CN103533960B - c-KIT抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特异性结合人c-Kit的胞外结构域的抗体，包含这些抗体的药物组合物，及其在治疗癌症中的用途。

Description

c-KIT抗体及其用途
本发明涉及特异性结合人c-Kit的胞外结构域的抗体，包含这些抗体的药物组合物，及所述抗体在治疗与c-Kit的表达和/或活性相关的疾病或病症(如肿瘤、癌症和/或细胞增殖性病症)中的用途。
c-Kit是受体酪氨酸激酶，也被称为例如干细胞因子(SCF)受体或CD-117。c-Kit及其配体——SCF，介导多种生物学功能，包括造血、黑素原生成、红细胞生成、精子发生、肿瘤发生、纤维化、炎症、肥大细胞分化和增殖，和免疫过程。
GLEEVEC(甲磺酸伊马替尼(imatinib))和SUTENT(苹果酸舒尼替尼(sunitinib))是批准并上市销售的药物小分子产品，其抑制包括c-Kit在内的多种受体酪氨酸激酶。然而，目前明确的是，这类疗法一般对其获批的适应症具有有限的好处，因为肿瘤细胞经常具有或快速出现由突变介导的药物抗性。
之前已报道过人c-Kit的抗体。然而，已知的c-Kit抗体在用于治疗癌症时不甚理想，因为它们抑制肿瘤细胞的c-Kit内化，刺激c-Kit激动剂活性(例如c-Kit磷酸化)，或缺少其他对于其有效用作治疗性抗癌剂最佳的因素。例如，WO 2007/127317公开了人源化c-Kit抗体及其相关数据，主要涉及抗体对肥大细胞、造血、黑素原生成和精子发生的效应。应注意的是，WO 2007/127317描述的抗体被报道为“在MO7e细胞中强力抑制SCF介导的c-Kit磷酸化和内化”。
因此，本发明提供了特异性靶向人c-Kit的胞外结构域(ECD)的备选单克隆抗体。本发明还提供了特异性靶向人c-Kit的ECD的单克隆抗体，所述抗体在肿瘤细胞中能够诱导细胞膜结合的c-Kit内化和/或降解，而不诱导c-Kit激动剂活性(例如，c-Kit磷酸化)，和/或具有其他对于有效用作治疗性抗癌剂有利的临床因素(例如，改良的溶解度、体外或体内稳定性，或其他药物动力学特性)。预期这类抗体对治疗癌症更有效，并有利地延迟或预防产生由突变介导的药物抗性和/或治疗对已知疗法具有抗性的癌症。因此，本文描述的c-Kit抗体满足了本领域的关键需求。
本发明的一个方面涉及抗体，所述抗体特异性结合由如SEQ ID NO：20中的氨基酸序列组成的人c-Kit的胞外结构域，所述抗体包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，其中HCVR包含CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列，并且LCVR包含CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其中CDRH1是SYWIG(SEQ ID NO：1)，CDRH2是IIYPGDSDTRYSPSFQG(SEQ ID NO：2)，CDRH3是HGRGYNGYEGAFDI(SEQ ID NO：3)，CDRL1是RASQGISSALA(SEQID NO：4)，CDRL2是DASSLES(SEQ ID NO：5)，并且CDRL3是CQQFNSYPLT(SEQ ID NO：6)。
本发明的另一个方面涉及药物组合物，所述药物组合物包含抗体，和至少一种可药用的载体、稀释剂或赋形剂，所述抗体特异性结合由如SEQID NO：20中的氨基酸序列组成的人c-Kit的胞外结构域，所述抗体包含HCVR和LCVR，其中HCVR包含CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列，并且LCVR包含CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其中CDRH1是SYWIG(SEQ ID NO：1)，CDRH2是IIYPGDSDTRYSPSFQG(SEQ ID NO：2)，CDRH3是HGRGYNGYEGAFDI(SEQ ID NO：3)，CDRL1是RASQGISSALA(SEQ ID NO：4)，CDRL2是DASSLES(SEQID NO：5)，并且CDRL3是CQQFNSYPLT(SEQ ID NO：6)。
在一个方面，本发明提供了抗体，所述抗体特异性结合由如SEQ IDNO：20中的氨基酸序列组成的人c-Kit的胞外结构域，所述抗体包含HCVR和LCVR，其中HCVR包含CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列，并且LCVR包含CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其中CDRH1是SYWIG(SEQ ID NO：1)，CDRH2是IIYPGDSDTRYSPSFQG(SEQ ID NO：2)，CDRH3是HGRGYNGYEGAFDI(SEQ ID NO：3)，CDRL1是RASQGISSALA(SEQ ID NO：4)，CDRL2是DASSLES(SEQID NO：5)，并且CDRL3是CQQFNSYPLT(SEQ ID NO：6)，所述抗体用于疗法。
本发明的另一个方面提供了抗体，所述抗体特异性结合由如SEQ IDNO：20中的氨基酸序列组成的人c-Kit的胞外结构域，所述抗体包含HCVR和LCVR，其中HCVR包含CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列，并且LCVR包含CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其中CDRH1是SYWIG(SEQ ID NO：1)，CDRH2是IIYPGDSDTRYSPSFQG(SEQ ID NO：2)，CDRH3是HGRGYNGYEGAFDI(SEQ ID NO：3)，CDRL1是RASQGISSALA(SEQ ID NO：4)，CDRL2是DASSLES(SEQID NO：5)，并且CDRL3是CQQFNSYPLT(SEQ ID NO：6)，所述抗体用于治疗癌症。
本发明的另一个方面提供了抗体用于生产用于治疗癌症、肿瘤和/或细胞增殖性病症的药物的用途，所述抗体特异性结合由如SEQ ID NO：20中的氨基酸序列组成的人c-Kit的胞外结构域，所述抗体包含HCVR和LCVR，其中HCVR包含CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列，并且LCVR包含CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其中CDRH1是SYWIG(SEQ ID NO：1)，CDRH2是IIYPGDSDTRYSPSFQG(SEQID NO：2)，CDRH3是HGRGYNGYEGAFDI(SEQ ID NO：3)，CDRL1是RASQGISSALA(SEQ ID NO：4)，CDRL2是DASSLES(SEQ ID NO：5)，并且CDRL3是CQQFNSYPLT(SEQ ID NO：6)。
本发明的另一个方面提供了治疗有需要的人的癌症的方法，所述方法包括向所述人施用治疗有效量的抗体，所述抗体特异性结合由如SEQ IDNO：20中的氨基酸序列组成的人c-Kit的胞外结构域，所述抗体包含HCVR和LCVR，其中HCVR包含CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列，并且LCVR包含CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其中CDRH1是SYWIG(SEQ ID NO：1)，CDRH2是IIYPGDSDTRYSPSFQG(SEQ ID NO：2)，CDRH3是HGRGYNGYEGAFDI(SEQ ID NO：3)，CDRL1是RASQGISSALA(SEQ ID NO：4)，CDRL2是DASSLES(SEQID NO：5)，并且CDRL3是CQQFNSYPLT(SEQ ID NO：6)。
在一个方面，本发明提供了治疗有需要的人的癌症的方法，所述方法包括向所述人施用治疗有效量的抗体，与治疗有效量的至少一种其他治疗剂的组合，所述抗体特异性结合由如SEQ ID NO：20中的氨基酸序列组成的人c-Kit的胞外结构域，所述抗体包含HCVR和LCVR，其中HCVR包含CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列，并且LCVR包含CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其中CDRH1是SYWIG(SEQ ID NO：1)，CDRH2是IIYPGDSDTRYSPSFQG(SEQ ID NO：2)，CDRH3是HGRGYNGYEGAFDI(SEQ ID NO：3)，CDRL1是RASQGISSALA(SEQID NO：4)，CDRL2是DASSLES(SEQ ID NO：5)并且CDRL3是CQQFNSYPLT(SEQ ID NO：6)。在优选的实施方案中，其他治疗剂是抗癌剂。
本发明的另一个方面提供了编码本发明的c-Kit抗体的分离的核酸分子，包含所述核酸分子的表达载体，和包含所述核酸分子的宿主细胞。
附图简介
图1描述了在用抗c-Kit mAb，CK6体外处理细胞之前和之后，在人肿瘤细胞系，Mo7e和GIST882的总细胞裂解液中检测到的总c-Kit的western印迹。抗c-Kit mAb CK6以时间依赖性的方式显著诱导由人肿瘤细胞表达的c-Kit的降解。
图2描述了在用或不用c-Kit mAb，CK6的条件下，在人肿瘤细胞系，GIST882的总细胞裂解液中检测到的总c-Kit的western印迹。没有观察到抗c-Kit mAb CK6以时间依赖性的方式显著诱导由GIST882人肿瘤细胞表达的c-Kit的降解。
图3描述了在用或不用c-Kit mAb，CK6的条件下，在人肿瘤细胞系，Mo7e的总细胞裂解液中检测到的总c-Kit的western印迹。没有观察到抗c-Kit mAb CK6以时间依赖性的方式显著诱导由Mo7e人肿瘤细胞表达的c-Kit的降解。
图4描述了在用或不用c-Kit mAb，CK6的条件下，在人肿瘤细胞系，Malm-3M的总细胞裂解液中检测到的总c-Kit的western印迹。没有观察到抗c-Kit mAb CK6以时间依赖性的方式显著诱导由Malm-3M人肿瘤细胞表达的c-Kit的降解。
发明详述
本发明提供了特异性结合人c-Kit的ECD的抗体，所述抗体可用于例如治疗与c-Kit表达和/或活性相关的疾病或病症，如肿瘤、癌症和/或细胞增殖性病症。
除非另外指出，否则术语“抗体”在本文中用于指单克隆抗体。“单克隆抗体”及其缩写“mAb”意在指源自单个拷贝或克隆的抗体，包括例如任何真核、原核或噬菌体的克隆，而不限它的生产方法。作为本文使用的术语，抗体可以是完整的抗体(包含完全或全长Fc区)，或包含抗原结合部分的其部分或片段，例如，结合由如SEQ ID NO：20中的氨基酸序列组成的人c-Kit的ECD的Fab片段、Fab’片段或F(ab，)2片段。例如，本发明涵盖的、能够结合c-Kit的ECD的抗体片段包括但不限于二价片段，如具有完整的链间二硫键的(Fab′)2；单价片段，如，指由LCVR-CL和HCVR-CH1结构域组成的抗体的片段且不保留重链铰链区(例如，通过木瓜蛋白酶消化)的Fab(抗原结合片段)，保留了重链铰链区的Fab，Facb(例如，血纤维蛋白溶酶消化)，F(ab′)2，缺少二硫键的Fab′，pFc′(例如，通过胃蛋白酶或血纤维蛋白溶酶消化)，Fd(例如，通过胃蛋白酶消化、部分还原和重凝聚)和Fv或scFv(例如，通过分子生物学技术；参见Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编著，Springer-Verlag，New York，第269-315页，1994)。抗体片段还意在包括，例如特异性结合由如SEQ ID NO：20中的氨基酸序列组成的人c-Kit的ECD的结构域删除的抗体、线性抗体、单链抗体、单结构域抗体、多价单链抗体、由抗体片段形成的多特异性抗体，包括二价体、三价体等。应理解，除非另外指出，否则不论是否指明抗原结合片段或部分，用于本文中的术语“抗体”都包括了这类片段或部分及其单链形式。
轻链可以包含一个可变结构域(在本文中缩写为LCVR)和/或一个恒定结构域(在本文中缩写为CL)。人抗体(免疫球蛋白)的轻链是kappa(K)轻链或lambda(λ)轻链。本文中使用的表达方式LCVR意在包括来自kappa型轻链(VK)或来自lambda型轻链(Vλ)的可变区。取决于抗体类型或同种型，重链还可包含一个可变结构域(在本文中缩写为HCVR)和/或3或4个恒定结构域(CH1、CH2、CH3和CH4；在本文中统一缩写为CH)。人IgG1是本发明抗体的优选同种型。
在每个LCVR和HCVR中都发现了被称为超变区或互补决定区(CDR)的3个区域，所述区域被称为框架区(在本文中缩写为FR)的变化较少的区域支持。根据Kabat规则(Kabat等人，Ann.NY Acad.Sci.190：382-93(1971)；Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIHPublication No.91-3242(1991))对特别CDR区或结构域的氨基酸命名。每个HCVR和LCVR都包括3个CDR和4个FR，按下列顺序从氨基端至羧基端排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。由LCVR和HCVR结构域组成的抗体部分被命名为Fv(可变片段)，并且构成了抗原结合位点。单链Fv(scFv)是在一条多肽链上含有LCVR结构域和HCVR结构域的抗体片段，其中一个结构域的N端和其他结构域的C端被灵活的接头连接。
用于本文中的术语“人抗体”包括具有与人种系免疫球蛋白序列(如Kabat等人中所述，见上文)对应的可变区和恒定区的抗体。
抗体特异性指抗体对抗原的特定表位的选择性识别。可以基于亲和力和/或亲合力确定本发明的抗体对c-Kit的特异性。亲和力由抗原与抗体的解离的平衡常数(KD)表示，测量了抗原决定簇和抗体结合位点之间的结合强度。可以使用表面等离子体共振(SPR)生物传感器(如the BIAcore3000)测量本文公开的抗体的结合动力学和亲和力。BIAcore系统利用了SPR的光学特性，检测葡聚糖生物传感器基质中的相互作用的分子的蛋白质浓度改变。基本如下文实施例4所述，可以通过SPR生物传感器确定抗c-Kit单克隆抗体的结合动力学(包括KD值)。
除非另外指出，否则当涉及c-Kit抗体对c-Kit的ECD的亲和力时，本文中使用的词组“特异性结合”意在表示通过本领域已知的常规方法确定，小于约2x10-10M，优选在约2x10-10M至约2x10-12M之间的KD，包括使用基本如本文所述的SPR生物传感器。
本发明的一个方面涉及抗体，所述抗体特异性结合由如SEQ ID NO：20中的氨基酸序列组成的人c-Kit的ECD，所述抗体包含HCVR和LCVR，其中HCVR包含CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列，并且LCVR包含CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其中CDRH1是SYWIG(SEQID NO：1)，CDRH2是IIYPGDSDTRYSPSFQG(SEQ ID NO：2)，CDRH3是HGRGYNGYEGAFDI(SEQ ID NO：3)，CDRL1是RASQGISSALA(SEQ ID NO：4)，CDRL2是DASSLES(SEQ ID NO：5)并且CDRL3是CQQFNSYPLT(SEQ ID NO：6)。在一些实施方案中，本发明的抗体包含LCVR，其中LCVR氨基酸序列是
AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO：13)，
和HCVR，其中HCVR氨基酸序列是
QVQLVQSGAAVKKPGESLKISCKGSGYRFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISAGKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARHGRGYNGYEGAFDIWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO：7)。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含重链和轻链，其中重链氨基酸序列是SEQ ID NO：9，轻链氨基酸序列是SEQ ID NO：15。
在其他实施方案中，本发明的抗体包含2条重链和2条轻链，其中每条重链氨基酸序列是SEQ ID NO：9，每条轻链氨基酸序列是SEQ ID NO：15。
本发明的另一个方面涉及抗体，所述抗体特异性结合由如SEQ ID NO：20中的氨基酸序列组成的人c-Kit的ECD，所述抗体包含HCVR和LCVR，其中HCVR包含CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列，LCVR包含CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其中CDRH1是SYWIG(SEQID NO：1)，CDRH2是IIYPGDSDTRYSPSFQG(SEQ ID NO：2)，CDRH3是HGRGYNGYEGAFDI(SEQ ID NO：3)，CDRL1是RASQGISSALA(SEQ ID NO：4)，CDRL2是DASSLES(SEQ ID NO：5)，并且CDRL3是CQQFNSYPLT(SEQ ID NO：6)，且其中抗体具有选自以下的至少一个特性：1)抑制人c-Kit与人SCF结合；2)完全拮抗人c-Kit；3)抑制SCF依赖性的信号传递途径；4)抑制人c-Kit的不依赖SCF的激活；5)诱导人c-Kit内化；6)诱导人c-Kit降解；7)体外抑制肿瘤细胞生长；8)体内抑制肿瘤细胞生长；和9)以小于约2x10-10M的KD与人c-Kit的ECD结合。优选地，这类抗体具有选自1)至9)的至少2个特性。更优选地，这类抗体具有选自1)至9)的至少3个特性。甚至更优选地，这类抗体具有选自1)至9)的至少4个特性。甚至更优选地，这类抗体具有选自1)至9)的至少5个特性。最优选地，这类抗体具有特性1)至9)。
在一些实施方案中，本发明提供了这样的抗体，由SPR在25℃确定的，所述抗体以小于约2x10-10M，优选在约2x10-10M和约2x10-12M之间，更优选在约100pM和约5pM之间，甚至更优选在约100pM和约10pM之间，甚至更优选在约75pM和约25pM之间，甚至更优选在约75pM和约50pM之间，或最优选在约70pM和约60pM之间的KD特异性结合由如SEQ ID NO：20中的氨基酸序列组成的人c-Kit的ECD。
在一些实施方案中，本发明提供了抗体，所述抗体特异性结合由如SEQ ID NO：20中的氨基酸序列组成的人c-Kit的ECD，其中抗体与c-Kit的ECD的结合诱导c-Kit内化。优选地，在基本如下文实施例6所述的c-Kit内化的体外测定中，通过FACS确定，在用约1μg/ml所述抗体在37℃处理肿瘤细胞约1小时后，抗体与c-Kit受体的ECD的结合诱导至少50％的在肿瘤细胞表面表达的c-Kit内化。更优选地，在基本如下文实施例6所述的c-Kit内化的体外测定中，通过FACS确定，在用约1μg/ml所述抗体在37℃处理肿瘤细胞约6小时后，抗体与c-Kit受体的ECD结合诱导至少75％的在肿瘤细胞表面表达的c-Kit内化。
在一些实施方案中，本发明提供了抗体，所述抗体特异性结合由如SEQ ID NO：20中的氨基酸序列组成的人c-Kit的ECD，其中抗体与c-Kit的ECD的结合诱导肿瘤细胞表达的细胞膜结合的c-Kit的降解。优选地，在基本如下文实施例7所述的c-Kit降解的体外测定中确定，在用约100ng/ml所述抗体在37℃处理肿瘤细胞约12小时后，抗体与c-Kit的ECD的结合诱导至少50％的由肿瘤细胞表达的细胞膜结合的c-Kit的降解。更优选地，在基本如下文实施例7所述的c-Kit降解的体外测定中确定，在用约100ng/ml所述抗体在37℃处理肿瘤细胞约24小时后，抗体与c-Kit的ECD的结合诱导至少75％的由肿瘤细胞表达的细胞膜结合的c-Kit的降解。
在一些实施方案中，本发明提供了抗体，所述抗体特异性结合由如SEQ ID NO：20中的氨基酸序列组成的人c-Kit的ECD，其中在基于肿瘤细胞的体外测定中，抗体与c-Kit的ECD的结合抑制SCF诱导的c-Kit和/或MAPK磷酸化。优选地，在基于肿瘤细胞的体外测定中，c-Kit抗体抑制SCF诱导的c-Kit和/或MAPK磷酸化，其IC50小于约1nM，更优选在约1nM和约1pM之间，甚至更优选在约500pM和约5pM之间，甚至更优选在约500pM和约10pM之间，甚至更优选在约500pM和约100pM之间，甚至更优选在约500pM和约250pM之间，或最优选约300pM。
在一些实施方案中，本发明提供了抗体，所述抗体特异性结合由如SEQ ID NO：20中的氨基酸序列组成的人c-Kit的ECD，其中，在基本如下文实施例11所述实施的体内测定中，抗体与c-Kit的ECD的结合抑制肿瘤细胞生长。优选的，在基本如下文实施例11所述实施的体内测定中，抗体与c-Kit的ECD的结合抑制肿瘤细胞生长至少约30％。更优选地，在基本如下文实施例11所述实施的体内测定中，抗体与c-Kit的ECD的结合抑制肿瘤细胞生长至少约50％。甚至更优选地，在基本如下文实施例11所述实施的体内测定中，抗体与c-Kit的ECD的结合抑制白血病、小细胞肺癌、黑色素瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、尤文氏肉瘤、肾癌和/或神经母细胞瘤肿瘤细胞生长至少约30％，或者甚至更优选至少约60％。
在一个方面，本发明提供了治疗与增加的配体依赖性或配体非依赖性c-Kit活性相关的病症的方法，所述方法包括向需要这类治疗的人施用治疗有效量的抗体，所述抗体特异性结合由如SEQ ID NO：20中的氨基酸序列组成的人c-Kit的ECD，所述抗体包含HCVR和LCVR，其中HCVR包含CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列，并且LCVR包含CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其中CDRH1是SYWIG(SEQ ID NO：1)，CDRH2是IIYPGDSDTRYSPSFQG(SEQ ID NO：2)，CDRH3是HGRGYNGYEGAFDI(SEQ ID NO：3)，CDRL1是RASQGISSALA(SEQID NO：4)，CDRL2是DASSLES(SEQ ID NO：5)并且CDRL3是CQQFNSYPLT(SEQ ID NO：6)。在一个实施方案中，所述病症是癌症。
“病症”或“疾病”是可受益于本发明的抗体或方法治疗的任何病况。这包括慢性和急性病症或疾病，所述病症或疾病包括使人易于发生所讨论的病症的那些病理学病况。例如，待用本发明的抗体治疗的病症包括恶性和良性肿瘤；癌、白血病、胚细胞瘤和肉瘤，包括但不限于白血病、小细胞肺癌、黑色素瘤、GIST、尤文氏肉瘤、肾癌和神经母细胞瘤。优选地，待用本发明的抗体治疗的病症包括c-Kit依赖性恶性和良性肿瘤；c-Kit依赖性癌、白血病、胚细胞瘤和肉瘤，包括但不限于c-Kit依赖性白血病、小细胞肺癌、黑色素瘤、GIST、尤文氏肉瘤、肾癌和神经母细胞瘤。
本发明的另一个方面涉及在人中治疗癌症的方法，包括向所述需要这类治疗的所述人施用有效量的本发明的c-Kit抗体，其中癌症选自白血病、小细胞肺癌、黑色素瘤、GIST、尤文氏肉瘤、肾癌和神经母细胞瘤。优选地，癌症是c-Kit依赖性的。
在一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含一种或多种本发明的c-Kit抗体，和至少一种可药用的载体、稀释剂或赋形剂。
在一个方面，本发明提供了本文描述的c-Kit抗体，其用于疗法。
在一个方面，本发明提供了本文描述的任何c-Kit抗体，其用于治疗癌症。
在一个方面，本发明提供了本文描述的任何c-Kit抗体，其用于治疗癌症，其中癌症选自白血病、小细胞肺癌、黑色素瘤、GIST、尤文氏肉瘤、肾癌和神经母细胞瘤。优选地，癌症是c-Kit依赖性的。
在其他方面，本发明提供了本文描述的c-Kit抗体在生产用于治疗癌症、肿瘤和/或细胞增殖性病症的药物中的用途。优选地，癌症是c-Kit依赖性的。
在一个方面，本发明提供了这样的方法，所述方法包括施用治疗有效量的本文描述的c-Kit抗体与有效量的另一种治疗剂(如抗血管发生剂、另一种抗体、化疗剂、细胞毒性剂、免疫抑制剂、细胞因子、细胞毒性放射疗法、皮质类固醇或止吐药)的组合。例如，本文描述的c-Kit抗体可与一种或多种不同的抗癌剂和/或抗血管发生剂组合，用于治疗多种肿瘤性或非肿瘤性病况。在多个实施方案中，本发明的c-Kit抗体可以在开始用一种或多种其他治疗剂(如其他抗癌剂)的治疗之前、过程中、几乎同时或之后施用。优选地，至少一种其他抗癌剂选自伊马替尼、舒尼替尼、阿糖孢苷(cytarabine)(araC)、达卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC)、顺铂和依托泊苷(etoposide)。
本发明的另一个方面涉及编码任何上述c-Kit抗体的分离的核酸分子，包含所述核酸分子的表达载体，和包含所述核酸分子的宿主细胞。本发明还提供了纯化任何上述c-Kit抗体的方法。
本发明的另一个方面涉及抗体，所述抗体特异性结合由如SEQ ID NO：20中的氨基酸序列组成的人c-Kit的ECD，所述抗体包含HCVR和LCVR，其中HCVR包含CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列，并且LCVR包含CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其中CDRH1是SYWIG(SEQ ID NO：1)，CDRH2是IIYPGDSDTRYSPSFQG(SEQID NO：2)，CDRH3是HGRGYNGYEGAFDI(SEQ ID NO：3)，CDRL1是RASQGISSALA(SEQ ID NO：4)，CDRL2是DASSLES(SEQ ID NO：5)并且CDRL3是CQQFNSYPLT(SEQ ID NO：6)，并且其中抗体的结合诱导c-Kit内化和/或诱导c-Kit的降解和/或降低的c-Kit和/或MAPK的磷酸化。
本发明的另一个方面涉及抗体，所述抗体特异性结合由如SEQ ID NO：20中的氨基酸序列组成的人c-Kit的ECD，所述抗体包含HCVR和LCVR，其中HCVR包含CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列，并且LCVR包含CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其中CDRH1是SYWIG(SEQ ID NO：1)，CDRH2是IIYPGDSDTRYSPSFQG(SEQID NO：2)，CDRH3是HGRGYNGYEGAFDI(SEQ ID NO：3)，CDRL1是RASQGISSALA(SEQ ID NO：4)，CDRL2是DASSLES(SEQ ID NO：5)并且CDRL3是CQQFNSYPLT(SEQ ID NO：6)，并且其中抗体的结合抑制肿瘤细胞的体外生长和/或降低肿瘤细胞的体内生长。
本发明的另一个方面涉及抗体，所述抗体特异性结合由如SEQ ID NO：20中的氨基酸序列组成的人c-Kit的ECD，所述抗体包含HCVR和LCVR，其中HCVR包含CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列，LCVR包含CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其中CDRH1是SYWIG(SEQ ID NO：1)，CDRH2是IIYPGDSDTRYSPSFQG(SEQ ID NO：2)，CDRH3是HGRGYNGYEGAFDI(SEQ ID NO：3)，CDRL1是RASQGISSALA(SEQ ID NO：4)，CDRL2是DASSLES(SEQ ID NO：5)并且CDRL3是CQQFNSYPLT(SEQ ID NO：6)，并且其中抗体的结合诱导c-Kit的内化和/或降解，和/或降低c-Kit和/或MAPK的磷酸化，抑制肿瘤细胞的体外生长和/或降低肿瘤细胞的体内生长。
用于转化载体和表达本发明的抗体的优选的宿主细胞是哺乳动物细胞，例如，NS0细胞(非分泌型(0)小鼠骨髓瘤细胞)、293、SP20和CHO细胞，和淋巴组织起源的其他细胞系，如淋巴瘤、骨髓瘤或杂交瘤细胞。可以备选地使用其他的真核宿主，如酵母。
涉及c-Kit抗体时，“分离的”抗体是已经被鉴别并与其天然环境的组分分开和/或从所述组分中回收的抗体。其天然环境的污染组分是将干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且包括酶、激素，和其他蛋白质或非蛋白质的溶质。在优选的实施方案中，本发明的抗体将被纯化至(1)通过Lowry方法确定的大于以抗体重量计的95％，和最优选大于以重量计的99％，(2)利用旋杯测序仪足以获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)使用考马斯蓝或优选银染，在还原或非还原条件下的SDS-PAGE为均质。涉及本发明的c-Kit抗体时，术语“分离的”可包括在重组细胞内原位的抗体，因为抗体的天然环境中的至少一种组分是不存在的。可以通过本领域已知的任何方法分离或纯化本发明的C-Kit抗体，包括通过硫酸铵或硫酸钠沉淀，再进行生理盐水透析、离子交换层析、亲和或免疫亲和层析，包括但不限于蛋白-A亲和层析、以及凝胶过滤或区域电泳。
此外，本发明提供了含有与控制序列(如表达序列、启动子和/或增强子序列)有效连接的前述多核苷酸序列的表达载体。已研发了多种用于在原核系统(如细菌)和真核系统(包括但不限于酵母和哺乳动物细胞培养体系)中有效率合成抗体多肽的表达载体。本发明的载体可包含染色体的、非染色体的，和合成的DNA序列的区段。
本发明还提供了含有前述重组载体的重组宿主细胞。本发明的抗体可以在杂交瘤以外的细胞系中表达。包含编码根据本发明抗体的序列的核酸可用于转化合适的哺乳动物宿主细胞。
特别优选的细胞系是基于目标蛋白的高水平表达、组成型表达和来自宿主蛋白质的最低污染来选择的。可用作表达宿主的哺乳动物细胞系是本领域普遍已知的，包括许多永生化的细胞系，例如但不限于COS-7细胞、中华田鼠卵巢细胞(CHO)、幼仓鼠肾细胞(BHK)和其他许多包括淋巴样起源的细胞系，如淋巴瘤、骨髓瘤或杂交瘤细胞。
本发明还提供了通过向人施用有效量的本文描述的c-Kit抗体，治疗人的肿瘤生长和/或癌症的方法。根据本发明待治疗的合适病况涉及表达人c-Kit的细胞。尽管不欲受任何特定机制的约束，本方法仍提供了对癌细胞生长的治疗，包括例如，c-Kit依赖性的肿瘤性生长。
在本发明的上下文中，“治疗”指治疗性处理，包括抑制、减慢、减轻或逆转潜在病况或与疾病或病症相关的不理想的生理改变的进程，改善病况的临床症状，或预防出现病况的临床症状。有益或理想的临床结果包括但不限于减轻症状、消除疾病或病症的程度、稳定疾病或病症(即，其中疾病或病症不恶化)、延迟或减慢疾病或病症的进展、改善或减轻疾病或病症，和(部分或完全)免除疾病或病症，不论是可检测的或不可检测的。治疗还可意指相比不接受治疗时的预期存活，延长存活。需要治疗的是已经患病的。在一个实施方案中，本发明可用作药物。
在本发明的方法中，向有需要的人施用治疗有效量的本发明的抗体。此外，本发明的药物组合物可包括治疗有效量的本发明的c-Kit抗体。“治疗有效量”或“有效剂量”指有效实现理想的治疗结果所必需的剂量和时间段的量。治疗有效量的抗体可以根据因素不同，所述因素如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，和抗体或抗体部分引发个体中理想应答的能力。其他因素包括施用、靶位点、患者的生理状态、患者是人或动物、施用的其他药物，和治疗是预防性或治疗性的。治疗有效量还是抗体或抗体部分的任何毒性或有害效应被治疗上的有益效应超越的量。虽然本文描述的c-Kit抗体对于向人施用是特别有效的，但仍可向其他哺乳动物施用，以及用于治疗目的。
可以调节剂量方案以提供最优理想的应答(例如治疗或预防性应答)。可以使用本领域技术人员已知的常规方法滴定治疗剂量，以使得安全性和疗效最佳。给药方案的范围通常是从单次大丸剂量或连续灌注，至每天多次施用(例如，每4-6小时)，或根据治疗医师和患者的病况提示。可以由治疗患者的医生确定给药量和频率、然而应注意到，本发明不限于任何特定的剂量。
本发明的抗c-Kit抗体可以与抗肿瘤剂组合施用，所述抗肿瘤剂包括但不限于阿糖孢苷(即，araC)、达卡巴嗪(DTIC)、顺铂或依托泊苷。
在本发明中，可以使用任何合适的方法或途径以施用本发明的c-Kit抗体，和任选地，共同施用抗肿瘤剂和/或其他受体的拮抗剂。在本发明的组合疗法中，可以在开始用另一种活性剂的疗法之前、过程中、几乎同时或之后施用c-Kit抗体。
当用于治疗性处理的目的时，优选将本发明的c-Kit抗体配制成药物组合物。这类药物组合物及其制备方法是本领域普遍已知的。参见例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy(A.Gennaro等人编著，第21版，Mack Publishing Co.，2005)。
实施例1：抗人c-Kit的人单克隆抗体
抗人c-Kit mAb，CK6的CDR的氨基酸序列显示在表1中。
表1
CK6 HC CK6 LC
CDR1 SYWIG(SEQ ID NO：1) RASQGISSALA(SEQ ID NO：4)
CDR2 IIYPGDSDTRYSPSFQG(SEQ ID NO：2) DASSLES(SEQ ID NO：5)
CDR3 HGRGYNGYEGAFDI(SEQ ID NO：3) CQQFNSYPLT(SEQ ID NO：6)
下表2中提供了描述CK6mAb HCVR、LCVR、重链(HC)和轻链(LC)的氨基酸序列及编码它们的cDNA序列的SEQ ID NO。
表2
*序列包括分泌性信号肽的氨基酸序列
**序列包括编码分泌性信号肽的核苷酸序列
实施例2：表达和纯化人IgG1抗人c-Kit单克隆抗体
可以通过PCR扩增编码抗c-Kit mAb的重链可变区和轻链可变区的cDNA序列，用于根据本领域已知的方法，克隆到表达载体中。例如，可以将编码重链可变区的cDNA(例如，SEQ ID NO：8)与载体pEE6.1(LonzaBiologics plc，Slough，Berkshire，UK)中编码人免疫球蛋白重链γ1恒定区的cDNA序列符合读框融合。可以将编码整个人轻链的cDNA(例如，SEQID NO：16)直接克隆到载体pEE12.1中(Lonza Biologics PLC，Slough，Berkshire，UK)。可以通过电穿孔将改造的免疫球蛋白表达载体稳定转染到NS0骨髓瘤细胞中，并在谷氨酰胺合成酶选择培养基中培养转染物。可以通过抗人c-Kit特异性结合的ELISA，筛选表达抗体的稳定克隆。阳性克隆可以培养到无血清培养基中，用于在旋动烧瓶或生物反应器中进行抗体生产。可以通过蛋白质亲和层析(Poros A，PerSeptive Biosystems Inc.，Foster City，CA)纯化全长的IgG1抗体，并洗脱到中性缓冲的生理盐水溶液中。
备选地，可以克隆编码抗人c-Kit mAb的重链可变区和轻链可变区的cDNA序列(例如，分别是SEQ ID NO：8和14)，并与GS(谷氨酰胺合成酶)表达载体中编码人免疫球蛋白重链γ1恒定区的cDNA序列符合读框融合。将经改造的免疫球蛋白表达载体稳定转染到CHO细胞中。验证表达特异性结合人c-Kit的抗体的稳定克隆。将阳性克隆在无血清培养基中扩大培养，用于在生物反应器中生产抗体。可以通过蛋白A亲和层析纯化全长IgG1抗体，并洗脱到中性缓冲的生理盐水溶液中。
实施例3：抗人c-Kit单克隆抗体，CK6的体外结合和阻断活性
可以使用本领域已知的免疫学定量技术，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)，确定纯化的抗c-Kit mAb的体外c-Kit结合和阻断活性。简而言之，用100μl/孔的1μg/ml重组人c-Kit(rh-c-Kit)蛋白(R&D Systems，Minneapolis，MN)在室温(20-25℃)包被96孔微滴度板1小时。洗涤后，用3％PBS/牛奶封闭孔。然后，向rh-c-Kit-包被的孔中加入纯化的抗c-Kit mAb的不同稀释物，所述稀释物通常自1.5μg/ml或100nM开始，并允许在室温孵育2小时。在洗涤若干次(3-5)后，向平板中加入1：1000稀释的抗人IgG-HRP缀合的抗体(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)，室温下1小时。洗涤平板，向各孔加入HRP底物，并孵育直至出现蓝色。加入终止溶液，并测量450nm处的吸光值。在如上述ELISA中测试单克隆抗体CK6与rh-c-Kit蛋白的结合。结果提示CK6以约3x10-11M的EC50值结合rh-c-Kit。
还测试纯化的mAb阻断c-Kit与其配体结合的能力。简而言之，用100μl/孔的1μg/ml c-Kit配体干细胞因子(SCF)(R&D Systems)，在室温(20-25℃)包被96孔微滴度板1小时。洗涤后，用3％PBS/牛奶封闭孔。先将mAb的不同稀释物(通常自1.5μg/ml或1.0μM开始)与rh-c-Kit(R&D Systems)室温孵育1小时，然后加入到SCF-包被的孔中，在室温额外孵育2小时。在洗涤若干次(3-5)后，向平板中加入1：1000稀释的抗人IgG-HRP缀合的抗体，在室温下1小时。在0.2％Tween-PBS中洗涤平板，并向各孔加入HRP底物，并孵育直至出现蓝色。加入终止溶液，测量450nm处的吸光值。
在上述测定中，测试单克隆抗体CK6阻断c-Kit与其配体结合的能力。结果提示CK6以约4x10-11M的IC50值阻断c-Kit-配体相互作用。
实施例4：抗c-Kit单克隆抗体，CK6的结合动力学
可以根据本领域已知的方法，通过SPR生物传感器(如BIAcore 3000或BIAcore T100(GE Health Care，Piscataway，NJ))确定抗c-Kit单克隆抗体与rh-c-kit的结合动力学。基本上，可以使用BIAcore T100和作为结合亲和力测量过程中的运行缓冲液的HBS-EP(0.01M HEPES-pH7.4，0.15mM NaCl，3mM EDTA和0.005％(v/v)表面活性剂P20)，用SPR评估抗cKit单克隆抗体。在25℃实施测量。使用标准的胺基偶联方法，在CM5芯片上固定约120响应单位(RU)的rh-c-kit(pH5.0)。可以在固定化rh-c-kit上注射mAb180秒，流速为约30μL/min，再用HBS-EP进行900秒解离。抗c-Kit单克隆抗体的浓度可以是2倍稀释的梯度，每个梯度至少3个浓度，每次实验至少3个梯度。在解离后，可以以30μl/min注射50mM HCl2个30秒，实现rh-c-kit表面的再生。可以使用BIAcoreT100评估软件，确定速度常数。可以从速率常数的比例Koff/Kon，计算亲和力常数KD。相互作用的“Kon，M-1s-1”和“Koff，s-1”速率用于确定抗体/受体相互作用的亲和力(KD，M)。
测试单克隆抗体CK6与人c-Kit蛋白的结合动力学。测量值是在25℃获得的。表3中展示了mAb CK6的KD、Kon和Koff速率。
表3
KD(M) Kon(1/Ms) Koff(1/s)
CK6 6.6x10-11 2.3x106 1.5x10-4
实施例5：抗人c-Kit单克隆抗体，CK6的物种特异性
可以通过在ELISA中，测量抗体与人、食蟹猴和小鼠c-Kit蛋白的反应性，确定抗人c-Kit mAb的物种结合特异性。简而言之，用100μl/孔的商业获得的1μg/ml重组人c-Kit蛋白(rh-c-Kit)或重组小鼠c-Kit(rm-c-Kit；Gln26-Thr519)(R&D Systems)或食蟹猴c-Kit(cyno-c-Kit；重组制备的Met1-His549)在室温包被96孔微滴度板1小时。洗涤后，用3％PBS/牛奶封闭孔。然后，向c-Kit包被的孔内加入人抗人-c-Kit mAb的系列稀释物，并允许室温孵育2小时。洗涤若干次后，向平板加入抗人IgG-HRP缀合的抗体的1：1000稀释物，室温下1小时，从而检测结合的人抗体。洗涤平板，向各孔加入HRP底物，孵育直到出现蓝色。加入终止溶液，测量450n处的吸光值。结果显示，CK6结合rh-c-Kit、食蟹猴c-Kit(EC50为5.7x10-11M)，但不显著结合rm-c-Kit(表4)。
表4：CK6Ab与人和小鼠c-Kit结合(ELISA)
表5：CK6 Ab与人和食蟹猴c-Kit的结合(ELISA)
基于流式细胞术分析，还可以就c-Kit mAb与在人Mo7e和小鼠P815细胞表面上表达的细胞膜结合的c-Kit的结合，检测c-Kit mAb的物种特异性(见例如，WO2004/007735)。简而言之，将完整的、活的人Mo7e和小鼠P815细胞血清饥饿过夜，在冷的封闭缓冲液(PBS中的5％FBS)中洗涤3次，然后重悬在100μl封闭缓冲液中。加入1.0μg/ml的抗c-Kit抗体，并在4℃孵育混合物30分钟。加入1.0μg/ml的缀合荧光的二抗(JacksonImmunoResearch)，以通过流式细胞术分析检测与细胞表面结合的人抗体。结果显示，在基于细胞的测定中，CK6结合人肿瘤细胞(即，Mo7e)表达的细胞膜结合的人c-Kit，但不结合由小鼠肿瘤细胞(即，p815)表达的细胞膜结合的小鼠(p815)c-Kit。
表6：表达人和小鼠c-Kit的细胞系(FACS)
还可以通过测量mAb与分离的食蟹猴骨髓细胞表面上表达的细胞膜结合的c-Kit的结合，测试c-Kit mAb的物种特异性。简而言之，将DPBS悬浮液中的骨髓分层置于Histopaque 1077密度梯度以分离血液组分。在离心后，从界面收获白血细胞，并在ACK裂解缓冲液中快速漂洗，以去除然后剩余的红血细胞。然后，用CK6标记分离的白细胞，随后用缀合了藻红蛋白的抗人IgG二抗，并进行FACS分析。
表7：FACS分析食蟹猴骨髓细胞的c_Kit表达
使用CK6 mAb对食蟹猴骨髓细胞进行c-Kit表达的FACS分析提示CK6结合在骨髓细胞的细胞表面上表达的细胞膜结合的食蟹猴c-Kit。
实施例6：体外c-Kit内化测定
可以使用体外细胞测定，测量c-Kit mAb针对表达人c-Kit的细胞的中和活性。这类测定可基于c-Kit mAb诱导的内化，可应用如下文简要描述的荧光活化细胞分选(FACS)分析。
在4℃孵育浓度为1x106细胞/ml的血清饥饿的、表达c-Kit的Mo7e细胞1小时。向细胞添加浓度为1μg/ml的抗c-Kit抗体，在4℃和37℃孵育不同的时间间隔。在200μl封闭缓冲液(PBS中的5％胎牛血清)中洗涤细胞3次，去除任何未结合的抗体。将细胞重悬在100μl封闭缓冲液中。添加缀合了藻红蛋白的抗人IgG-Fc-γ抗体(JacksonImmunoResearch)，以检测结合的抗体的存在，并且将之前没有暴露于抗体的细胞作为阴性对照。从此时开始，尽可能将细胞保持在黑暗中。在4℃孵育细胞30分钟，并如前述洗涤。然后，通过检测荧光标记的细胞的多色检测系统(例如，Guava easyCyte System(Millipore，Billerica，MA))，运行细胞样品。
细胞表面的平均荧光密度反映了在用c-Kit抗体处理后，细胞表面剩余的c-Kit分子的量。代表性实验的数据显示，在用抗c-Kit mAb CK6在37℃孵育1小时、6小时和24小时后，细胞表面c-Kit的时间依赖性降低(参见表8)。用CK6在4℃孵育，导致c-Kit含量的非显著性改变(阴性对照)。这些数据显示，抗c-Kit mAb CK6在体外在表达c-Kit的细胞中显著诱导c-Kit内化。
表8：CK6体外诱导c-Kit的内化
实施例7：体外c-Kit降解测定
可以使用体外基于细胞的测定，测量c-Kit mAb诱导c-Kit降解的能力，这是通过在用c-Kit mAb 37℃处理肿瘤细胞后，在细胞裂解液中发现的c-Kit总量测量的。简而言之，以3ml无血清培养基中3x106细胞/ml的密度将表达c-Kit的人细胞系(例如，Mo7e和GIST882)接种在6孔培养皿中。向孔内添加CK6抗体(100ng/ml)，并在37℃孵育48、24或12小时。留下1个孔的细胞未处理作为对照。在处理时间之后，立即在冷PBS中洗涤细胞，在100μl裂解缓冲液(50mM Hepes pH7.5，150mMNaCl，10mM NaPPi，50mM NaF，1mMNa3VO4，1％Triton X-100，蛋白酶抑制剂混合物)中裂解。在冰上孵育10分钟后，在4℃，12,000rpm离心细胞15分钟。收集上清液，并在还原条件下进行western印迹分析。用抗人c-Kit抗体(Invitrogen，Carlsbad，CA；货号#34-8800)探测印迹，以检测在用CK6孵育不同的时间前后，细胞中的c-Kit总量。结果显示，相比未处理的细胞，在用c-Kit mAb，CK6孵育12小时后，c-Kit显著降解(表9)。CK6诱导的c-Kit降解以时间依赖性的方式增加。如之前的科学文献报道所预期的，在用SCF(100ng/ml)37℃处理肿瘤细胞12、24和48小时后，未观察到c-Kit的降解(数据未显示)。
表9：体外CK6诱导的c-Kit降解
实施例7a：体外c-Kit降解测定
以3ml无血清培养基中3x106细胞/ml的密度，将表达c-Kit的人细胞系(例如，GIST882、Mo7e和Malm-3M)接种在6孔培养皿中，但全部孔中有1个Mo7e测定使用10％血清。向孔内添加多种浓度的CK6抗体或SCF，并在37℃孵育24或48小时。留下1个孔的细胞未处理作为对照。在处理时间之后，立即在冷PBS中洗涤细胞，在100μl裂解缓冲液(50mM Hepes pH7.5，150mM NaCl，10mM NaPPi，50mM NaF，1mMNa3VO4，1％Triton X-100，蛋白酶抑制剂混合物)中裂解。在冰上孵育10分钟后，在4℃，12,000rpm离心细胞15分钟。收集上清液，并在还原条件下进行western印迹分析。用抗人c-Kit抗体(Invitrogen，Carlsbad，CA；货号#34-8800或Cell Signaling Technology，Danvers，MA；货号#3308)探测印迹，以检测在用CK6或SCF孵育前后，细胞中的c-Kit总量。结果显示，相比未处理的细胞，用c-Kit mAb，CK6孵育后没有显著的c-Kit降解。当使用0％血清时，用SCF(1ug/ml和100ng/ml)37℃处理Mo7e肿瘤细胞24小时后，观察到c-Kit降解。当使用10％血清时，SCF诱导的降解不明显。(重复：GIST882＝3，Malm-3M＝1)。为了证实等量的蛋白质装载量，用抗GAPDH抗体(Ambion，Carlsbad，CA；货号#AM4300)重新探测印迹。
实施例8：鉴定c-Kit-依赖性的人癌细胞系
由于在大部分成年组织中缺少c-Kit表达，肿瘤内的c-Kit表达的检测通常提示了c-Kit-依赖性的细胞生长。可以使用流式细胞术分析，随后进行基于c-Kit相关细胞的磷酸化和活力测定，测试源自人癌症的细胞系的c-Kit表达。
简而言之，对于通过流式细胞术分析c-Kit表达，将全部1.0x106个活细胞血清饥饿过夜，在封闭缓冲液(PBS中5％胎牛血清)中洗涤3次，然后重悬在100μl封闭缓冲液中。加入1.0μg/ml的抗c-Kit抗体或对照抗体，并在4℃孵育混合物30分钟。如前述洗涤细胞，以去除任何多余的或未结合的抗体。再次将细胞重悬在100μl封闭缓冲液中，然后用荧光标记的二抗孵育，以检测与细胞结合的一抗。一旦加入荧光标记的抗体，就在4℃孵育细胞30分钟，并保持在黑暗中。如前述洗涤细胞，以去除未结合的抗体，并重悬在100μl封闭缓冲液中。然后，在检测荧光标记的细胞的多色检测测定系统上(例如，Guava easyCyte System(Millipore，Billerica，MA))，运行细胞样品，所述细胞样品可以包括不相关抗体对照样品。细胞表面的平均荧光强度反映了较之不相关的抗体对照，在细胞表面的c-Kit分子的量。
对于通过western印迹的c-Kit表达，将3.0x106个细胞血清饥饿过夜，然后在冷PBS中洗涤。在100μl冰冷的裂解缓冲液(50mM Hepes pH7.5，150mM NaCl，10mM NaPPi，50mM NaF，1mM Na3VO4，1％TritonX-100，蛋白酶抑制剂混合物)中冰上裂解细胞10分钟。通过在4℃，12,000rpm离心15分钟沉淀细胞碎片。收集上清液，并在还原条件下进行western印迹分析。用抗人c-Kit抗体(R&D Systems)和恰当的HRP-标记的二抗探测印迹，以检测细胞中存在的c-Kit的量。
在有或没有用c-Kit配体SCF(Peprotech，NJ)刺激的处理之后，可以通过如上所述裂解细胞，确定c-Kit状态。使用对磷酸化的c-Kit特异性的抗体探针，对细胞裂解液进行Western印迹。在印迹中未刺激和经刺激的细胞的条带均存在提示了c-Kit中存在活化的突变，从而使c-Kit即使在缺少其配体的条件下也磷酸化，或者细胞系在过表达回路中生产其自身的配体。仅在存在配体的条件下被磷酸化的细胞系是过表达的野生型(WT)。
表10
细胞系 来源 c-Kit状态
TF-1 红白血病 过表达的WT
Mo7e 巨核细胞的 过表达的WT
EOL-1 嗜酸性的 过表达的WT
HEL 红白血病 过表达的WT
OCI-M1 红白血病 过表达的WT
CMK 巨核细胞的 过表达的WT
OCI-AML5 AML 活化的突变
GDM1 AML 活化的突变
NCI-H526 SCLC 过表达的回路
NCI-H378 SCLC 过表达的回路
SK-N-MC 神经母细胞瘤 过表达的WT
RDES 尤文氏肉瘤 过表达的回路
TC32 尤文氏肉瘤 过表达的回路
CADO-ES1 尤文氏肉瘤 过表达的回路
MHH-ES1 尤文氏肉瘤 过表达的回路
GIST882 GIST 活化的突变
LN04 GIST 活化的突变
T1 GIST 活化的突变
RT4 膀胱 过表达的WT
RC29 肾 过表达的WT
MALM-3M 黑色素瘤 过表达的WT
WM39 黑色素瘤 过表达的WT
基于基本如此实施例所述进行的分析，确定了源自白血病、黑色素瘤、SCLC、尤文氏肉瘤和GIST的15个细胞系是c-Kit-依赖性的(参见表10)。通过文献检索和序列分析验证了各细胞系的c-Kit状态。
实施例9：体外c-Kit和MAP激酶磷酸化测定
SCF与c-Kit的相互作用诱导c-Kit二聚体化，导致细胞质结构域的酪氨酸残基的自磷酸化。激活了c-Kit下游的多个信号传导组分，包括磷脂酰肌醇3-激酶、Src家族成员，JAK/STAT途径和Ras-Raf-MAP激酶(MAPK)级联反应。
根据下列方法，可以在体外在基于细胞的测定中，确定抗人c-Kit mAb响应SCF抑制c-Kit和MAPK磷酸化的能力。简而言之，如以上实施例8所述，将c-Kit依赖性细胞系血清饥饿过夜。然后，将所述细胞系用抗c-KitmAb的不同稀释物孵育，范围通常是100nM至0.1nM，37℃孵育1小时。然后，在37℃，用5ng/ml SCF(R&D Systems或Peprotech)刺激细胞15分钟。然后，立即在冰冷的PBS中洗涤细胞，并在100μl冰冷的裂解缓冲液(50mM Hepes pH7.5，150mM NaCl，10mM NaPPi，50mM NaF，1mM Na3VO4，1％Triton X-100，蛋白酶抑制剂混合物)中在冰上裂解10分钟，以提取细胞蛋白质。通过在4℃，12,000rpm离心15分钟沉淀细胞碎片。收集上清液，并在还原条件下进行western印迹分析。用磷酸特异性的抗人c-Kit或MAPK抗体和恰当的HRP-标记的二抗探测印迹，以检测在我们的实验条件下的c-Kit和MAP激酶的磷酸化水平。
在Mo7e白血病细胞中，测试单克隆抗体CK6响应SCF抑制c-Kit和MAPK磷酸化的能力。mAb CK6在磷酸化抑制测定中的IC50确定为300pM。这些结果证明，抗c-Kit mAb CK6可以有效阻断c-Kit活化及其下游的信号传递。
实施例10：体外肿瘤细胞生长抑制测定
可以使用多种可商购的细胞活力测定试剂盒中的任一种，在体外测定中测验本发明的c-Kit单克隆抗体对肿瘤细胞生长的抑制作用。更具体而言，根据生产商的说明，使用可商购的细胞活力试剂盒(例如，CellTiter-GloLu minescent Cell Viability Assay，Promega，Madison，WI，USA)，测试CK6抑制肿瘤细胞生长的能力。
通过使用CellTiter-GloLuminescent Cell Viability Assay试剂盒，确定抗c-Kit单克隆抗体CK6以约300pM的IC50抑制Mo7e细胞的细胞活力(数据未显示)。
实施例11：体内肿瘤细胞生长抑制测定
可以在相关的体内异种移植物模型中进一步测验本发明的抗c-Kit抗体的抗肿瘤功效，所述模型基本上是本领域已知和普遍使用的。
简而言之，培养扩大c-Kit-依赖性的人癌细胞系，然后，以每只小鼠2百万-1千万个细胞，皮下注射到无胸腺裸鼠(Charles River，Wilmington，MA)的后胁。在PBS pH7.2中稀释抗c-Kit mAb，并以4或40mg/kg静脉内注射施用。当肿瘤大小已达到约180-360mm3时，将小鼠随机分组并分为对照(例如，USP生理盐水10μl/g)和治疗组(例如，4或40mg/kg的mAb CK6)。此外，治疗组可以包括单独的恰当的化疗药或批准的RTK抑制剂，或与本发明的抗体的组合。每周施用抗体和生理盐水对照3次，施用4周。在治疗过程中，通过三维卡尺每周2次测量肿瘤体积，确定肿瘤细胞生长的抑制。可如下计算肿瘤体积：
肿瘤体积(mm3)＝(肿瘤的长度)(肿瘤的宽度2)(π/6)，
其中，肿瘤的长度是与皮肤表面平行的肿瘤的最大尺寸，宽度是与长度垂直，与皮肤表面平行的最大测量值。在治疗过程中，还频繁测量体重，作为毒性的一般性测量。通过RM ANOVA计算T/C％和P值，其中
T/C％＝[(治疗体积/初始体积)/(对照体积/初始体积)]*100，并且相对于生理盐水计算P值。
表11-14中显示了来自使用CK6作为治疗的多种c-Kit相关的异种移植物模型的数据。
表11：在使用多种人肿瘤细胞系的异种移植物测定中CK6作为单一疗法
表12：在使用人白血病细胞系的异种移植物测定中CK6作为单一疗法或组合疗法
表13：在使用人黑色素瘤细胞系的异种移植物测定中CK6作为单一疗法或组合疗法
表14：在使用人小细胞肺癌细胞系的异种移植物测定中CK6作为单一疗法或组合疗法
这些数据表明，抗c-Kit mAb CK6在多种c-Kit相关的异种移植物模型中显著抑制肿瘤细胞生长。较之标准的抗癌剂，如阿糖孢苷(araC)和达卡巴嗪(DTIC)，以及顺铂与依托泊苷的组合，用CK6治疗表现出更强的抗肿瘤活性。此外，CK6与DTIC或AraC的组合表现出较之单一疗法更强的抗肿瘤活性。同样地，CK6与顺铂和依托泊苷的组合表现出较之仅顺铂和依托泊苷的组合更强的抗肿瘤活性。

Claims (5)

1.抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合由如SEQ ID NO:20中的氨基酸序列组成的人c-Kit的胞外结构域ECD，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区HCVR和轻链可变区LCVR，其中HCVR包含CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列，并且LCVR包含CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其中CDRH1是SYWIG(SEQ ID NO:1)，CDRH2是IIYPGDSDTRYSPSFQG(SEQ ID NO:2)，CDRH3是HGRGYNGYEGAFDI(SEQ ID NO:3)，CDRL1是RASQGISSALA(SEQ ID NO:4)，CDRL2是DASSLES(SEQID NO:5)，并且CDRL3是CQQFNSYPLT(SEQ ID NO:6)。
2.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中LCVR氨基酸序列是SEQ ID NO:13，并且HCVR氨基酸序列是SEQ IDNO:7。
3.权利要求1-2中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中重链氨基酸序列是SEQ ID NO:9并且轻链氨基酸序列是SEQ ID NO:15。
4.权利要求1或2的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含两条重链和两条轻链，其中每条重链氨基酸序列是SEQ ID NO:9并且每条轻链氨基酸序列是SEQ IDNO:15。
5.权利要求3的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含两条重链和两条轻链，其中每条重链氨基酸序列是SEQ ID NO:9并且每条轻链氨基酸序列是SEQ ID NO:15。
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