CN104592348A - 一种含有3,4-脱氢-l-脯氨酸残基的三肽减皱化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种含有3,4-脱氢-L-脯氨酸残基的三肽化合物和/或其与酸形成的盐，所述三肽化合物结构式如下：

Description

一种含有3,4-脱氢-L-脯氨酸残基的三肽减皱化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于药用化妆品技术领域，具体涉及一种含有3,4-脱氢-L-脯氨酸残基的三肽减皱化合物及其制备方法和应用。

背景技术

皱纹的形成主要是由肌肉强烈收缩或肌肉长时间保持在强烈收缩位置所造成。

目前，治疗面部皱纹的主要方法是注射肉毒杆菌毒素A，通过将肉毒杆菌毒素A注入面部肌肉的方式使面部肌肉麻痹。这样，位于眼部或额头的肌肉就不能再活动，从而使得眼部或额头皱纹不易出现。然而，使用皮下注射肉毒杆菌毒素A的治疗必须由专业医生来实施，同时与之相关的高额费用及较高的毒性也限制了肉毒杆菌毒素A的广泛应用。此外，其作用仅能持续3—6个月，之后就必须重复注射治疗。

肉毒杆菌毒素A的作用机制在于其选择性地阻断乙酰胆碱在神经肌肉突触处的释放，由此出现肌肉麻痹；这是通过一种被称为SNAP—25蛋白质的裂解来实现的。

SNAP—25蛋白的N—末端氨基酸序列（Glu—Glu—Met—Gln—Arg—Arg—NH₂）能抑制在突触中Ca⁺⁺依赖性神经递质的释放，并导致肌肉松弛。由此开发的、可局部施用的化合物Ac—Glu—Glu—Met—Gln—Arg—Arg—NH₂（阿基瑞林）比肉毒杆菌毒素A的作用约弱5000倍，从而使其能更好地按剂量给药并且几乎无毒性。然而，它的松弛肌肉作用太弱且极不稳定，甚至于不能达到较满意的减少皱纹的效果。

急需寻找毒性更低，减皱效果更好的化合物以满足市场的需求。中国专利200580039359.9公开了一种结构更为简化的三肽化合物，其中的化合物4.5 和4.6在细胞水平的试验中在2小时和48小时显示了比阿基瑞林更好的减皱效果，然而其在更长时间的减皱实验中却未能显示令人满意的减皱效果，且在人体试验测试中也未能显示更好的临床适用性。因此，还需要寻找减皱效果持续时间更长、具有更好临床适用性的结构简单的减皱化合物，以满足临床需要。

3,4-脱氢-L-脯氨酸和脯氨酸在结构上并没有太大的差别。但是，本发明人在对减皱化合物进行研究时令人惊讶地发现，将某些具有减皱效果的三肽化合物中的脯氨酸替换为3,4-脱氢-L-脯氨酸后，该三肽化合物大大延长了减皱的持续效果，更在临床试验中显示了意想不到的持续减皱效果，进一步满足了临床需要，从而完成了本发明。

发明内容

本发明目的在于提供一种含有3,4-脱氢-L-脯氨酸残基的三肽减皱化合物及其制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种含有3,4-脱氢-L-脯氨酸残基的式（I）所示的三肽化合物或其与酸形成的盐：

                             （I）

该化合物也可以用缩写H—（β-Ala）—（3,4-Dehydro-Pro）—Dab—NH—Bzl表示；其中：

β-Ala为β—丙氨酸残基；

3,4- Dehydro-Pro为L型的3,4-脱氢脯氨酸残基；

Dab为L—2,4二氨基丁酸残基；

Fmoc为9－芴基甲氧基羰基；

Boc为叔丁氧羰基；

Bzl为苄基。

上述三肽化合物可与酸形成单价或多价的、均质或混合的盐。具体的，所述盐可以为盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、三氯乙酸盐、丙酸盐、乙醇酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、丙二酸盐、马来酸盐、草酸盐、邻苯二甲酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、扁桃酸盐、肉桂酸盐、烟酸盐、甲磺酸盐或甲苯磺酸盐。其中优选为盐酸盐或乙酸盐。

本发明化合物可以按照中国专利200580039359.9所述制备方法制备，只是在制备过程中将原料脯氨酸替换为3,4-脱氢-L-脯氨酸。

本发明所述三肽化合物或其与酸形成的盐也可以按照如下方法制备得到：

1）将Fmoc—Dab(Boc)—OH与2-Cl-Trt树脂连接，制得Fmoc—Dab(Boc)—2-Cl-Trt树脂；

2）对步骤1）制得产物的氨基端进行脱保护，脱除保护基；

3）将步骤2）制得产物与Fmoc—L—（3,4-Dehydro-Pro）—OH在缩合剂存在下进行缩合反应，制得Fmoc—（3,4- Dehydro-Pro）—Dab(Boc)—2-Cl-Trt树脂；

4）对步骤3）制得产物的氨基端进行脱保护，脱除保护基；

5）将步骤4）制得产物与Boc—(β-Ala)—OH在缩合剂存在下进行缩合反应，制得Boc—（β-Ala）—（3,4- Dehydro-Pro）—Dab(Boc)—2-Cl-Trt树脂；

6）对步骤5）制得产物进行切割，得到Boc—（β-Ala）—（3,4-Dehydro-Pro）—Dab(Boc)—OH；

7）将步骤6）制得产物与苄胺在缩合剂存在下进行缩合反应，制得Boc—（β-Ala）—（3,4- Dehydro-Pro）—Dab(Boc)—NH—Bzl；

8）对步骤7）制得产物进行脱保护，得到H—（β-Ala）—（3,4-Dehydro-Pro）—Dab—NH—Bzl。

如果需要，可以将所得化合物用如下方法进一步精制纯化：将步骤8）制得的粗品化合物进行柱层析纯化、脱盐，将收集的洗脱液浓缩、冷冻干燥，即得式（I）化合物精品。

如果需要，可以将所得式（I）化合物与相应的酸反应将其转化为相应的盐。

本发明还提供含有式（I）化合物或其酸加成盐的药物组合物或者化妆品组合物。进一步地，可以将所述组合物制备成为软膏剂或凝胶剂或者化妆品面霜或者按摩霜使用，且其中式（I）化合物或其盐的质量百分含量为0.001%—5%。

本发明还提供式（I）所述三肽化合物或其与酸形成的盐在制备用于减皱药物中的应用。

本发明还提供式（I）所示三肽化合物或其与酸形成的盐在制备用于减皱的化妆品中的应用。

本发明化合物或其盐在应用时的施用方式为经皮涂抹施用，因此，可以将本发明化合物制备成经皮给药的任何制剂形式使用。

本发明中，常见英文缩写的含义为：

DIC：二异丙基碳二亚胺

DCC：二环己基碳二亚胺

HOBT：1－羟基苯并三氮唑

NMM：N－甲基吗啉

DMF：N,N－二甲基甲酰胺

DCM：二氯甲烷

Dab：L－2,4－二氨基丁酸残基

Fmoc：9－芴基甲氧基羰基

Boc：叔丁氧羰基

DIPEA：二异丙基乙胺

β-Ala：β－丙氨酸残基

3,4- Dehydro-Pro：3,4-脱氢-L-脯氨酸残基

Bzl：苄基

HCl：氯化氢

TLC：薄层层析

2-Cl-Trt树脂：2－氯三苯甲基氯树脂

HPLC：高压液相色谱

MEM：最低基础培养基

M199：培养基199（TECOmedical AG）。

本发明目的在于提供一种便于研究和应用的可松弛肌肉、局部施用的新型三肽化合物，该化合物能组合成为可持续减轻、减少面部皱纹的活性组合物，该活性组合物的使用能够让人们的容颜变得更美好。同肉毒杆菌毒素A和阿基瑞林的作用机制类似，本发明三肽化合物或其与酸形成的盐的作用机制也是基于抑制乙酰胆碱受体，但其不具有肉毒杆菌毒素A和阿基瑞林的缺点，且持续减皱效果更好。试验证明，本发明三肽化合物和/或其与酸形成的盐能迅速地、且以足够的浓度到达其作用位点（神经肌肉突触），阻断神经肌肉突触，并从而达到肌肉松弛的目的，减皱效果显著，而且减皱效果维持时间长久，可用于减轻、减少皱纹的药物研究和治疗中。相对于现有技术的类似化合物，本发明化合物在松弛肌肉活性方面具有明显更好的作用特征以及更好的蛋白水解稳定性。由于其相对低的分子量和合适的水/正辛醇分配系数logP，可以方便有效的局部经皮施用。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明的保护范围并不局限于此。

实施例1：H—（β-Ala）—（3,4- Dehydro-Pro）—Dab—NH—Bzl及其乙酸盐的制备。

1）Fmoc—Dab(Boc)—2-Cl-Trt树脂的制备。

称取2-Cl-Trt树脂8g（8.8mmol）和Fmoc—Dab(Boc)—OH3.88g（8.8mmol），将其加入到磨口圆底烧瓶中，然后加入DIPEA15.7ml（88mmol）和DCM80ml，摇匀，密封后在摇床上震荡反应18h。用DMF洗涤树脂，然后加入DCM85ml、甲醇10ml和DIPEA5ml混合液封闭20min。封闭结束后分别用DMF（60ml）洗涤树脂四次、DCM（60ml）洗涤树脂两次。抽走溶液。分别用60ml、30ml和30ml甲醇收缩树脂三次。真空抽干。称重9.1g。干燥低温保存。经FMOC吸光法测定，其氨基酸替代量为0.65mmol/每克树脂。

2）H—Dab(Boc)—2-Cl-Trt树脂的制备。

称取干燥的Fmoc—Dab(Boc)—2-Cl-Trt树脂9.1g于固相反应合成柱中。80mlDCM溶胀树脂20min，抽走。用DMF（40ml）洗涤树脂三次。用40ml20%哌啶-DMF混合液脱Fmoc保护基二次。DMF（40ml）洗涤树脂四次、DCM（40ml）洗涤树脂两次。抽走溶剂。

3）Fmoc—(3,4- Dehydro-Pro）—Dab(Boc)—2-Cl-Trt树脂的制备。

称取18 mmol Fmoc—L—(3,4- Dehydro-Pro）—OH、18 mmol HOBT于干燥的50ml广口三角瓶中，加适量DMF溶解。置于冰水浴中冷却。加18 mmol DIC活化5min，避免水汽。将活化过的氨基酸加入步骤2）所得树脂中反应2h。抽走反应液。用适量DMF洗涤树脂2min×3次。

4）H—（3,4- Dehydro-Pro）—Dab(Boc)—2-Cl-Trt树脂的制备。

步骤3）制得的Fmoc—(3,4- Dehydro-Pro）—Dab(Boc)—2-Cl-Trt树脂用40ml20%哌啶-DMF混合液脱Fmoc保护基二次。DMF（40ml）洗涤树脂四次、DCM（40ml）洗涤树脂两次。抽走溶剂。

5）Boc—（β-Ala）—（3,4- Dehydro-Pro）—Dab(Boc)—2-Cl-Trt树脂的制备。

称取18 mmol Boc—(β-Ala)—OH、18 mmol HOBT于干燥的50ml广口三口瓶中，加适量DMF溶解。置于冰水浴中冷却。加18 mmol DIC活化5min，避免水汽。将活化过的氨基酸加入步骤4）所得树脂中反应2h。抽走反应液。用适量DMF洗涤树脂2min×3次。真空干燥至恒重。

6）Boc—（β-Ala）—（3,4- Dehydro-Pro）—Dab(Boc)—OH的制备。

称取步骤5）干燥至恒重的Boc—（β-Ala）—（3,4- Dehydro-Pro）—Dab(Boc)—2-Cl-Trt树脂，加三氟乙醇裂解液（1g/10ml）切割反应45min。反应结束后，用砂芯漏斗过滤分离树脂。将滤液旋干，得到全保护粗肽。置于真空干燥器干燥至恒重。

7）Boc—（β-Ala）—（3,4- Dehydro-Pro）—Dab(Boc)—NH—Bzl的制备。

将步骤6）得到的Boc—（β-Ala）—（3,4- Dehydro-Pro）—Dab(Boc)—OH粗肽6 mmol、6 mmol的HOBT用30ml无水四氢呋喃溶解，冷至0℃，缓慢加入6 mmol的DCC，0℃搅拌5分钟；然后加入6 mmol的苄胺及N—甲基吗啉；0℃搅拌2小时，用N—甲基吗啉维持pH值8—9，室温搅拌12小时，TLC（展开剂，V_氯仿：V_甲醇：V_乙酸=20：1：0.4）显示原料点消失。反应混合液过滤，滤液减压浓缩，残留物用石油醚反复研磨，得到的固体加200ml乙酸乙酯溶解，分别用饱和NaHCO₃水溶液（8ml×3），饱和NaCl水溶液（8ml×1），5%KHSO₄水溶液（8ml×3），饱和NaCl水溶液（3ml×3）洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压旋干得粗品（产率98%）。

8）HCl·H—（β-Ala）—（3,4- Dehydro-Pro）—Dab—NH—Bzl的制备。

将步骤7）得到的Boc—（β-Ala）—（3,4- Dehydro-Pro）—Dab(Boc)—NH—Bzl粗肽，0℃下缓慢加入30ml、4M HCL/乙酸乙酯中，于0℃搅拌1.5小时，反应液出现大量沉淀，TLC（展开剂，V_氯仿：V_甲醇=10：1）显示原料点消失。过滤反应混合液，沉淀用乙酸乙酯（50ml×3）和无水乙醚（50ml×3）反复洗涤至无HCl，得到目标化合物粗品（产率85%）。

9）精制：采用C18反相柱纯化。

粗品预处理：60g HCl·H—（β-Ala）—(3,4- Dehydro-Pro）—Dab—NH—Bzl分成5份，分别用50ml水溶解，过滤。

填料：C18，柱长800mm，内径50mm。

洗脱条件：梯度洗脱，流速2.0ml/min，先用2%乙腈和1%乙酸的水溶液洗脱，硝酸银溶液检测氯离子，接收液无氯后变换为10%乙腈和1%乙酸水溶液洗脱，1小时后再转换为15%乙腈和1%乙酸水溶液洗脱。

收集样品：采用TLC茚三酮显色方法检测样品的流出情况，并根据HPLC检测数据收集主成分，合并洗脱液，冷冻干燥24小时后，再次加入蒸馏水溶解并继续冻干48小时，共得到最终精品为H—（β-Ala）—（3,4-Dehydro-Pro）—Dab—NH—Bzl乙酸盐的白色冻干粉末36.8g（产率68%，纯度99.8%）。

如需得到无盐化合物产品，可用凝胶柱层析或膜过滤等常规技术再次脱盐并冻干，此处不再赘述。

如需得到其它的盐，可将无盐精品化合物与相应的酸用本领域常规方法混合转化为相应的盐。

经测定和计算，H—（β-Ala）—（3,4- Dehydro-Pro）—Dab—NH—Bzl的分子量为：373.47。

实施例2 体外模型测试。

1）材料。

第三次传代中的正常人肌细胞（成肌细胞）

具有“背根神经节”的13天大的大鼠胚胎的脊髓外植体

培养基：2/3MEM和1/3M199、2mML-谷氨酰胺、50UI/ml青霉素、50μg/ml链霉素、5%胎牛血清

培养条件：37℃，5%CO₂。

2）测试方法。

为了测试本发明化合物的效用，建立了人肌细胞和来自大鼠胚胎的脊髓的神经元的共培养模型。

在用明胶包被的24孔平板中培养正常的人肌细胞（成肌细胞）直到形成单层的肌原纤维（来自融合的肌细胞）。然后，将具有背根神经节的13天大的大鼠胚胎的脊髓外植体置于所述肌细胞单层上。共培养1天后，可见从外植体生长出第一个神经突与肌细胞接触。5天后发生第一次收缩。共培养3周后，形成了具有完全成熟的神经肌肉接头的、充分分化的横纹肌纤维模型（神经和肌肉的连接）。在这一培育成熟阶段，肌原纤维会进行规律性收缩，此时就可将该模型用于测试。

在加入待测化合物前，先使用连接至录像机的倒置显微镜观察未加待测化合物时肌纤维收缩次数30秒，然后加入不同浓度的待测化合物，在加入待测化合物后的1min和2h，分别对收缩次数进行计数30秒。在加入待测化合物后的48h、72h和96h，再次对收缩次数进行计数30秒。

3）结果。

与未加待测化合物培育时的收缩次数（取3次测量的平均数）相比较，加入待测化合物后1min、2h、48h、72h和96h的肌肉收缩次数（各测量30秒）的变化百分数Δ[%] 见下表。由下表可以看出：添加本发明化合物后，肌肉收缩次数显著降低，且维持时间显著延长。

注：对比例1为阿基瑞林，对比例2为中国专利200580039359.9中化合物4.5，

即该专利说明书实施例1化合物β-Ala-Pro-Dab-NH-Bzl。

实施例3组合物的配制。

1）软膏剂的配制

。

配制步骤：将原料A（即编号1至5的化合物）加热到70℃。将原料B（即编号6和7的化合物）加热到75℃。在搅拌条件下将原料B加入到原料A中，冷却至50℃，均化并冷却至30℃。然后，依次加入原料成分C（即编号8和9的化合物）和原料D（即本发明实施例1化合物盐酸盐），搅拌均匀。

2）凝胶剂的配制

。

配制步骤：先将编号2至6的原料依次溶解于去离子水中。然后用NaOH 调节pH至6.0，最后加入实施例1化合物乙酸盐，搅拌均匀。

实施例4 人体减皱测试。

1）问卷调查。

方法：选取30—55岁男、女志愿者各10名，让其使用本发明实施例3配制的软膏剂，每天早、晚各一次，均匀的涂抹于脸部皱纹处，连续使用48天，然后询问志愿者对脸部皱纹变化情况的感受。

调查结果：男志愿者组中有6名志愿者使用后感到脸部皱纹有极明显的减轻、减少；有4名志愿者使用后感到脸部皱纹有较明显的减轻、减少；在女志愿者组中有8名志愿者使用后感到脸部皱纹有极明显的减轻、减少；有2名志愿者使用后感到脸部皱纹有较明显的减轻、减少。

2）效果测试。

方法：选取30—55岁女性志愿者各10名（共20名）组成对照组和本发明实验组，分别对其脸部鱼尾纹皱纹、眉间皱纹、鼻唇皱纹的皱纹面积、皱纹长度、皱纹数量进行调查统计并拍照记录；其中实验组使用本发明实施例3配制的凝胶剂，对照组使用中国专利200580039359.9实施例1制备的化合物4.5按照本发明实施例3配方配制的凝胶剂，每天早、晚各一次，均匀的涂抹于脸部皱纹处，连续使用48天，然后对其使用凝胶剂48天后的脸部皱纹状况进行调查统计并与使用凝胶剂前的脸部皱纹状况进行对比，得出两组各10名（共20名）志愿者脸部皱纹变化状况的平均值。

实验组减皱效果见下表。

而相应的对照组减皱效果如下：

以上数据显示：本发明化合物具有显著的持续减皱效果。

Claims (12)

1.式（I）化合物或其与酸形成的盐：

（I）                        。

2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述盐为式（I）化合物的盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、三氯乙酸盐、丙酸盐、乙醇酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、丙二酸盐、马来酸盐、草酸盐、邻苯二甲酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、扁桃酸盐、肉桂酸盐、烟酸盐、甲磺酸盐或甲苯磺酸盐。

3.根据权利要求1所述的化合物，其为式（I）化合物的盐酸盐或乙酸盐。

4.权利要求1所述化合物的制备方法，该方法包括如下步骤：

1）将Fmoc—Dab(Boc)—OH与2-Cl-Trt树脂连接，制得Fmoc—Dab(Boc)—2-Cl-Trt树脂；

2）对步骤1）制得产物的氨基端进行脱保护，脱除保护基；

3）将步骤2）制得产物与Fmoc—L—（3,4-Dehydro-Pro）—OH在缩合剂存在下进行缩合反应，制得Fmoc—（3,4-Dehydro-Pro）—Dab(Boc)—2-Cl-Trt树脂；

4）对步骤3）制得产物的氨基端进行脱保护，脱除保护基；

5）将步骤4）制得产物与Boc—（β-Ala）—OH在缩合剂存在下进行缩合反应，制得Boc—（β-Ala）—（3,4- Dehydro-Pro）—Dab(Boc)—2-Cl-Trt树脂；

6）对步骤5）制得产物进行切割，得到Boc—（β-Ala）—（3,4-Dehydro-Pro）—Dab(Boc)—OH；

7）将步骤6）制得产物与苄胺在缩合剂存在下进行缩合反应，制得Boc—（β-Ala）—（3,4- Dehydro-Pro）—Dab(Boc)—NH—Bzl；

8）对步骤7）制得产物进行脱保护，得到H—（β-Ala）—（3,4-Dehydro-Pro）—Dab—NH—Bzl；

如果需要，将所得产品与酸反应得到式（I）化合物的盐；

其中β-Ala为β—丙氨酸残基；

3,4- Dehydro-Pro为L型的3,4-脱氢脯氨酸残基；

Dab为L—2,4二氨基丁酸残基；

Fmoc为9－芴基甲氧基羰基；

Boc为叔丁氧羰基；

Bzl为苄基。

5.根据权利要求4所述的式（I）化合物制备方法，该方法还包括如下精制步骤：

将根据权利要求4所述方法制备得到的式（I）化合物进行柱层析纯化、脱盐，将收集的洗脱液浓缩、冷冻干燥。

6.含有权利要求1－3中任意一项所述化合物的药物组合物。

7.根据权利要求6的药物组合物，其特征在于，所述组合物为软膏剂或凝胶剂，且其中式（I）化合物或其盐的质量百分含量为0.001%—5%。

8.含有权利要求1－3中任意一项所述化合物的化妆品组合物。

9.根据权利要求8的化妆品组合物，其特征在于，所述组合物为软膏剂、凝胶剂、面霜或者按摩霜，且其中式（I）化合物或其盐的质量百分含量为0.001%—5%。

10.权利要求1－3中任意一项所述化合物或其与酸形成的盐在制备用于减皱药物中的应用。

11.权利要求1－3中任意一项所述化合物或其与酸形成的盐在制备用于减皱化妆品中的应用。

12.根据权利要求10或11所述的应用，其特征在于施用方式为经皮涂抹施用。