养基中增殖，得到再生不定芽，再转入壮苗培养基中壮苗得到生根的基部膨大的试管苗，即为老鸦瓣无性快繁体系；

将步骤(4)获得的不定芽中的短壮不定芽直接转入壮苗培养基中进行壮苗，得到生根的基部膨大的试管苗，即为老鸦瓣无性快繁体系；

所述不定芽增殖培养基为：含6-BA 0.2～1.0mg·L^-1、NAA 0-0.2mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂5-7g·L^-1、pH5-6的MS培养基；所述壮苗培养基为：含6-BA0-0.2mg·L^-1、NAA 0-0.2mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂5-7·L^-1、pH5-6的MS培养基；

(6)诱导基部膨大呈鳞茎状的试管苗

将步骤(3)中的鳞芽和芽茎接入含蔗糖30g·L^-1、琼脂5-7g·L^-1、pH5-6的MS培养基中培养，1.5～2.5个月后，芽茎顶端直接形成小鳞茎或芽茎顶端爆开形成粗壮试管苗，鳞芽直接形成试管苗；1.5～2.5个月后形成基部膨大呈鳞茎状的试管苗，即为老鸦瓣无性快繁体系；

(7)诱导试管鳞茎

将步骤(4)中增殖得到的丛生芽于3-6℃暗处理1-3个月后，转入含30-90g·L^-1蔗糖的无激素MS培养基中，于温度22-24℃、光照8-16h/d条件培养2-3个月，得到膨大、成熟的试管鳞茎，即为老鸦瓣无性快繁体系。

2.根据权利要求1所述的老鸦瓣无性快繁体系的建立方法，其特征在于，步骤(4)中，所述愈伤组织诱导培养基为：含6-BA 0.5mg·L^-1、NAA 2.0mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂6.5g·L^-1、pH5.8的MS培养基。

3.根据权利要求1所述的老鸦瓣无性快繁体系的建立方法，其特征在于，步骤(4)中，所述愈伤组织继代增殖培养基为：含6-BA 0.5mg·L^-1、NAA 2.0mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂6.5g·L^-1、pH5.8的MS培养基。

4.根据权利要求1所述的老鸦瓣无性快繁体系的建立方法，其特征在于，步骤(4)中，所述愈伤组织不定芽分化培养基为：含6-BA 2.0mg·L^-1、NAA0.2mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂6.5g·L^-1、pH5.8的MS培养基。

5.根据权利要求1所述的老鸦瓣无性快繁体系的建立方法，其特征在于，步骤(4)中，所述鳞芽不定芽诱导培养基为：含6-BA 1.0mg·L^-1、NAA0.01mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂6.5g·L^-1、pH5.8的MS培养基。

6.根据权利要求1所述的老鸦瓣无性快繁体系的建立方法，其特征在于，步骤(5)中，所述不定芽增殖培养基为：含6-BA 0.2～0.5mg·L^-1、NAA 0.2mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂6.5g·L^-1、pH5.8的MS培养基；所述壮苗培养基为：含NAA0.2mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂6.5g·L^-1、pH5.8的MS培养基。

7.根据权利要求1所述的老鸦瓣无性快繁体系的建立方法，其特征在于，步骤(7)中，所述试管鳞茎的诱导方法为：将步骤(4)中增殖得到的丛生芽于5℃暗处理2-3个月后，转入含60g·L^-1蔗糖的无激素MS培养基中，于23℃、光照16h/d培养2-3个月，得到膨大、成熟的试管鳞茎。

8.根据权利要求1所述的老鸦瓣无性快繁体系的建立方法，其特征在于，所述步骤(4)中用于诱导愈伤组织的芽茎为短缩芽茎的芽茎顶端，用于增殖的愈伤组织为愈伤组织类型II。

9.根据权利要求1所述的老鸦瓣无性快繁体系的建立方法，其特征在于，步骤(3)中，所述初代诱导培养基为：含蔗糖30g·L^-1、琼脂6.5g·L^-1、pH5.8的MS培养基。

10.根据权利要求1-9任一项所述的老鸦瓣无性快繁体系的建立方法，其特征在于，步骤(1)中，所述湿沙冷藏层积处理为：将鳞茎与灭过菌的河沙以1∶2-4的体积比混匀后放入不完全密封的自封袋中，所述河沙的含水量为6wt％～8wt％。