CN103602758A

CN103602758A - 快速检测猪嵴病毒的荧光定量pcr试剂盒及应用

Info

Publication number: CN103602758A
Application number: CN201310521544.8A
Authority: CN
Inventors: 兰道亮; 陈亚冰; 李键; 熊显荣; 符梅; 王长松; 华修国
Original assignee: Southwest Minzu University
Current assignee: Southwest Minzu University
Priority date: 2013-10-30
Filing date: 2013-10-30
Publication date: 2014-02-26

Abstract

本发明公开了一种用于检测猪嵴病毒的SYBRGreen

Description

快速检测猪嵴病毒的荧光定量 PCR 试剂盒及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及发明一种快速检测猪嵴病毒的SYBR Gree

实时荧光定量PCR试剂盒。该试剂盒可高效方便地对临床样本中猪嵴病毒进行检测及定量，可以用于猪嵴病毒病毒的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。

背景技术

猪嵴病毒（Porcine kobuvirus,PKoV）是一种无囊膜正链RNA病毒，属小RNA病毒科，嵴病毒属。自2007年，猪嵴病毒在匈牙利被首次检测到后，很快在中国大陆、亚洲其他国家（包括泰国、日本、韩国）、南美的巴西及欧洲荷兰等国被发现，而且感染率均较高，从16.7%到 99.0%不等。研究数据表明在具有腹泻症状的猪群中，阳性率明显高于无腹泻症状的猪群，可能暗示其对猪具有一定的致病性。

尽管如此，猪嵴病毒是否与肠道疾病有关，现在尚无定论，关于致病机制方面的研究成果也未见报道。但是在猪粪样品中检出率较高，长期处于隐性感染状态，可能对宿主产生不利影响。相关报道指出，在对仔腹泻猪粪便样品的病原分子检测中，常引起腹泻的猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒均为阴性，少数轮状病毒为阳性，而猪嵴病毒的阳性率最高，因此，推测该病毒可能与仔猪腹泻有关。

鉴于此，研发一种快速检测猪嵴病毒感染的荧光定量PCR试剂盒，可高效方便地对临床样本中猪嵴病毒进行检测及定量，可用于猪嵴病毒的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。

国内学者徐志文、赵勤等发明了一种检测猪嵴病毒的RT-PCR试剂盒，RT-PCR用于病毒病的诊断虽然具有灵敏度高、快速、特异的特点。但是存在无法对检测样品进行准确定量、检测通量不高，并且电泳等PCR后的处理过程容易造成污染而出现假阳性，限制了该方法的应用。

荧光定量PCR技术作为PCR技术的发展，以其独特的优势广泛应用于众多领域的研究中。为了建立一种较为快速准确的检测猪嵴病毒的检测方法，本研究选择了SYBR Green I 荧光染料法。与TaqMan探针法相比较，SYBR Green I 荧光染料法操作简便，成本更为廉价。通过优化实时荧光定量PCR反应体系参数，我们发明了一种用于猪嵴病毒检测的SYBR Green荧光定量PCR检测试剂盒。该方法引入了特异性扩增引物以及SYBR Green Buffer体系，使得检测的灵敏度和特异性得到了很大程度的增强，并避免了漏检和误检，该试剂盒能够达到快速准确检测的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测猪嵴病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒适用于目前市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪。该检测方法相对于传统的检测方法具有灵敏度高、效率高的优点。

本发明试剂盒可以应用于（抗）猪嵴病毒药物的研究，可对生物制品进行定量检测及质量监控，可用于猪嵴病毒引起的流行病学的调查。总之，该试剂盒能够为相关的基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。

为了达到以上目的，本发明采取以下技术方案：

试剂盒的组成及使用方法：

1.试剂盒的组成

a)RNA裂解液，b) PrimeScript® RT Enzyme Mix I，c)逆转录反应液，d)定量引物F及R e) SYBR® Premix Ex Taq II，f) ROX Reference Dye,g)标准阳性模板，h)阴性对照品i)无菌双蒸水

所述逆转录反应液含有5×PrimeScript® Buffer， Oligo dT Primer，Random 6 mers引物。

荧光定量引物F及R，分别为（SEQ IDNO 1）和（SEQ IDNO 2）所示的核苷酸序列。

标准阳性模板是含有猪嵴病毒特异性目的片段的质粒，该质粒转化到大肠杆菌DH5a增殖后用碱裂解法提取，经过DNA纯化试剂盒纯化，分光光度计吸光值A260下定量，-20℃保存。

阴性对照样品由SPF猪粪便样品中提取RNA，经过逆转录获得的cDNA样品。

SYBR® Premix Ex Taq II液含有TaKaRa Ex Taq HS，dNTP Mixture，Mg2+，Tli RNaseH，SYBR® Green I，购自大连宝生物公司。

ROX Reference Dye购自大连宝生物公司，其使用于Life Technologies等公司的Real Time PCR扩增仪上，用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System和StepOnePlus^TM使用ROX Reference Dye，7500 Real-Time PCR System和 7500 Fast Real-Time PCR System使用ROX Reference Dye II。Thermal Cycler Dice Real Time System II、LightCycler®/ LightCycler®480 System(Roche Diagnostics) 或 CFX96Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad)等Real Time PCR扩增仪不必使用。

本发明通过优化反应体系，如引物浓度、退火温度等的优化，建立了检测猪嵴病毒的定性及定量的试剂盒，该试剂盒的灵敏度达到7.02×10¹ copies/μl，完全可以满足猪嵴病毒的快速检测及定量的要求。

该试剂盒的使用方法：

1)RNA裂解法从待测样本中提取RNA，进行逆转录反应，反应产物于-20℃保存；

2)将标准阳性模板稀释到不同浓度的标准样品，待用；

3)取1）步中的cDNA和2）步中的标准品作为模板，添加定量引物F及R、SYBR® Premix Ex Taq II反应液进行荧光定量PCR反应对样品核酸含量进行定量。

本发明与其它常规的检测方法具有以下优点及效果：

1、高灵敏度，最低的检测限度能够达到7.02×10¹ copies/μl；

2、省时、高效,整个反应过程包括核酸提取和cDNA制备、定量检测仅需3个小时；

3、适用于大批量样品检测；

4、该试剂盒可以应用于（抗）猪嵴病毒药物的研究，可对生物制品进行定量检测以及质量监控，适用范围较广。

附图说明

图1：PKoV SYBR Green 荧光定量RT-PCR融解曲线；

图2：PKoV SYBR Green 荧光定量RT-PCR标准曲线；

图3：PkoV SYBR Green 荧光定量RT-PCR特异性检验扩增图；1-4：PEDV、PRV、TGEV、NTC；5：PkoV；

图4：PKoV SYBR Green 荧光定量RT-PCR敏感性检验扩增图；1-10：7.02×10⁹、

7.02×10⁸、7.02×10⁷、7.02×10⁶、7.02×10⁵、7.02×10⁴、7.02×10³、7.02×10²、7.02×10¹、7.02×10⁰；11：NTC。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1猪嵴病毒荧光定量试剂盒组成

1试剂盒组成

按照每个试剂盒检测30个样品计，每次检测样品时设阳性、阴性对照，试剂盒组成：

RNA裂解液30ml，每个样品用1ml。

逆转录酶共30μl,每个样品用1μl。

逆转录反应液共90μl，每个样品用3μl。

荧光定量上、下游引物各200μl,每个反应各用1μl。

上游引物F：5’-TGATGCGGAGCCTACTGAAC-3’

下游引物R：5’-GCTATGATGGTAAGGACGAAAC-3’

SYBR® Premix Ex Taq II液共2.5ml，每个反应添加12.5μl。

标准阳性模板(7.02×10⁹copies/μl)共20μl。

阴性对照品：用PBS液将样品按照1：10的比例稀释SPF猪粪便样品，涡旋振动5 min。在4℃条件12000r/min离心15min,取上清液提取RNA,逆转录获得cDNA,共30μl,每次用1μl。

自备试剂：氯仿、异丙醇、DEPC处理的无菌双蒸水、DEPC处理过的无菌双蒸水配置的75%乙醇。

实施例2对临床样本的检测

1)标准曲线的制作：将阳性模板进行10倍系列稀释制成阳性标准品，取阳性标准品2μl, SYBR® Premix Ex Taq II 12.5μl,灭菌蒸馏水8.5μl，Primer F 1μl，Primer R 1μl，FTC-2000荧光定量基因扩增仪上平行做PCR检测，每个阳性标准品做三个平行对照。反应条件为95℃变性30sec；95℃变性30sec，55℃退火25sec，72℃延伸20sec，40个循环；溶解曲线分析。以阳性标准品稀释度的对数为横坐标，Ct值为纵坐标，建立标准曲线。从标准曲线可以看出，该荧光定量方法在PSV核酸为7.02×10¹-7.02×10⁹拷贝/反应之间呈现良好的线性关系，扩增效率为99%，标准方程为：Ct=-3.3507x+39.186（R²=0.9975）。

2)病毒RNA提取：采集临床样本，加适量PBS缓冲液悬浮适量的猪粪样品，4℃离心机中12 000 r/min 离心15 min，取上层液相200μL转移到另一无RNase的1.5ml离心管中，并加入1mL Trizol试剂，混合均匀后，静置5min；再加入200μL的氯仿，混合均匀，静置5min；同样4℃离心机中 12 000 r/min 离心15 min，取上层液相750μL，加入等体积的异丙醇，混合均匀，室温静置10min； 4℃条件下 12 000 r/min 离心10min，弃掉上清液，加入1ml 使用DEPC水配置的75%的乙醇溶液，4℃ 12000 r/min 离心5 min 弃掉乙醇溶液，待残余乙醇溶液挥发完全后，加入30μl的DEPC水溶解核酸物质，置于-80℃条件下保存备用。

3)逆转录反应：反应体系：PrimeScript® RT Enzyme Mix I 1.0μL、逆转录反应液3μL 、RNA 6μL；反应条件：42 ℃ 15 min，85℃ 5s，cDNA置于-20℃保存备用或立即进行荧光定量扩增反应。

4)荧光定量检测反应：反应体系：cDNA 1.0μL、SYBR® Premix Ex Taq II （2x）12.5μL、Primer F 1μL、Primer R 1μl、灭菌双蒸水9.5μl；反应条件：95℃变性30sec；95℃变性30sec，55℃退火25sec，72℃延伸20sec，40个循环；溶解曲线分析。

5)PCR反应结束后，将获得的Ct值代入标准方程，换算得出临床样本中病毒核酸的拷贝数。

6)特异性分析：以猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PRV)及猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)核酸物质作为模板，并设置NTC（No Template Control）及阳性对照，采用本研究建立的SYBR Green I 实时荧光定量PCR方法进行检测。结果（见图3）显示该试剂盒能够特异性地扩增猪嵴病毒基因。

7)敏感性检验：重组质粒进行10倍倍比稀释,稀释后的各浓度为7.02×10⁹ 、7.02×10⁸ 、7.02×10⁷ 、7.02×10⁶ 、7.02×10⁵ 、7.02×10⁴ 、7.02×10³ 、7.02×10² 、7.02×10¹ 、7.02×10⁰ copies/μL。结果（见图4）显示本方法可以有效检测出猪嵴病毒最低核酸量拷贝量为7.02×10¹ copies/μL

8)重复性检验分析：选取7.02×10⁹ 、7.02×10⁷ 、7.02×10⁵拷贝/μL 三个浓度作为模板，每个浓度做3次重复, 在同一反应参数下进行检测，反应结束后，计算Ct值的变异系数（标准偏差/平均数），评价重复性。结果为：

经统计学分析,其组间变异系数分别为0.1003%、0.3797%、0.4720%，均小于1%,表明该试剂盒具有很好的重复性及稳定性。

SEQUENCE LISTING

<110> 西南民族大学

<120> 快速检测猪嵴病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用

<160> 2

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

tgatgcggag cctactgaac

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gctatgatgg taaggacgaa ac

Claims

1.一快速定量检测猪嵴病毒的荧光定量PCR试剂盒，试剂盒包括：

所述逆转录反应液含有5×PrimeScript® Buffer， Oligo dT Primer，Random 6 mers引物，

标准阳性模板是含有猪嵴病毒特异性目的片段的质粒，阴性对照样品由SPF猪粪便样品中提取RNA，经过逆转录获得的cDNA样品，SYBR® Premix Ex Taq II液含有TaKaRa Ex Taq HS，dNTP Mixture，Mg²+，Tli RNaseH，SYBR® Green I。

2.根据权利要求1所述的猪嵴病毒荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述引物F序列为5’-TGATGCGGAGCCTACTGAAC-3’,R序列为5’-GCTATGATGGTAAGGACGAAA-3’。

3.根据权利要求1所述的定量检测试剂盒，其特征在于灵敏度达到7.02×10¹ copies/μl，完全可以满足猪嵴病毒的快速检测及定量的要求。