CN115969728A - 肽衍生物在制备用于皮肤修复紧致的组合物中的新用途 - Google Patents

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Abstract

通式(I)的肽衍生物或其盐在制备用于皮肤修复紧致的组合物中的新用途，所述皮肤修复紧致包括提高成纤维细胞的活性、促进角质形成细胞增殖和迁移、修复光损伤、修复皮肤屏障、增加皮肤弹性或提高皮肤紧致度中的一种或多种。
Figure DDA0004047592880000011

Description

肽衍生物在制备用于皮肤修复紧致的组合物中的新用途
技术领域
本发明属于活性多肽技术领域，具体涉及肽衍生物在制备用于皮肤修复紧致的组合物中的新用途。
背景技术
皮肤是人体最大和最重要的器官，被覆盖于整个人体的表面，由表皮、真皮和皮下组织构成。
角质形成细胞是表皮的主要构成细胞。根据不同分化阶段和特点，角质形成细胞由内至外分别为基底层、棘层、颗粒层、透明层和角质层。最外层的角质层一般由5～20层已经死亡的扁平细胞组成。这些细胞没有细胞核或其他的细胞结构，细胞中充满了角蛋白和无定形基质组成的复合物，变得比较坚韧，从而在皮肤表面形成一道坚实的皮肤屏障。
真皮层的成纤维细胞能促进胶原蛋白合成，胶原蛋白分子相互交叉形成纤维，在皮肤中构成一张细密的胶原纤维网，增加皮肤的连接强度和稳定性。胶原蛋白是人体皮肤中的重要成分，其具有巨大的锁水功能，直接决定着皮肤的水润度、光滑度、紧致度和皮肤年龄。
随着年龄的增长，长时间的暴晒或紫外辐射，角质形成细胞的增殖速度和分化发生改变，参与基底层细胞黏附的分子，如整联蛋白或角质形成细胞黏附分子的表达下降，另外皮肤屏障功能也会减弱。真皮层细胞外基质的构成也随老化的进程发生退行性改变，包括胶原蛋白大量流失，同时成纤维细胞合成的胶原蛋白也减少，这导致各种支撑皮肤的胶原肽键出现硬化、断裂，导致皮肤真皮层网状结构疏松，随即被破坏，出现塌陷，皮肤组织的保湿度和强韧性降低，皮肤随即出现干燥、皱纹、松弛等问题。
随着经济的发展，生活水平的提高，人们越来越注重皮肤护理，抗衰修复护肤市场规模巨大，需要更多的活性物质应用于皮肤修复紧致的产品中，以满足消费者需求。
发明内容
本发明人通过大量实验研究，结果发现，一种肽衍生物具有修复紧致皮肤的功效，由此完成了本发明。
因此，本发明旨在提供一种肽衍生物或其盐在制备用于皮肤修复紧致的组合物中的新用途。所述皮肤修复紧致包括提高成纤维细胞的活性、促进角质形成细胞增殖和迁移、修复光损伤、修复皮肤屏障、增加皮肤弹性或提高皮肤紧致度中的一种或多种。
通式(I)所示的肽衍生物或其盐，
Figure BDA0004047592860000021
通式(I)中，
X表示碳键或NH-CH(C＝O)-(CH2)3+n-NH-R5，
n表示0、1或2，
R1、R4和R5彼此独立地表示氢、取代的或未取代的C1-C24烷基、取代的或未取代的C2-C24烯基、脒基或四-C1-C6-烷基脒鎓，
R2表示氢、取代的或未取代的C1-C24烷基，
或者
R1和R4与它们所结合的残基一起表示5-至7-的饱和环，
R3表示C1-C12-烷氧基、C1-C12-烷基氨基、取代的或未取代的芳基-C1-C6-烷基氨基、取代的或未取代的杂芳基-C1-C6-烷基氨基、取代的或未取代的芳基-C1-C6-烷氧基、取代的或未取代的杂芳基-C1-C6-烷氧基，并且
R6表示氢，或者当n是1时，也表示氨基，或者与R1以及R6和R1所结合的残基一起表示5-至7-的饱和环，
R7表示H、F、Cl、Br、I、-OH、-OR8或R9-CO-O-，
R8和R9彼此独立地表示取代的或未取代的C1-C24烷基、取代的或未取代的C2-C24烯基。
术语“烷基”是指具有1-24个碳原子(可选具有1-16个碳原子；可选具有1-14个碳原子；可选具有1-12个碳原子；可选具有1、2、3、4、5、或6个的碳原子)的饱和脂肪族直链或支链的烷基；可选选自：甲基、乙基、异丙基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、2-乙基己基、2-甲基丁基、或5-甲基己基。
术语“烯基”是指具有2-24个碳原子(可选具有2-16个碳原子；可选具有2-14个碳原子；可选具有2-12个碳原子、可选具有2、3、4、5、或6个碳原子)的直链或支链烯基，所述“烯基”具有一个或多个碳-碳双键，可选具有1、2或3个共轭或非共轭的碳-碳双键；所述“烯基”是通过一个单键而结合至分子的其余部分；可选选自：乙烯基、油烯基、或亚油烯基。
如在本技术领域中所理解的，在上述的基团中可以有一定程度的取代。因此，在本发明中的任何基团中都可以有取代。在本文件中提及的在本发明的基团中的取代的基团指示规定的基团可以在一个或多个可用的位置、优选在1、2、或3个位置、更优选在1或2个位置、还更优选在1个位置上被一个或多个取代基取代。这些取代基包括例如并且不局限于：C1-C4烷基；羟基；C1-C4烷氧基；氨基；C1-C4氨基烷基：C1-C4羰氧基；C1-C4氧基羰基；卤素(如氟、氯、溴、以及碘)；氰基；硝基；叠氮化物；C1-C4烷基磺酰基；硫醇；C1-C4烷硫基；C6-C30芳氧基如苯氧基；-NRb(C＝NRb)NRbRc，其中Rb和Rc是独立地选自：H、C1-C4烷基、C2-C4烯基、C2-C4炔基、C3-C10环烷基、C6-C18芳基、C7-C17芳烷基、具有三至十元的杂环基、或氨基的保护基。
可选地，R1表示H。
可选地，R2表示H或甲基。
可选地，R3表示芳基-C1-C6-烷基氨基。
可选地，R7表示H或者-OH。
通式(I)所示的肽衍生物或其盐选自：
(1)H-Ala-Hyp-Arg-Arg-NH-苄基；
(2)H-(β-Ala)-Hyp-Dab-NH-苄基；
(3)H-Dap-Hyp-Dab-NH-苄基；
(4)H-Ala-Hyp-Arg-NH-(CH2)2-苯基；
(5)H-Ala-Pro-Arg-Arg-NH-苄基；
(6)H-(β-Ala)-Pro-Dab-NH-苄基；
(7)H-Dap-Pro-Dab-NH-苄基；
(8)H-Ala-Pro-Arg-NH-(CH2)2-苯基。
本发明中所使用的氨基酸缩写遵循IUPAC-IUB的生物化学命名委员会在EurJ.Biochem.(1984)138：9-37和J.Chem(1989)264：633-673中指定的规则。
Ala指的是丙氨酸，β-Ala指的是β-丙氨酸，Pro指的是脯氨酸，Hyp指的是羟脯氨酸，Arg指的是精氨酸，Dap指的是2，3-二氨基丙酸，Dab指的是2，4-二氨基丁酸。
本发明的这些肽可以作为立体异构体或立体异构体的混合物存在；例如，包含它们的这些氨基酸可以具有L-、D-的构型、或彼此独立地是外消旋的。因此，有可能获得同分异构混合物以及外消旋混合物或非对映混合物、或纯的非对映异构体或对映异构体，这取决于不对称碳的数量和存在什么同分异构体或同分异构混合物。本发明的这些肽的优选的结构是纯的同分异构体，即，对映异构体或非对映异构体。
可选地，所述组合物包含质量百分浓度为0.0001％-5％的通式(I)所示的肽衍生物或其盐；
可选地，所述组合物包含质量百分浓度为0.0005％-1％的通式(I)所示的肽衍生物或其盐；
可选地，所述组合物包含质量百分浓度为0.001％-0.1％的通式(I)所示的肽衍生物或其盐；
可选地，所述组合物包含质量百分浓度为0.005％-0.01％的通式(I)所示的肽衍生物或其盐。
上述通式(I)所示的肽衍生物或其盐，能够提高成纤维细胞的活性、促进角质形成细胞增殖和迁移、修复光损伤、修复皮肤屏障、增加皮肤弹性或提高皮肤紧致度。
上述通式(I)所示的肽衍生物的盐包括通式(I)所示的肽衍生物的金属盐，所述金属包括：锂、钠、钾、钙、镁、锰、铜、锌或铝；
可选地，上述通式(I)所示的肽衍生物的盐包括通式(I)所示的肽衍生物与有机碱形成的盐，所述有机碱包括：乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、组氨酸或哌嗪；
可选地，上述通式(I)所示的肽衍生物的盐包括通式(I)所示的肽衍生物与无机酸或有机酸形成的盐，所述有机酸包括：乙酸、柠檬酸、乳酸、丙二酸、马来酸、酒石酸、延胡索酸、苯甲酸、天冬氨酸、谷氨酸、琥珀酸、油酸、三氟乙酸、草酸、扑酸或葡萄糖酸；
可选地，所述无机酸包括：盐酸、硫酸、硼酸或碳酸。
上述通式(I)所示的肽衍生物或其盐，可以使用在肽化学领域中本身已知的方法来完整地形成通式(I)的化合物，例如固相合成法、液相合成法或固相与液相结合的方法，还可以通过以产生所希望的序列为目标的生物技术方法、或通过具有动物、真菌、或植物来源的蛋白质的控制水解来制备。
例如，一种获得具有通式(I)的肽衍生物的方法包括以下步骤：
-将具有受保护的N-末端和自由的C-末端的氨基酸与具有自由的N-末端和受保护的或与固体载体结合的C-末端的氨基酸偶联；
-消除保护N-末端的基团；
-重复该偶联顺序和消除保护N-末端的基团，直到获得所希望的肽序列；
-消除保护C-末端的基团或从该固体载体裂解。
优选地，C-末端与一种固体载体结合并且该方法是在固相上进行，包括将具有受保护的N-末端和自由的C-末端的氨基酸与具有自由的N-末端和与一种聚合物载体结合的C-末端的氨基酸偶联；消除保护N-末端的基团；并且重复此顺序所需要的次数以便因此获得具有所希望的长度的肽，接着从最初的聚合物载体裂解所合成的肽。
在整个合成中这些氨基酸的侧链的官能团用临时或永久的保护基团保持充分地保护，并且可以与从该聚合物载体裂解肽的过程同时地或正交地脱保护。
该方法可以包括如下另外的步骤：使用本领域已知的标准条件和方法对N-末端和C-末端脱保护和/或以非确定的次序从聚合物支持体裂解肽，随后可以修饰所述末端的官能团。可以对与聚合物支持体结合的通式(I)的肽进行N-末端和C-末端的任选的修饰，或在肽已从聚合物支持体裂解后进行N-末端和C-末端的任选的修饰。
上述通式(I)所示的肽衍生物或其盐，可以掺入到美容上或药学上可接受的递送系统或缓释系统中。
术语“递送系统”是指与本发明的肽衍生物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体，它们选自：水、油或表面活性剂、包括石油来源、动物来源、植物来源、或合成来源的那些，例如并且不限于花生油、大豆油、矿物油、芝麻油、蓖麻油、聚山梨醇酯、脱水山梨糖醇酯、醚硫酸酯、硫酸酯、甜菜碱、葡萄糖苷、麦芽糖苷、脂肪醇、壬苯醇醚、泊洛沙姆、聚氧乙烯、聚乙二醇、右旋糖、甘油、毛地黄皂苷和类似物。本领域的普通技术人员已知在可以给予本发明的肽衍生物的不同递送系统中可以使用的稀释剂。
术语“缓释”以常规含义使用，指提供化合物在一段时间内逐渐释放的化合物的递送系统，且优选地但不是必须地，在整个时间段内具有相对恒定的化合物释放水平。
递送系统或缓释系统的实例是脂质体、油质体、非离子型表面活性剂脂质体囊泡、醇质体、毫米胶囊、微米胶囊、纳米胶囊、纳米结构的脂质载体、海绵状物、环糊精、类脂囊泡、胶束、毫米球、微米球、纳米球、脂质球、微米乳液、纳米乳液、毫米粒子、微米粒子或纳米粒子。优选的递送系统或缓释系统是脂质体和微米乳液，更优选具有反胶束的内部结构的油包水型微米乳液。
缓释系统可以通过现有技术中已知的方法来制备，并且可以例如通过以下方式来给予：通过局部或经皮给药，包括粘附贴剂、非粘附贴剂、封闭贴剂、以及微电子贴剂；或通过全身给药例如并且不局限于，口服或胃肠外途径，包括鼻、直肠、皮下植入或注射、或直接植入或注射至特定身体部位中，并且优选地应该释放相对恒定量的本发明的这些肽衍生物。在该缓释系统中包含的肽衍生物的量将取决于例如该组合物将被给予的部位、本发明的肽衍生物的释放动力学和持续时间、以及有待治疗和/或护理的病状、病症和/或疾病的性质。
上述通式(I)所示的肽衍生物或其盐，还可以吸附在固体有机聚合物或固体无机支撑体上，例如并且不局限于，滑石、膨润土、二氧化硅、淀粉、或麦芽糖糊精等。
本发明所述组合物是美容组合物或药物组合物。
所述组合物存在于一种制剂中，选自：霜剂、油、奶、香膏、泡沫、洗剂、凝胶、擦剂、浆液、皂、洗发精、润发乳、血清、软膏、摩丝、润发油、粉末、杆剂、笔剂、喷雾剂、气溶胶、胶囊剂、片剂、颗粒剂、口香糖、溶液、混悬液、乳剂、糖浆剂、酏剂、多糖薄膜、胶冻或明胶。
本发明所述组合物还包含至少一种用于增强本发明所述皮肤修复紧致的作用的其他活性剂，所述其他活性剂选自肽类、天然植物成分、维生素C及其衍生物或类视黄醇类。
本发明相对于现有技术所取得的有益效果包括：
本发明所述通式(I)所示的肽衍生物或其盐，可以提高成纤维细胞的活性、促进角质形成细胞增殖和迁移、修复光损伤、修复皮肤屏障、增加皮肤弹性、提高皮肤紧致度，从而具有良好的皮肤修复紧致效果，能够应用于皮肤修复紧致的产品中。
附图说明
图1是肽(2)及肽(6)对NIH3T3细胞增殖的影响图。*表示给药组与空白对照组相比具有统计学差异，p＜0.05(n＝4)。**表示给药组与空白对照组相比差异显著，p＜0.01(n＝4)。***表示给药组与空白对照组相比差异极为显著，p＜0.001(n＝4)。
图2是肽(2)及肽(6)对HaCaT细胞增殖的影响图。*表示给药组与空白对照组相比具有统计学差异，p＜0.05(n＝4)。**表示给药组与空白对照组相比差异显著，p＜0.01(n＝4)。***表示给药组与空白对照组相比差异极为显著，p＜0.001(n＝4)。
图3是100ppm肽(1)～肽(6)对NIH3T3细胞增殖的影响图。***表示给药组与空白对照组相比差异极为显著，p＜0.001(n＝4)。
图4是100ppm肽(1)～肽(6)对HaCaT细胞增殖的影响图。*表示给药组与空白对照组相比具有统计学差异，p＜0.05(n＝4)。***表示给药组与空白对照组相比差异极为显著，p＜0.001(n＝4)。
图5是100倍镜下观察的HaCaT细胞划痕实验结果图。
图6是肽(2)及肽(6)对光损伤HaCaT细胞的修复作用图。＃＃表示与非辐射的正常对照组相比，差异显著，p＜0.01(n＝4)。*表示与辐射后的对照组相比，具有统计学差异，p＜0.05(n＝4)。**表示与辐射后的对照组相比，差异显著，p＜0.01(n＝4)。
图7是肽(2)及肽(6)对HaCaT细胞黏附的影响图。*表示给药组与空白对照组相比具有统计学差异，p＜0.05(n＝4)。***表示给药组与空白对照组相比差异极为显著，p＜0.001(n＝4)。
图8是肽(2)及肽(6)对胶原晶格收缩的影响图。A：24h胶原面积收缩趋势图；B：24h胶原面积收缩差值统计图。*表示给药组与空白对照组相比具有统计学差异，p＜0.05。**表示给药组与空白对照组相比差异显著，p＜0.01。
图9是肽(2)及肽(6)促进胶原晶格收缩的形态图。
图10是经皮水分散失测试结果图。
图11是皮肤弹性测试结果图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例及附图对发明作详细的说明，然而，应当理解的是，这些实施例及附图仅用作说明目的，并且不旨在限制本发明的范围。
实施例I细胞增殖实验
1.1试剂与材料
胎牛血清(Gibco)、DMEM培养基(Gibco)、青霉素、链霉素、MTT(Sigma)。
1.2仪器
酶标仪(美国MD)、CO2培养箱(上海一恒)、超净工作台(苏州净化)。
1.3细胞株
人角质形成细胞(HaCaT)购买自中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库，小鼠皮肤成纤维细胞(NIH3T3)购买自中国科学院典型培养物保藏委员会上海细胞库。
1.4待测样品
给药组：12.5ppm肽(2)H-(β-Ala)-Hyp-Dab-NH-苄基、25ppm肽(2)H-(β-Ala)-Hyp-Dab-NH-苄基、50ppm肽(2)H-(β-Ala)-Hyp-Dab-NH-苄基、100ppm肽(2)H-(β-Ala)-Hyp-Dab-NH-苄基；12.5ppm的肽(6)H-(β-Ala)-Pro-Dab-NH-苄基、25ppm的肽(6)H-(β-Ala)-Pro-Dab-NH-苄基、50ppm的肽(6)H-(β-Ala)-Pro-Dab-NH-苄基、100ppm的肽(6)H-β-Ala)-Pro-Dab-NH-苄基。
100ppm肽(1)H-Ala-Hyp-Arg-Arg-NH-苄基；100ppm肽(3)H-Dap-Hyp-Dab-NH-苄基；100ppm肽(4)H-Ala-Hyp-Arg-NH-(CH2)2-苯基；100ppm肽(5)H-Ala-Pro-Arg-Arg-NH-苄基；100ppm肽(7)H-Dap-Pro-Dab-NH-苄基；100ppm肽(8)H-Ala-Pro-Arg-NH-(CH2)2-苯基。
对照组：PBS空白对照。
1.5实验目的
本实验的目的是通过以NIH3T3成纤维细胞和HaCaT角质形成细胞作为实验对象，评价给药后72h的细胞活性，确定本发明的肽衍生物对细胞增殖的影响。
1.6实验方法
取冻存的NIH3T3和HaCaT细胞培养，按照1∶2传代至5代左右，选择长势较好的细胞作为实验对象。
将细胞2000个/孔接种在96孔板中，待细胞贴壁后，按照倍比稀释法，分别加入给药组和对照组样品，补充培养基至200μL，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育72h。
之后每孔加入22μL 5mg/ml MTT，继续于37℃、5％CO2培养箱中孵育4h。弃去原溶液，加入150μL/孔的DMSO。5min后使用酶标仪读取490nm和630nm波长下的参比OD值。
1.7结果
MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法，测得的OD值与细胞活性成正比。
图1为肽(2)和肽(6)作用于NIH3T3细胞的检测结果，结果显示，与正常对照组相比，各剂量的肽(2)和肽(6)均能增加NIH3T3细胞活性，且呈剂量依赖性。
图2为肽(2)和肽(6)作用于HaCaT细胞的检测结果，结果显示，与正常对照组相比，各剂量的肽(2)和肽(6)均能增加HaCaT细胞活性，且呈剂量依赖性。
图3为100ppm肽(1)～肽(6)作用于NIH3T3细胞的检测结果，结果显示，在100ppm的浓度下，肽(1)～肽(6)对于NIH3T3细胞均没有毒性作用，而且还能增加其细胞活性。
图4为100ppm肽(1)～肽(6)作用于HaCaT细胞的检测结果，结果显示，在100ppm的浓度下，肽(1)～肽(6)对于HaCaT细胞均没有毒性作用，而且还能增加其细胞活性。
综上所述，本发明所述的肽衍生物可以增加NIH3T3成纤维细胞和HaCaT角质形成细胞的活性，促进其增殖，表明本发明的肽衍生物具有皮肤修复作用。
实施例2划痕实验
2.1试剂与材料
胎牛血清(Gibco)、DMEM培养基(Gibco)、青霉素、链霉素。
2.2仪器
光学显微镜、CO2培养箱。
2.3细胞株
人角质形成细胞(HaCaT)购买自中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库。
2.4待测样品
给药组：100ppm肽(2)H-(β-Ala)-Hyp-Dab-NH-苄基、100ppm的肽(6)H-(β-Ala)-Pro-Dab-NH-苄基、50U/mL的EGF。
对照组：PBS空白对照。
2.5实验目的
本实验的目的是通过在长满培养皿的HaCaT细胞基础上进行划痕实验，于给药后24h在光学显微镜下观察细胞的迁移情况，以确定本发明的肽能否促进细胞增殖和迁移。
2.6实验方法
取冻存的HaCaT人角质层细胞培养，按照1∶2传代至5代左右，选择长势较好的细胞作为实验对象。将细胞以20万个/孔的密度接种于12孔板，每孔2mL细胞悬浮液，待细胞贴壁长满后，换含0.5％～1％胎牛血清的培养基维持细胞24h使其同步化。用灭菌移液枪头进行划痕，PBS洗去掉落细胞，加入待测样品，继续于37℃、5％CO2培养箱中孵育，24h后置于光学显微镜下分析伤口愈合区域。
2.7结果
细胞的划痕迁移实验能反应细胞的增殖修复能力，结果如图5所示，正常对照组的细胞划痕仍旧明显，划痕间距正常；与对照组相比，EGF阳性组的细胞增殖迁移明显，间距基本消失，连成一片；而肽(2)、肽(6)的划痕间距均较正常对照组细胞划痕间距缩短，并出现细胞迁移轨迹，由此可知，本发明的肽衍生物能够促进HaCaT角质层细胞增殖和迁移，具有皮肤修复作用。
实施例3光损伤修复实验
3.1试剂与材料
胎牛血清(Gibco)、DMEM培养基(Gibco)、青霉素、链霉素、MTT(Sigma)。
3.2仪器
酶标仪(美国MD)、CO2培养箱(上海一恒)、超净工作台(苏州净化)。
3.3细胞株
人角质形成细胞(HaCaT)购买自中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库。
3.4待测样品
12.5ppm肽(2)H-(β-Ala)-Hyp-Dab-NH-苄基、25ppm肽(2)H-(β-Ala)-Hyp-Dab-NH-苄基、50ppm肽(2)H-(β-Ala)-Hyp-Dab-NH-苄基、100ppm肽(2)H-(β-Ala)-Hyp-Dab-NH-苄基；12.5ppm的肽(6)H-(β-Ala)-Pro-Dab-NH-苄基、25ppm的肽(6)H-(β-Ala)-Pro-Dab-NH-苄基、50ppm的肽(6)H-(β-Ala)-Pro-Dab-NH-苄基、100ppm的肽(6)H-(β-Ala)-Pro-Dab-NH-苄基。上述样品均用PBS溶解。
3.5实验目的
本实验的目的是通过建立UVB光损伤细胞模型，紫外光辐射后给药24h，使用MTT法检测细胞增殖活性来确定本发明的肽对光损伤细胞的修复能力。
3.6实验方法
取冻存的HaCaT细胞培养，按照1∶2传代至5代左右，选择长势较好的细胞作为实验对象。
将细胞以1万个/孔接种到96孔板中，待细胞长满至约80％时，建立UVB光损伤模型。加入50μL培养基，不进行UVB照射，以此作为空白对照组；实验组加入适量PBS反复洗至无色后，加入50μL PBS，以80J/cm3UVB灯下照射，灯源和培养瓶间距15cm，实验组经照射后，弃去PBS，加入培养液和倍比稀释药物至200μL，继续于37℃、5％CO2培养箱中孵育24h。
24h后，每孔加入22μL 5mg/mL的MTT，置于培养箱孵育4h后，弃去原溶液，加入150μL/孔的DMSO。5min后使用酶标仪读取490nm和630nm波长下的参比OD值。
3.7结果
细胞光损伤修复结果见图6。结果显示，与非辐射的正常对照组相比，UVB辐射后细胞活性明显降低，提示光损伤模型建模成功。给药后，各剂量的肽(2)和肽(6)均能明显提高光损伤HaCaT细胞的活性。由此表明，本发明的肽衍生物能够修复光损伤的细胞，提高其活性，具有良好的皮肤修复能力。
实施例4促细胞黏附作用测试
4.1试剂与材料
胎牛血清(Gibco)、DMEM培养基(Gibco)、青霉素、链霉素、MTT(Sigma)。
4.2仪器
酶标仪(美国MD)、CO2培养箱(上海一恒)、超净工作台(苏州净化)。
4.3细胞株
人角质形成细胞(HaCaT)购买自中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库。
4.4待测样品
给药组：12.5ppm肽(2)H-(β-Ala)-Hyp-Dab-NH-苄基、25ppm肽(2)H-(β-Ala)-Hyp-Dab-NH-苄基、50ppm肽(2)H-(β-Ala)-Hyp-Dab-NH-苄基、100ppm肽(2)H-(β-Ala)-Hyp-Dab-NH-苄基；12.5ppm的肽(6)H-(β-Ala)-Pro-Dab-NH-苄基、25ppm的肽(6)H-(β-Ala)-Pro-Dab-NH-苄基、50ppm的肽(6)H-(β-Ala)-Pro-Dab-NH-苄基、100ppm的肽(6)H-(β-Ala)-Pro-Dab-NH-苄基。上述样品均用PBS溶解。
对照组：PBS空白对照。
4.5实验目的
本实验的目的是通过选择HaCaT角质层细胞，铺板在药物包被好的96孔板中，孵育且经一段外力作用后，评价药物对细胞黏附的影响，以此确定本发明的肽能否改善细胞弹性。
4.6实验方法
取冻存的HaCaT人角质层细胞培养，按照1∶2传代至5代左右，选择长势较好的细胞作为实验对象。
将待测样品按照20μL/孔加入至96孔板中，37℃恒温烘箱干燥过夜。于第二天将长势较好的HaCaT细胞消化后，以HaCaT细胞1万/孔密度种板，并将培养基补至200μL，于37℃、5％CO2培养箱中孵育3h。培养结束后，将培养板取出并继续补充培养基至液面刚好溢出，用封口膜封闭，以保证没有气泡。顺时针翻转20min。弃去原有培养基，每孔加入90μL新鲜培养基和10μL 5mg/mL的MTT，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育3h。弃去溶液，加入150μL的DMSO。使用酶标仪读取490nm和630nm波长下的参比OD值。
4.7结果
在经过三维力作用之后，黏附性强的细胞能保持在96孔板上，通过对板上活细胞进行MTT定量分析，即可反映细胞的黏附作用。保持在96孔板上的活细胞越多，测得的OD值越大，表明细胞的黏附作用越强。
实验结果如图7所示，与正常对照组相比，肽(2)和肽(6)均能够提高HaCaT细胞的黏附能力，从而有利于提高其弹性。
实施例5胶原晶格测试实验
5.1试剂与材料
胎牛血清(Gibco)、DMEM培养基(Gibco)、青霉素、链霉素。
5.2仪器
CO2培养箱(上海一恒)。
5.3细胞株
小鼠皮肤成纤维细胞(NIH3T3)购买自中国科学院典型培养物保藏委员会上海细胞库。
5.4待测样品
100ppm的肽(2)H-(β-Ala)-Hyp-Dab-NH-苄基、100ppm的肽(6)H-(β-Ala)-Pro-Dab-NH-苄基、50U/mL的EGF。
5.5实验目的
本实验的目的是采用胶原晶格实验测试药物对细胞致密度的影响，以评价其紧致皮肤的能力。
5.6实验方法
取冻存的NIH3T细胞，按照1∶2传代至5代左右，选择长势较好的细胞作为实验对象。
提前12h包被好以下药物：100ppm的肽(2)、100ppm的肽(6)以及50U/mL的EGF。以没有包被药物的组别作为空白对照组。
配制1.76×晶格培养基：将0.38g NaHCO3溶解于10mL超纯水中，加入17.6mL 10×DMEM至100mL。将15mL无菌塑料管放在冰上，加入预冷试剂，严格遵守以下顺序加样：①0.92mL的1.76*晶格培养基，②0.2mL 3％胶原原液，③0.04mL0.1M NaOH，④0.19mL胎牛血清，⑤0.67mL细胞悬液(约10000个细胞)。完成加样后，上下颠倒混匀，避免产生气泡。将混匀后的培养基溶液转移至12孔板培养皿中，置于37℃、5％CO2培养箱培育24h。选取不同时间点拍照记录。
5.7结果
胶原晶格聚集实际上是细胞质基质之间作用力的结果，胶原晶格实验的晶格收缩率与细胞密度成正比。本实验通过半定量法测定胶原聚集的面积以此反应胶原的收缩程度。
结果如图8、9所示。结果显示，经过本发明的肽(2)、肽(6)及EGF作用后，胶原晶格的面积显著降低，由此表明，本发明的肽衍生物能够增加NIH3T3成纤维细胞的致密度，具有紧致皮肤的作用。
实施例6含肽(2)的脂质体的制备
Figure BDA0004047592860000141
将二棕榈酰基磷脂酰胆碱称重且溶于氯仿。于真空下蒸发溶剂，直至得到磷脂薄层，将此层于55℃以所需浓度的肽水溶液处理而水化，得到多室脂质体。将多室脂质体通过高压均质处理，得到尺寸更加小而均一的单室脂质体。
实施例7含肽(6)的微米乳液组合物的制备
Figure BDA0004047592860000142
按照处方用量，称取B相的成分加于容器中。接着，将D相添加至B相且于连续搅拌下均质化。随后将A相添加至混合物。最后，添加C相，得到含肽(6)的微米乳液组合物。
实施例8含肽(2)的精华液的制备
Figure BDA0004047592860000143
Figure BDA0004047592860000151
将处方量的透明质酸钠加入水中，搅拌使混合均匀，然后加热到80～85℃，保温搅拌使其分散均匀。温度降到40℃以下，加入甘油、芦荟胶、肽(2)、维生素C、辛甘醇和1，2-己二醇，搅拌均匀。用15％三乙醇胺调溶液的pH值至5.5左右，即得。
实施例9修复皮肤屏障和增加皮肤弹性的功能测试
9.1受试者
60名30-50岁的受试者，随机分为2组，平均每组30人。
9.2样品与分组
选择实施例8作为给药组，同时设置安慰剂组。
9.3测试仪器
经皮水分散失测试仪Tewameter TM300和皮肤弹性测试仪Cutometer dualMPA580。
9.4目的
皮肤屏障功能完好，则皮肤水分经皮散失就少，测得的经皮水分散失数值就小。通过测试受试者在使用样品前后的经皮水分散失数值和皮肤弹性数值，以评价本发明的肽衍生物的皮肤修复紧致功效。
9.5方法
受试者脸部清洁后，静坐30min，先测量其脸部特定区域的初始经皮水分散失数值和皮肤弹性数值。将样品均匀涂布于试验区域，一天两次，早晚坚持使用，不得使用其他化妆品，连续使用8周，分别测试记录试验区域的经皮水分散失数值和皮肤弹性数值。同一个受试者的测试由同一个测量人员完成。最后统计受试者试验区域每次测得的数值，分析其经皮水分散失数值和皮肤弹性数值的变化规律。
9.6结果
经皮水分散失和皮肤弹性的测试结果分别见图10、11。
图10结果显示，相对于安慰剂组，持续使用本发明的肽(2)8周后，经皮水分散失数值明显降低，说明肽(2)具有显著的修复皮肤屏障的作用。
图11结果显示，持续使用安慰剂8周后，皮肤弹性没有显著变化。相对于安慰剂组，持续使用本发明的肽(2)8周后，皮肤的弹性显著恢复。
由此说明，本发明的肽衍生物持续使用能够促进角质形成细胞增殖，修复皮肤屏障，提高成纤维细胞的活性，促进细胞外基质的分泌，增加胶原蛋白的含量，从而从源头改善肤质，修复皮肤，增加皮肤弹性，提高紧致度，因此具有良好的皮肤修复紧致效果，能够应用于皮肤修复紧致的产品中。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步详细的说明，但是不表示本发明的具体实施是局限于这些说明。对于本发明所属领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或是替换，都应视为属于本发明的保护范围。

Claims (11)

1.通式(I)所示的肽衍生物或其盐在制备用于皮肤修复紧致的组合物中的用途，所述皮肤修复紧致包括提高成纤维细胞的活性、促进角质形成细胞增殖和迁移、修复光损伤中的一种或多种；
Figure FDA0004047592850000011
通式(I)中，
X表示碳键或NH-CH(C＝O)-(CH2)3+n-NH-R5，
n表示0、1或2，
R1、R4和R5彼此独立地表示氢、取代的或未取代的C1-C24烷基、取代的或未取代的C2-C24烯基、脒基或四-C1-C6-烷基脒鎓，
R2表示氧、取代的或未取代的C1-C24烷基，
或者
R1和R4与它们所结合的残基一起表示5-至7-的饱和环，
R3表示C1-C12-烷氧基、C1-C12-烷基氨基、取代的或未取代的芳基-C1-C6-烷基氨基、取代的或未取代的杂芳基-C1-C6-烷基氨基、取代的或未取代的芳基-C1-C6-烷氧基、取代的或未取代的杂芳基-C1-C6-烷氧基，并且
R6表示氧，或者当n是1时，也表示氨基，或者与R1以及R6和R1所结合的残基一起表示5-至7-的饱和环，
R7表示H、F、Cl、Br、I、-OH、-OR8或R9-CO-O-，
R8和R9彼此独立地表示取代的或未取代的C1-C24烷基、取代的或未取代的C2-C24烯基
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，R1表示H。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，R2表示H或甲基。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，R3表示芳基-C1-C6-烷基氨基。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，R7表示H或者-OH。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肽衍生物选自：
(1)H-Ala-Hyp-Arg-Arg-NH-苄基：
(2)H-(β-Ala)-Hyp-Dab-NH-苄基；
(3)H-Dap-Hyp-Dab-NH-苄基；
(4)H-Ala-Hyp-Arg-NH-(CH2)2-苯基；
(5)H-Ala-Pro-Arg-Arg-NH-苄基；
(6)H-(β-Ala)-Pro-Dab-NH-苄基；
(7)H-Dap-Pro-Dab-NH-苄基；
(8)H-Ala-Pro-Arg-NH-(CH2)2-苯基。
7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物包含质量百分浓度为0.0001％-5％的通式(I)所示的肽衍生物或其盐；
可选地，所述组合物包含质量百分浓度为0.0005％-1％的通式(I)所示的肽衍生物或其盐；
可选地，所述组合物包含质量百分浓度为0.001％-0.1％的通式(I)所示的肽衍生物或其盐；
可选地，所述组合物包含质量百分浓度为0.005％-0.01％的通式(I)所示的肽衍生物或其盐。
8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述通式(I)所示的肽衍生物的盐包括通式(I)所示的肽衍生物的金属盐，所述金属包括：锂、钠、钾、钙、镁、锰、铜、锌或铝；
可选地，所述通式(I)所示的肽衍生物的盐包括通式(I)所示的肽衍生物与有机碱形成的盐，所述有机碱包括：乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、组氨酸或哌嗪；
可选地，所述通式(I)所示的肽衍生物的盐包括通式(I)所示的肽衍生物与无机酸或有机酸形成的盐，所述有机酸包括：乙酸、柠檬酸、乳酸、丙二酸、马来酸、酒石酸、延胡索酸、苯甲酸、天冬氨酸、谷氨酸、琥珀酸、油酸、三氟乙酸、草酸、扑酸或葡萄糖酸；
可选地，所述无机酸包括：盐酸、硫酸、硼酸或碳酸。
9.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述通式(I)所示的肽衍生物或其盐，掺入到美容上或药学上可接受的递送系统或缓释系统，或被吸附到美容上或药学上可接受的固体有机聚合物或固体无机支撑体上；
所述美容上或药学上可接受的递送系统或缓释系统选自：脂质体、油质体、非离子型表面活性剂脂质体囊泡、醇质体、毫米胶囊、微米胶囊、纳米胶囊、纳米结构的脂质载体、海绵状物、环糊精、类脂囊泡、胶束、毫米球、微米球、纳米球、脂质球、微米乳液、纳米乳液、毫米粒子、微米粒子以及纳米粒子；可选为脂质体或微米乳液，可选具有反胶束的内部结构的油包水型微米乳液；
所述美容上或药学上可接受的固体有机聚合物或固体无机支撑体选自：滑石、膨润土、二氧化硅、淀粉或麦芽糖糊精。
10.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物是美容组合物或药物组合物，所述组合物的制剂选自：霜剂、油、奶、香膏、泡沫、洗剂、凝胶、擦剂、浆液、皂、洗发精、润发乳、血清、软膏、摩丝、润发油、粉末、杆剂、笔剂、喷雾剂、气溶胶、胶囊剂、片剂、颗粒剂、口香糖、溶液、混悬液、乳剂、糖浆剂、酏剂、多糖薄膜、胶冻或明胶。
11.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物还包含至少一种用于增强本发明所述皮肤修复紧致的作用的其他活性剂，所述其他活性剂选自肽类、天然植物成分、维生素C及其衍生物或类视黄醇类。
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