CN103570804B - 一种具皮肤活性的多肽的合成方法 - Google Patents
一种具皮肤活性的多肽的合成方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103570804B CN103570804B CN201310412975.0A CN201310412975A CN103570804B CN 103570804 B CN103570804 B CN 103570804B CN 201310412975 A CN201310412975 A CN 201310412975A CN 103570804 B CN103570804 B CN 103570804B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- boc
- dab
- pro
- ala
- product obtained
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title abstract description 33
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title abstract description 18
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title abstract description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 title abstract description 10
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims abstract description 53
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims abstract description 53
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 18
- WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N benzylamine Chemical compound NCC1=CC=CC=C1 WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 claims abstract description 16
- WCFJUSRQHZPVKY-UHFFFAOYSA-N 3-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]propanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)NCCC(O)=O WCFJUSRQHZPVKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 claims abstract description 7
- ZPGDWQNBZYOZTI-SFHVURJKSA-N (2s)-1-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonyl)pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 ZPGDWQNBZYOZTI-SFHVURJKSA-N 0.000 claims abstract description 6
- LIWKOFAHRLBNMG-FQEVSTJZSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-4-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]butanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CCNC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 LIWKOFAHRLBNMG-FQEVSTJZSA-N 0.000 claims abstract description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 39
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical group C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 11
- ZZDRDGKSMGGBDI-KRWDZBQOSA-N (2s)-4-azaniumyl-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)butanoate Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CCN)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 ZZDRDGKSMGGBDI-KRWDZBQOSA-N 0.000 claims description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 10
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 10
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N Trifluoroethanol Chemical compound OCC(F)(F)F RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- YEDUAINPPJYDJZ-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxybenzothiazole Chemical compound C1=CC=C2SC(O)=NC2=C1 YEDUAINPPJYDJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 3
- 150000003053 piperidines Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000007821 HATU Substances 0.000 claims description 2
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 claims description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 abstract description 13
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 9
- 238000009833 condensation Methods 0.000 abstract description 4
- 230000005494 condensation Effects 0.000 abstract description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 abstract description 4
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 11
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 9
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 7
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 7
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 7
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 6
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 4
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 4
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 4
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 3
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical class [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M Trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 2
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- REITVGIIZHFVGU-IBGZPJMESA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](COC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 REITVGIIZHFVGU-IBGZPJMESA-N 0.000 description 1
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101500004391 Tropidolaemus wagleri Waglerin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000015296 acetylcholine-gated cation-selective channel activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040006409 acetylcholine-gated cation-selective channel activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000001153 anti-wrinkle effect Effects 0.000 description 1
- -1 carbobenzoxy-(Cbz) Chemical class 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 230000006837 decompression Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N diethylamine Chemical compound CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000004118 muscle contraction Effects 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001242 postsynaptic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000005201 scrubbing Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000003746 solid phase reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010671 solid-state reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 1
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 1
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 1
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及H-β-Ala-Pro-Dab-NH-Bzl的制备方法，所述方法包括以下步骤：(1)使Fmoc-L-Dab(Boc)-OH与2-Cl-Trt树脂连接；(2)对(1)中制得的产物的氨端进行脱保护；(3)使(2)中制得的产物与Fmoc-L-Pro-OH在缩合剂存在下进行缩合反应；(4)对(3)中制得的产物的氨端进行脱保护；(5)使(4)中制得的产物与Boc-β-Ala-OH在缩合剂存在下进行缩合反应；(6)对(5)中制得的产物进行切割；(7)使(6)中制得的产物与苄胺在缩合剂存在下进行缩合反应；(8)对(7)中制得的产物进行脱保护，本发明方法的产率比单独液相合成提高10%以上。
Description
技术领域
本发明涉及多肽的制备方法。更具体地讲，本发明涉及H-β-Ala-Pro-Dab-NH-Bzl的制备方法。
背景技术
H-β-Ala-Pro-Dab-NH-Bzl是一种模拟蛇毒毒素Waglerin I活性的小分子多肽，临床试验表明该多肽可以通过抑制肌肉收缩而减少皱纹的产生，具有优秀的光滑和迅速祛皱性能。H-β-Ala-Pro-Dab-NH-Bzl作用于突触后膜，是肌肉烟碱乙酰胆碱受体(mmAChR)可逆转的拮抗剂。寻找一种合适的合成方法对于该小分子多肽的产业化具有重要意义。
多肽合成常用的化学合成方法有液相合成和固相合成。对于小分子多肽，一般氨基酸小于10个氨基酸的多肽，通用的方法是采用液相合成的方法，但是液相合成的方法步骤较多，比较繁琐，全部采用液相的合成方法得到的粗品的纯度不高，总产率也不高。采用固相合成，除去难度较大之外，成本效益比也极低。完全采用固相合成或完全采用液相合成都不可避免各方法的局限性。
发明内容
我们分析了H-β-Ala-Pro-Dab-NH-Bzl的结构，选择液相和固相结合的反应方式会具有一定优势，先将Dab羧端连接到氯树脂上，然后逐步接肽，接肽完成后再用弱酸将全保护多肽从树脂上切割下来后再用液相方法连接苄胺，最后脱保护得到粗品肽。
首先我们将Fmoc-Dab(Boc)-OH与2-Cl-Trt树脂结合制得Fmoc-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂，氯树脂的优势在于其可以在较低的酸性下即可将多肽从树脂上切割下来，从而不影响氨基酸的保护基而得到全包护多肽。
在制得Fmoc-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂后，依次用哌啶DMF溶液脱除Fmoc保护，接上Fmoc-Pro-OH和Boc-β-Ala-OH，制得Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂。然后用三氟乙醇和低浓度的三氟乙酸将全包护多肽从树脂上切割下来，得到Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-OH，再与苄胺在缩合剂存在下进行缩合反应，制得Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-NH-Bzl。
最后采用HCl/乙酸乙酯或者三氟乙酸将Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-NH-Bzl的保护基脱除得到H-β-Ala-Pro-Dab-NH-Bzl的盐酸盐或者三氟乙酸盐。
本发明提供了一种采用固相液相结合的方法合成H-β-Ala-Pro-Dab-NH-Bzl的方法，所述方法包括以下步骤：
首先我们将Fmoc-Dab(Boc)-OH与2-Cl-Trt树脂结合制得Fmoc-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂，氯树脂的优势在于其可以在较低的酸性下即可将多肽从树脂上切割下来，从而不影响氨基酸的保护基而得到全包护多肽。
在制得Fmoc-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂后，依次用哌啶DMF溶液脱除Fmoc保护，接上Fmoc-Pro-OH和Boc-β-Ala-OH，制得Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂。然后用三氟乙醇和低浓度的三氟乙酸将全包护多肽从树脂上切割下来，得到Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-OH。
最后采用HCl/乙酸乙酯或者三氟乙酸的有机溶剂溶液将Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-OH的保护基脱除得到H-β-Ala-Pro-Dab-NH-Bzl盐酸盐粗品。
进一步的，所述方法还包括将制得的H-β-Ala-Pro-Dab-NH-Bzl盐酸盐粗品经C18反相柱用洗脱液洗脱，包括用低压柱和高压柱(HPLC)得到精制的H-β-Ala-Pro-Dab-NH-Bzl。
所述洗脱液为含有0.1～2％的HOAC或0.1～1%的TFA等反离子酸，并且含有一定浓度的有机溶剂如乙腈、甲醇和乙醇的水溶液，洗脱方式可以采用等度或梯度洗脱，将收集的洗脱液进行浓缩，冷冻干燥。
我们对三肽H-β-Ala-Pro-Dab-NH-Bzl进行了收率及纯度分析，结果证明，本发明的方法优于单独的固相合成或液相合成，相比单纯液相合成方法操作简单，有效地防止了副反应的发生，粗肽的纯度也大幅度提高，相应的产率也比单独液相合成提高10%以上，取得了意想不到的技术效果。
具体实施方式
尽管不希望受任何理论的限制，但是认为本发明是以下面的事实为基础：由于1)DAB三肽为仅含有三个氨基酸残基的小肽；2)DAB的羧端与苄胺形成了酰胺键，因此在合成过程中可以采用固液相结合的办法来合成。
申请人将Fmoc-DAB-OH，Fmoc-Pro-OH，Boc-β-Ala-OH与氯树脂进行逐步接肽，在弱酸三氟乙醇或1%三氟乙酸将保护三肽从树脂上切割下来，然后与苄胺缩合得到全保护三肽，最后脱去保护得到三肽的三氟乙酸盐，采用C18反相脱盐纯化，冻干得到DAB三肽纯品。
1.Fmoc-Dab(Boc)-OH和氯树脂偶联的制备
2-Cl-Trt树脂用DCM溶胀，将Fmoc-Dab(Boc)-OH用有机溶剂溶解后加入到树脂中，加入有机碱调节pH值至一定值，震荡反应超过10个小时，最后用甲醇/DIPEA/DCM封闭得到Fmoc-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂。
在该步反应中采用Fmoc-作为氨基保护剂，此外所述氨基保护剂还可选自常用于多肽合成中的任意保护剂，如苄氧羰基(Z)。
所用的溶剂可选自N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、NMP等，优选使用二氯甲烷。
所用的有机碱可选自N-甲基吗啉(NMM)、三乙胺和DIPEA(二异丙基乙基胺)等，优选使用二异丙基乙基胺。
反应温度可为-10℃至室温。
2.脱保护
Fmoc保护的氨基酸树脂的脱保护可采用哌啶/DMF或二乙胺/DMF等脱保护试剂来实施，但较优选哌啶/DMF。
3.Fmoc-Pro-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂的制备
Fmoc-Pro-OH及HOBt用DMF或DCM溶解，冰水浴冷却，加入DIC活化，将活化后的氨基酸加入上述已脱保护好的树脂当中，反应2～3小时。
所用的溶剂可选自N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、NMP等，优选使用N,N-二甲基甲酰胺。
所用的耦合体系可选为DIC/HOBt，HBTU/DIPEA或HATU/DIPEA或DCC/HOBT或PyBop等，优选使用DIC/HOBt。
反应温度可为0℃～30℃。
4.H-Pro-DAB(Boc)-2-Cl-Trt树脂的制备
Fmoc的脱保护与(2)类似
5.Boc-β-Ala-Pro-DAB(Boc)-2-Cl-Trt树脂的制备
Boc-β-Ala的偶联与(3)类似
6.Boc-β-Ala-Pro-DAB(Boc)-OH的制备
取干燥的肽树脂于干燥的圆底烧瓶中。加冰冻冷却的三氟乙醇或1%三氟乙酸/DMF切割液。以8ml/g树脂的量加入中。冰浴冷却切割反应0.5h，室温切割1.5h。过滤，滤液冰乙醚沉淀出全包护粗肽。离心分离出粗肽。
切割试剂可以选自三氟乙醇或1%三氟乙酸/DMF，但优选三氟乙醇。
7.Boc-β-Ala-Pro-DAB(Boc)-NH-Bzl的制备
将Boc-β-Ala-Pro-DAB(Boc)-OH用溶剂溶解，加入缩合剂，随后在一定温度下与苄胺的有机溶液混合反应，在反应过程中采用有机碱维持pH值在一定范围内。得到Boc-β-Ala-Pro-DAB(Boc)-NH-Bzl。
所用的溶剂可选自四氢呋喃、重蒸的DMF、NMP等，优选使用四氢呋喃。
所用的有机碱可选自N-甲基吗啉(NMM)、三乙胺和DIEA(二异丙基乙基胺)等，优选使用NMM。
在该步反应中选用DCC/HOBt作为缩合剂，此外所述缩合剂还可选自DIC、HBTU、BOP等常用于多肽合成中的任意缩合剂。
在反应过程中，当pH较低时，反应产物的纯度将降低，而pH太高时，将使产率降低。因此，优选将pH控制在8～9范围内。
反应温度可为-10℃至室温。
8.HCl·H-β-Ala-Pro-DAB-NH-Bzl的制备
脱保护可采用HCl/乙酸乙酯或TFA/二氯甲烷等脱保护试剂来实施，但较优选使用HCl/乙酸乙酯作为脱保护试剂。
9.精制冻干
将制得的HCl·H-β-Ala-Pro-DAB–NH-Bzl粗产品先预处理，即用水溶解并过滤后调节pH至5～6，采用C18反相柱进行脱盐纯化，冻干得终产品为H-β-Ala-Pro-DAB–NH-Bzl。
利用C18反相柱进行脱盐纯化可采用等度或梯度洗脱，洗脱液为含有0.5～1.5％的HOAC或0.1%的TFA等反离子酸，并且含有浓度范围在0～30％的乙腈水溶液，为了方便操作，本发明的一个实施例中采用三步梯度洗脱，洗脱液分别为含1％HOAC和2％乙腈的水溶液、含1％HOAC和3％乙腈的水溶液、含1％HOAC和4％乙腈的水溶液。也可以采用乙醇或甲醇等与水混溶的溶剂，一般说来选用乙腈的分离效果要好于醇类溶剂；三氟乙酸也可以替代醋酸作为反离子，虽然其分离效果要比醋酸好，但是由于产品中一般不能残留三氟乙酸所以我们避免了三氟乙酸而选择了醋酸。关于选择这种梯度我们确实经过了一定的摸索，选择该梯度分离效果较佳，洗脱时间适宜。pH值为根据该肽的等电点以除去盐酸盐来选择的，流速没有意义，和柱子的大小长短有关。
将收集的洗脱液进行冷冻干燥48小时得最终产品。
在本文中，所用试剂的缩写为：
DIC：二异丙基碳二亚胺
DCC：二环己基碳二亚胺
HOBt：1-羟基苯并三氮唑
NMM：N-甲基吗啉
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
实施例1.Fmoc-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂的制备
称取2-Cl-Trt树脂80g(88mmol)和Fmoc-Dab(Boc)-OH38.75g(88mmol)，将其加入磨口圆底烧瓶中，然后加入DIPEA157ml(880mmol)和DCM800ml，摇匀，密封后在摇床上震荡反应17h。用DMF洗涤树脂，加入DCM850ml，甲醇100ml，DIPEA50ml混合液封闭20min。封闭结束后用DMF600ml洗涤树脂四次，DCM600ml洗涤树脂二次。抽走溶剂。MeOH600ml，300ml，300ml收缩树脂三次。真空抽干。称重90.72g。干燥低温保存。
实施例2.Fmoc-Pro-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂的制备
称取干燥Fmoc-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂90.72g(40mmol)于固相反应合成柱中。800ml DCM溶胀树脂20min，抽走。用400ml DMF洗涤树脂三次。用400ml20%piperidine/DMF脱Fmoc二次。400ml DMF*4，400ml DCM*2洗涤树脂。抽走溶剂。
称取Fmoc-Ser(tBu)-OH、HOBT.H2O于干燥500ml广口三角瓶中。加适量DMF溶剂溶解。置于冰水浴中冷却。加DIC活化3min，避免水汽。将活化后的氨基酸加入上一步树脂中反应2h。抽走反应液。用适量DMF洗涤树脂2min*3次。
实施例3.Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂的制备
Fmoc-Pro-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂用400ml20%piperidine/DMF脱Fmoc二次。400ml DMF*4，400ml DCM*2洗涤树脂。抽走溶剂。
称取Boc-β-Ala-OH、HOBT·H2O于干燥500ml广口三角瓶中。加适量DMF溶剂溶解。置于冰水浴中冷却。加DIC活化3min，避免水汽。将活化后的氨基酸加入上一步树脂中反应2h。抽走反应液。用适量DMF洗涤树脂2min*3次。
实施例4.Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-OH的制备
称取干燥至恒重的Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂肽树脂，加适当的三氟乙醇裂解液(1g/10mL)切割反应45min。反应结束后，用砂芯漏斗过滤分离树脂。将滤液旋干，得到全保护粗肽。置于真空干燥器干燥至恒重。
实施例5.Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-NH-Bzl的制备
Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-OH，HOBt用250ml无水四氢呋喃溶解，冷至0℃，缓慢加入DCC，0℃搅拌5分钟，然后加入苄胺及N-甲基吗啉。0℃搅拌2小时，用N-甲基吗啉维持pH8～9，室温搅拌12小时，TLC(氯仿/甲醇/乙酸，20/1/0.4)显示原料点消失。反应混合物过滤，滤液减压浓缩，残留物用石油醚反复研磨，得到的固体加1500ml乙酸乙酯溶解，分别用饱和NaHCO3水溶液(75ml×3)，饱和NaCl水溶液(75ml×1)，5％KHSO4水溶液(75ml×3)，饱和NaCl水溶液(15ml×3)洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压旋干得到粗品(产率98％)。
实施例6.HCl·H-β-Ala-Pro-Dab–NH-Bzl的制备
Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-NH-Bzl，0℃下缓慢加入250ml4M HCl/乙酸乙酯，于0℃搅拌1.5小时，反应液出现大量沉淀，TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点消失，过滤，沉淀用乙酸乙酯(50ml×3)和无水乙醚(50ml×3)反复洗涤至无HCl，得目标化合物粗品(85％)。
实施例7.精制
采用C18反相柱纯化脱盐。
粗品预处理：60g HCl·H-β-Ala-Pro-Dab–NH-Bzl分成5份，分别用5ml水溶解，过滤。
填料：C18，柱长800mm，内径50mm，
洗脱条件：梯度洗脱，流速2ml/min，先用2％乙腈1％HOAC水溶液洗脱，硝酸银溶液检测氯离子，接收液无氯后换为10％乙腈1％HOAC水溶液，1小时后再转换为15％乙腈1％HOAC水溶液。
收集样品：采用TLC茚三酮显色方法检测样品的流出情况，并根据HPLC检测数据收集主成分，合并洗脱液，冷冻干燥24小时后，再次加入蒸馏水溶解续冻干48小时得37g终产品白色冻干粉末(产率68％，纯度99.8%)。
已经通过非限定性实施例对本发明作出了举例说明。但本领域的技术人员会理解，在没有偏离本发明的宗旨和范围下，可以对本发明作出各种修改、替换和变更。
Claims (5)
1.一种制备具有以下结构的三肽的合成方法：
所述方法包括以下步骤：
(1)使Fmoc-L-Dab(Boc)-OH与2-Cl-Trt树脂连接，制得Fmoc-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂；
(2)对(1)中制得的产物的氨端进行脱保护，脱除保护基团；
(3)使(2)中制得的产物与Fmoc-L-Pro-OH在缩合剂存在下进行缩合反应，制得Fmoc-Pro-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂；
(4)对(3)中制得的产物的氨端进行脱保护，脱除保护基团；
(5)使(4)中制得的产物与Boc-β-Ala-OH在缩合剂存在下进行缩合反应，制得Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂；
(6)对(5)中制得的产物进行切割，得到Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-OH；
(7)使(6)中制得的产物与苄胺在缩合剂存在下进行缩合反应，制得Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-NH-Bzl；以及
(8)对(7)中制得的产物进行脱保护得到H-β-Ala-Pro-Dab-NH-Bzl；
其中，在步骤(3)、步骤(5)和步骤(7)中所用的缩合剂选自：DIC/HOBt、HBTU/DIPEA、HATU/DIPEA、DCC/HOBT或PyBop；在步骤(2)和步骤(4)中的脱保护采用5％～50％哌啶的有机溶剂溶液；在步骤(6)的切割反应采用三氟乙醇或者1～10％三氟乙酸；在步骤(8)的脱保护采用HCl/乙酸乙酯或三氟乙酸/有机溶剂，所述有机溶剂选自四氢呋喃、DMF、NMP、二氯甲烷。
2.权利要求1的方法，其中还包括在步骤(8)后将制得的产物经C18反相柱纯化脱盐，任选将收集的洗脱液进行浓缩并冷冻干燥。
3.权利要求2的方法，C18反相纯化可以为低压制备或高压制备。
4.权利要求2的方法，其中所述用洗脱液为含有0.5～1.5％的HOAC或0.1％的TFA反离子酸，并且含有浓度范围在0～30％的乙腈水溶液，洗脱方式可以采用等度或梯度洗脱。
5.权利要求4的方法，其中所述梯度洗脱程序为：含1％HOAC、2％乙腈的水溶液，含1％HOAC、3％乙腈的水溶液，含1％HOAC、4％乙腈的水溶液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310412975.0A CN103570804B (zh) | 2013-09-11 | 2013-09-11 | 一种具皮肤活性的多肽的合成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310412975.0A CN103570804B (zh) | 2013-09-11 | 2013-09-11 | 一种具皮肤活性的多肽的合成方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103570804A CN103570804A (zh) | 2014-02-12 |
| CN103570804B true CN103570804B (zh) | 2015-04-15 |
Family
ID=50043580
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310412975.0A Active CN103570804B (zh) | 2013-09-11 | 2013-09-11 | 一种具皮肤活性的多肽的合成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103570804B (zh) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104327155A (zh) * | 2014-10-20 | 2015-02-04 | 张嘎 | 一种含有15n—l—脯氨酸残基的三肽型减皱化合物及其制备方法和应用 |
| CN104592348A (zh) * | 2015-01-16 | 2015-05-06 | 张嘎 | 一种含有3,4-脱氢-l-脯氨酸残基的三肽减皱化合物及其制备方法和应用 |
| CN107936108A (zh) * | 2017-12-05 | 2018-04-20 | 陕西慧康生物科技有限责任公司 | 一种类蛇毒三肽的液相合成方法 |
| CN107857797A (zh) * | 2017-12-07 | 2018-03-30 | 陕西慧康生物科技有限责任公司 | 一种类蛇毒三肽的液相片段合成方法 |
| CN108929371A (zh) * | 2018-08-02 | 2018-12-04 | 哈尔滨师范大学 | 一种Phakellistatin13直链衍生物、其制备办法及用途 |
| CN113045623A (zh) * | 2019-12-27 | 2021-06-29 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 一种蛇毒肽syn-ake的液相合成方法 |
| CN110950926B (zh) * | 2019-12-31 | 2020-10-16 | 山东济肽生物科技有限公司 | 类蛇毒三肽的液相合成方法 |
| CN112409445A (zh) * | 2020-11-24 | 2021-02-26 | 浙江湃肽生物有限公司 | 一种类蛇毒三肽的固相合成方法 |
| CN112430253A (zh) * | 2020-11-24 | 2021-03-02 | 浙江湃肽生物有限公司 | 一种类蛇毒三肽的液相合成方法 |
| CN115969728A (zh) * | 2021-08-16 | 2023-04-18 | 深圳市维琪科技股份有限公司 | 肽衍生物在制备用于皮肤修复紧致的组合物中的新用途 |
| CN114380887A (zh) * | 2021-12-09 | 2022-04-22 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 一种类蛇毒三肽的液相片段合成方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101061134A (zh) * | 2004-11-02 | 2007-10-24 | 彭特法姆股份公司 | 新型可局部施用的抗表情皱纹和与年龄相关的皱纹的活性物质 |
-
2013
- 2013-09-11 CN CN201310412975.0A patent/CN103570804B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101061134A (zh) * | 2004-11-02 | 2007-10-24 | 彭特法姆股份公司 | 新型可局部施用的抗表情皱纹和与年龄相关的皱纹的活性物质 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 固相多肽合成中氨基酸保护的研究进展;邱芊等;《化工时刊》;20050625;第19卷(第6期);第56-62页 * |
| 多肽固相合成法中的3个关键点;符友伟等;《化学工业与工程》;20100715;第27卷(第4期);第370-375页 * |
| 李正超等.多肽合成方法研究进展.《武警后勤学院学报(医学版)》.2013,第22卷(第2期),第153-157页. * |
| 采用固-液相相结合法合成聚乙二醇化胸腺五肽;李倩等;《中国生化药物杂志》;20101020;第31卷(第5期);第289-292页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103570804A (zh) | 2014-02-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103570804B (zh) | 一种具皮肤活性的多肽的合成方法 | |
| CN102428097B (zh) | 地加瑞克的制造方法 | |
| CN101918429B (zh) | 肽的生产和纯化方法 | |
| Jad et al. | Peptide synthesis beyond DMF: THF and ACN as excellent and friendlier alternatives | |
| TWI515201B (zh) | 用於製造地蓋瑞利（ｄｅｇａｒｅｌｉｘ）及其中間產物的方法（二） | |
| CN107857797A (zh) | 一种类蛇毒三肽的液相片段合成方法 | |
| CN110894225B (zh) | 一种μ-芋螺肽的规模化制备纯化方法以及应用 | |
| CN103992383B (zh) | 一种制备艾替班特的方法 | |
| EP3156413B1 (en) | Ganirelix precursor and method for preparing ganirelix acetate by using anirelix precursor | |
| CN103242431A (zh) | 一种比伐卢定的制备方法 | |
| CN110054662B (zh) | 一种固相合成Etelcalcetide的方法 | |
| CN106632609A (zh) | 一种六胜肽的制备方法及其产品 | |
| CN111978369B (zh) | 一种制备多肽的方法 | |
| CN104892732A (zh) | 一种西曲瑞克的制备方法 | |
| CN104177478A (zh) | 一种合成地加瑞克的方法 | |
| CN107474107A (zh) | Glyx‑13的制备方法及用于制备glyx‑13的化合物 | |
| CN114213503A (zh) | 一种类蛇毒三肽的合成方法 | |
| CN107056894A (zh) | 一种片段法固相合成醋酸加尼瑞克的方法 | |
| CN104211801A (zh) | 一种制备利西拉来的方法 | |
| TW202235429A (zh) | 含ｎ－置換－胺基酸殘基之胜肽化合物的製備方法 | |
| CN109280078A (zh) | 一种制备维拉卡肽的方法 | |
| CN104619717B (zh) | β-转角模拟肽环状化合物的合成 | |
| CN104017058A (zh) | 一种制备醋酸加尼瑞克的方法 | |
| CN107778350A (zh) | 一种合成罗米地辛的方法 | |
| WO2016012938A2 (en) | Improved process for preparation of amorphous linaclotide |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Zhang Jiyong Inventor before: Ding Wenfeng |
|
| COR | Change of bibliographic data | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Ding Wenfeng Inventor after: Zhang Jiyong Inventor before: Ding Wenfeng |
|
| COR | Change of bibliographic data | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20200106 Address after: 523000 Room 501, building 6, No. 19, Alishan Road, Songshanhu Park, Dongguan City, Guangdong Province Patentee after: Dongguan Weiqi Technology Co.,Ltd. Address before: 518000 science and Technology Innovation Park, Xixiang the Peach Garden, Guangdong, Shenzhen, Baoan District B-201 Patentee before: SHENZHEN WINKEY MEDICAL RESEARCH DEVELOPMENT Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20211206 Address after: 518000 area B, 3 / F, building 7, phase III, Huangtian yangbei Industrial Zone, Huangtian community, Hangcheng street, Bao'an District, Shenzhen City, Guangdong Province Patentee after: SHENZHEN WINKEY MEDICAL RESEARCH DEVELOPMENT Co.,Ltd. Address before: 523000 Room 501, building 6, No.19 Alishan Road, Songshanhu Park, Dongguan City, Guangdong Province Patentee before: Dongguan Weiqi Technology Co.,Ltd. |
|
| CP03 | Change of name, title or address | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: Room 2401, Building D3, Nanshan Zhiyuan, No. 1001 Xueyuan Avenue, Changyuan Community, Taoyuan Street, Nanshan District, Shenzhen, Guangdong 518000 Patentee after: Shenzhen Weiqi Technology Co.,Ltd. Address before: 518000 area B, 3 / F, building 7, phase III, Huangtian yangbei Industrial Zone, Huangtian community, Hangcheng street, Bao'an District, Shenzhen City, Guangdong Province Patentee before: SHENZHEN WINKEY MEDICAL RESEARCH DEVELOPMENT Co.,Ltd. |