CN103585114B - 一种改进的制备艾塞那肽缓释微球的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物制剂领域，公开了一种改进的制备艾塞那肽缓释微球的方法以及由该方法制备的艾塞那肽缓释微球。在本发明的方法中，先将聚合物在二氯甲烷中溶解后，再与甲醇溶液混合，保证聚合物较快溶解后，再加入艾塞那肽或艾塞那肽和保护剂，加快了艾塞那肽和聚合物的溶解速率，减少了艾塞那肽与有机溶剂的接触时间以及聚合物溶解过程中溶剂的挥发损失，同时极大地提高了艾塞那肽在油相中的溶解度，提高了载药量，减少了药物在制备过程中的降解，简化了工艺，缩短了制备周期。

Description

一种改进的制备艾塞那肽缓释微球的方法

技术领域

本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种改进的制备艾塞那肽缓释微球的方法。

背景技术

缓释微球是一种重要的缓释型药物输送系统。其通过将活性成分包封入聚合物中，使活性成分长期稳定地从微球中释放出来，从而达到缓释控释的目的。

已经报道的微球制备方法有多种，例如溶剂挥发法，相分离法，喷雾干燥法，低温喷雾提取法等。

相分离法工艺基本步骤为：在高分子材料溶液中，将药物溶解或分散成混悬液或乳状液，通过降低温度、调节pH值或加入脱水剂、非溶剂等方法，使高分子材料溶解度降低而从溶液中析出，最后固化成球。相分离过程主要用于水溶性药物，如：蛋白质、多肽、疫苗等。常用的有机溶剂有：二氯甲烷、乙腈、醋酸乙酯和甲苯等。制备过程受高分子材料影响较大，还有溶剂残留问题。而美国Amylin公司即采用相分离法制备了长效艾塞那肽缓释剂型Bydureon，其也可称为W/O/O凝聚法，制备工艺较为复杂。首先将药物溶解于水相，与含有聚合物的油相乳化，制备W/O初乳，再采用二甲基硅油凝聚微球，庚烷/乙醇固化得到缓释一周的艾塞那肽微球。该方法使用多种有机溶剂，后期还需采用大量的庚烷漂洗，以及长达84h的真空氮气吹扫，以便去除微球中残留溶剂，其成本较高且环境友好性差，同时使用溶剂的后期处理也存在诸多问题。

针对这些问题，文献报道中对艾塞那肽微球开展的研究多集中于采用溶剂挥发法方面，该方法也是多肽蛋白类药物最常用的制备方法。溶剂挥发法又分为复乳溶剂挥发法和单乳溶剂挥发法。

复乳溶剂挥发法，又有W/O/W法、S/O/W法等。W/O/W法大致操作是：将蛋白质、多肽药物溶解在水溶液中，然后将得到的含有药物的水溶液（W）分散在含有聚合物的有机溶剂(O)中，形成一级乳液(W/O)，再将其分散在另一个水相(W)中，形成二级乳液(W/O/W)，待有机溶剂挥发后，聚合物析出，得到包封了药物的微球。采用该方法时，药物以水溶液形式被包封，使工艺放大成为可能，并且可得到较高的包封率和收率，但需要两步乳化，存在制备过程繁琐，工艺中的影响因素较多等问题，同时由于制备过程中需要超声、均化或高速剪切处理，增加了多肽蛋白药物与油水界面的接触，使药物易于降解。而S/O/W法只进行一步乳化，因而处方工艺的影响因素较W/O/W法较少，药物多以微米级粒子的形式悬浮于油相中，再用外水相乳化后制备。该方法可避免油水界面对药物稳定性的影响，但由于药物微粒以固体粒子的形式被包裹，存在包封率低等问题，并且该工艺需先将药物制备成微米级，在制备工艺的选择和制备过程中也存在药物尤其是多肽蛋白类药物的稳定性及无菌操作等问题。

单乳溶剂挥发法，又称单乳化法，其大致过程为：将蛋白质、多肽药物和聚合物一起溶解在一种有机溶剂或多种有机溶剂的混合物中，然后将其分散在水相中。待有机溶剂挥发后，聚合物析出，得到包封了药物的微球。由于多肽一般溶于水，单乳化法的包封率一般较低。所以该方法更多见于水不溶性药物的包埋。艾塞那肽制备方法中也有报道采用单乳溶剂挥发法，且均采用二氯甲烷和甲醇作为油相。例如在Liang,Rongcai等的报道Effectofwateronexenatideacylationinpoly(lactide-co-glycolide)microspheres（参见InternationalJournalofPharmaceutics,2013,1(454),344-353）中，先将艾塞那肽溶于甲醇，再与溶有聚合物的二氯甲烷混合，制备成油相后再与外水相形成单乳。而艾塞那肽在甲醇中的溶解度有限，若想提高载药量，必须提高温度或长期振荡超声处理，加剧了多肽的变性。而在Li,Xingang等的报道Applicationofmodel-basedmethodstocharacterizeexenatide-loadeddouble-walledmicrospheres:Invivorelease,pharmacokinetic/pharmacodynamicmodel，andinvitroandinvivocorrelation（参见JournalofPharmaceuticalSciences,2012,10(101),3946-3961）中，是将艾塞那肽和聚合物同时溶于二氯甲烷/甲醇的混合溶剂然后再与外水相乳化形成微球，其聚合物的溶解速率大大降低。这些方法存在的问题或为药物在溶剂中溶解困难，或为聚合物在溶剂中的溶解困难，以致多肽药物在有机溶剂的溶解过程中变性，或聚合物在溶剂中的溶解时间较长，有机溶剂挥发，导致聚合物浓度变化工艺难以重现，最终造成影响制剂的理化特性等问题。此外，由于受药物溶解性的限制，微球的载药量也难以得到提高。

发明内容

本发明针对普通单乳溶剂挥发法存在的上述缺陷，提供了一种改进的制备艾塞那肽缓释微球的方法以及由该方法制备的艾塞那肽缓释微球，该方法避免了普通单乳溶剂挥发法中药物的溶解性和聚合物的溶解速率问题，减少了艾塞那肽与有机溶剂的接触时间，避免了变性的产生，增加了药物在有机溶剂中的溶解性，提高了载药量。

为了实现上述目的，本发明一方面提供了一种改进的制备艾塞那肽缓释微球的方法，包括如下步骤：

1、将聚合物溶解于二氯甲烷；

2、将步骤1中溶有聚合物的二氯甲烷溶液与甲醇溶液混合，制成澄清溶液；

3、向步骤2中含聚合物的二氯甲烷/甲醇混合溶液中加入艾塞那肽或加入艾塞那肽和保护剂，混合，形成油相溶液或油相混悬液；

4、将步骤3中的油相注入外水相中形成单乳水溶液；

5、待步骤4中单乳水溶液中的有机溶剂挥发、固化后，收集，冷冻干燥，制得艾塞那肽缓释微球。

艾塞那肽在甲醇中溶解性较低，为略溶或微溶，而在二氯甲烷中几乎不溶。而本发明在研究中惊奇的发现艾塞那肽在甲醇/二氯甲烷混合溶剂中的溶解度和溶解速率均得到提高，特别是在一定体积比例的甲醇/二氯甲烷混合溶剂中溶解度和溶解速率更是大幅增加，完全可以满足提高载药量，实现较好的体外释放等要求。同时，由于减少了与有机溶剂的接触时间，也增加了多肽药物的稳定性。

此外，聚合物在二氯甲烷中易于溶解，在甲醇中不溶，而在二氯甲烷/甲醇混合溶剂中溶解性较低，易于析出。因此，在本发明所采用的方法中，先将聚合物在二氯甲烷中溶解后，再与甲醇混合，保证聚合物较快溶解后，再加入艾塞那肽或艾塞那肽和保护剂，实现了药物较大的溶解度以及较快的溶解速度，大大的简化了制备工艺，并缩短了制备时间。

在本发明的一个优选实施方案中，步骤2中溶有聚合物的二氯甲烷溶液与甲醇溶液优选以体积比为0.1:1-10:1的比例进行混合。

本发明步骤1中的聚合物包括聚乳酸、聚羟基乙酸、聚己内酯、聚酐或由上述聚合物组成的共聚物和共混物。在一个优选的实施方案中，聚合物优选为聚乳酸-羟基乙酸共聚物。

在本发明优选的实施方案中，聚合物以5%-40%（W/V）的浓度溶解在二氯甲烷中。

本发明步骤3中的保护剂包括糖类、氨基酸、氢氧化镁、氧化锌、氯化锌、叔丁基对羟基茴香醚、二丁基苯酚、生育酚、肉豆蔻酸异丙酯、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、醋酸-醋酸钠缓冲盐中的一种或几种。

保护剂溶解于油相中或微粉化后混悬于油相中。在优选的实施方案中，微粉化后的平均粒径为1-500μm，保护剂在油相中的浓度为0.05%-10%（W/V）。

本发明步骤4中的外水相为加入或不加入外水相渗透压调节剂的含有表面活性剂的水溶液。

外水相中渗透压调节剂包括甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、氨基酸、氯化钠中的一种或几种，渗透压调节剂的浓度为0.1%-15%（W/V）。

外水相中表面活性剂的浓度为0.1%-5%（W/V），在一个优选的实施方案中，表面活性剂为聚乙烯醇。

本发明步骤3中的药物艾塞那肽以0.1%-10%（W/V）的浓度溶解在步骤2中制备的澄清溶液中。

此外，本发明另一方面还提供了按照本发明的制备方法所获得的艾塞那肽缓释微球。

本发明针对目前研究中存在的问题，对普通的O/W单乳溶剂挥发法进行了改进，较普通单乳溶剂挥发法加快了艾塞那肽和聚合物的溶解速率，减少了艾塞那肽与有机溶剂的接触时间以及聚合物溶解过程中溶剂的挥发损失，同时极大地提高了艾塞那肽在油相中的溶解度，提高了载药量，减少了药物在制备过程中的降解，优化了工艺。与普通单乳溶剂挥发法相比，本发明制备工艺简单，制备周期大大缩短。

附图说明

图1：实施例1中普通单乳溶剂挥发法所制备的艾塞那肽缓释微球制剂体外累积释放曲线图。

图2：实施例2中改进单乳溶剂挥发法所制备的艾塞那肽缓释微球制剂体外累积释放曲线图。

图3：实施例3中改进单乳溶剂挥发法所制备的艾塞那肽缓释微球制剂体外累积释放曲线图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。

本发明所使用的缩写的含义列于下表中。

英文缩写	中文含义
		PLGA	聚乳酸羟基乙酸共聚物
HEPES	4-羟乙基哌嗪乙磺酸
		Tween80	吐温80

实施例1：普通单乳溶剂挥发法制备艾塞那肽缓释微球

称取艾塞那肽0.75g，超声30min使溶解于75mL甲醇。称取聚乳酸羟基乙酸共聚物24g（75/25，0.2dL/g）溶于75mL二氯甲烷中。将甲醇和二氯甲烷涡旋混合10s，呈澄清溶液，将其注入机械搅拌下的15L1%的聚乙烯醇水溶液中得复乳，将此复乳持续搅拌3h以上挥发除去有机溶剂，离心，洗涤，收集得到微球，微球平均粒径约34μm，载药量2.60%，包封率为85.9%，总杂质量为3.04%。

实施例2：改进单乳溶剂挥发法制备艾塞那肽缓释微球

称取聚乳酸羟基乙酸共聚物24g（75/25，0.2dL/g）溶于75mL二氯甲烷中，加入甲醇75mL，将混合溶液涡旋10s，呈澄清溶液，称取艾塞那肽2.00g，加入混合溶液，涡旋10s呈澄清溶液，将其注入机械搅拌下的15L1%的聚乙烯醇水溶液中得复乳，将此复乳持续搅拌3h以上挥发除去有机溶剂，离心，洗涤，收集得到微球，微球平均粒径约39μm，载药量6.65%，包封率为86.4%，总杂质量为0.55%。

实施例3：改进单乳溶剂挥发法制备艾塞那肽缓释微球

称取聚乳酸羟基乙酸共聚物24g（50/50，0.2dL/g）溶于100mL二氯甲烷中，加入甲醇50mL，将混合溶液涡旋10s，呈澄清溶液，称取艾塞那肽2.00g和微粉化的醋酸锌1.50g，加入混合溶液，涡旋呈混悬液，将其注入机械搅拌下的15L0.5%的聚乙烯醇和5%的氯化钠水溶液中得复乳，将此复乳持续搅拌3h以上挥发除去有机溶剂，离心，洗涤，收集得到微球，微球平均粒径约41μm，载药量6.94%，包封率为90.2%，总杂质量为0.98%。

实施例4：艾塞那肽缓释微球体外释放度的测定

将上述实施例制备的艾塞那肽缓释微球进行体外释放度的测定。测定方法是：精密称取含药微球20mg置于聚丙烯离心管中，以pH为7.4的HEPES缓冲液10mL（含10mMHEPES，100mMNaCl和0.02%Tween80）为释放介质，置于恒温水浴摇床中，在温度为37℃±0.5℃，振荡速度100rpm的条件下进行微球的体外释放度测定。分别在预定的时间点各取9mL释放介质用于高效液相色谱法测定艾塞那肽的含量，并补充新鲜释放介质。实施例1、2和3所制备的艾塞那肽缓释微球的体外累积释放曲线分别如附图1、2和3所示。

从附图1的数据可以看出，采用普通单乳溶剂挥发法制备的艾塞那肽缓释微球30天仅释放了70.2%，存在释放不完全，载药量低，且杂质量较大等问题。而从附图2和3的数据可以看出，采用改进后的单乳溶剂挥发法制备的艾塞那肽缓释微球30天体外释放不仅达到了80%以上，并且载药量大大提高，杂质量也明显降低。

Claims (9)

1.一种改进的制备艾塞那肽缓释微球的方法，包括如下步骤：

1)将聚合物溶解于二氯甲烷，所述聚合物包括聚乳酸、聚羟基乙酸、聚己内酯、聚酐或由上述聚合物组成的共聚物和共混物，所述的聚合物以5％-40％(W/V)的浓度溶解在二氯甲烷中；

2)将步骤1)中溶有聚合物的二氯甲烷溶液与甲醇溶液混合，制成澄清溶液，溶有聚合物的二氯甲烷溶液与甲醇溶液以体积比为0.1:1-10:1的比例混合；

3)向步骤2)中含聚合物的二氯甲烷/甲醇混合溶液中加入艾塞那肽或加入艾塞那肽和保护剂，混合，形成油相溶液或油相混悬液；

4)将步骤3)中的油相注入外水相中形成单乳水溶液；

5)待步骤4)中单乳水溶液中的有机溶剂挥发、固化后，收集，冷冻干燥，制得艾塞那肽缓释微球。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤3)中所述的保护剂包括糖类、氨基酸、氢氧化镁、氧化锌、氯化锌、叔丁基对羟基茴香醚、二丁基苯酚、生育酚、肉豆蔻酸异丙酯、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、醋酸-醋酸钠缓冲盐中的一种或几种。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤3)中所述的保护剂溶解于油相中或微粉化后混悬于油相中，微粉化后的平均粒径优选为1-500μm，保护剂在油相中的浓度优选为0.05％-10％(W/V)。

4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤4)中所述的外水相为加入或不加入外水相渗透压调节剂的含有表面活性剂的水溶液。

5.根据权利要求4所述的方法，其中渗透压调节剂包括甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、氨基酸、氯化钠中的一种或几种。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其中外水相中渗透压调节剂的浓度为0.1％-15％(W/V)。

7.根据权利要求4或5所述的方法，其中外水相中表面活性剂的浓度为0.1％-5％(W/V)。

8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤3)中所述的药物艾塞那肽以0.1％-10％(W/V)的浓度溶解在步骤2)中制备的澄清溶液中。

9.按照权利要求1所述的方法制备的艾塞那肽缓释微球。