背景技术
单唾液酸四己糖神经节苷脂钠(Monosialotetrahexosylganglioide Sodium,GM1)的制法一般分为提取和纯化两个步骤。纯化方法大致包括:
1、CN1814610A公开了采用大孔树脂分离单唾液酸四己糖神经节苷脂的方法。
2、CN1353112A公开的纯化步骤为:粗品经离子交换柱层析,反相柱层析,所得GM1纯度大于98%。
3、CN1158295C公告了结合使用超滤膜分离技术、Iatrobeads及DEAE Sephadex A25柱层析、高效液相色谱层析技术,纯度达95%以上。
4、Momoi TaKashi建立了阴离子交换层析技术、亲和层析技术。
现有技术都立足于提高产品纯度、收率,降低产品成本,减少毒害有机溶剂(特别是氯仿)的使用量等方面进行了大量的研究,并且市场已有单唾液酸四己糖神经节苷脂钠注射液、注射用单唾液酸四己糖神经节苷脂钠等多种产品在销售使用。然而,由于来源于生物原料猪脑,单唾液酸四己糖神经节苷脂钠的不良反应比较多,特别是与药物中的杂质、污染物、添加剂、病毒或特殊代谢产物形成有关的过敏反应,严重的过敏反应可发生全身皮疹,尤其是黏膜处更多,且有溃烂。
发明内容
本发明提供了一种高纯度的单唾液酸四己糖神经节苷脂钠的制法,该制法获得的产品具有纯度高、不良反应低的特点。本发明的技术方案包括如下内容:
本发明的一种高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂钠的制法,是以新鲜猪脑为原料经过提取步骤和纯化步骤进行制备,其中,
提取步骤包括制丙酮粉步骤、组织总脂的抽提步骤、folch分配步骤、脱病毒步骤、酸水解病毒灭活步骤;
纯化步骤包括脱盐步骤、硅胶层析步骤、反相层析步骤、浓缩步骤、丙酮重结晶步骤、冻干步骤。
优选的本发明提取步骤包括,
制丙酮粉步骤:即将新鲜猪脑捣碎,于-5--15℃用丙酮处理,得沉淀,在70-90℃烘烤,制得丙酮粉;
组织总脂的抽提步骤:即将丙酮粉以体积比3∶1-1∶3的氯仿甲醇混合液提取2-5次,得抽提液;
folch分配步骤:即将抽提液用0.05-0.15体积的水进行folch分配,有机层弃去,保留水层,得上清液;
脱病毒步骤:将上清液加氢氧化钠1-10重量份,于室温下水解3-7小时,醋酸中和至pH7-9,用截留分子量为3000-50000的分子膜截留,得滤液;最优的为截留分子量为30000-50000的分子膜.
酸水解病毒灭活步骤:将滤液用醋酸调节pH至3.5-4.5,于50-70℃水解8-12小时(巴氏灭菌法),水解液冷却,用氢氧化钠调pH至中性,离心,干燥,得总脂粗品干粉。
最优的本发明提取步骤包括,
制丙酮粉步骤为:将新鲜猪脑捣碎,于-10℃用丙酮处理,得沉淀,在80℃烘烤,制得丙酮粉;
组织总脂的抽提步骤为:将丙酮粉以体积比2∶1的氯仿甲醇混合液提取3次,得抽提液;
folch分配步骤为:将抽提液用0.1体积的水进行folch分配,有机层弃去,保留水层,得上清液;
本发明的“Folch分配法”是指以二氯甲烷/甲醇液液相分离法来提取脂质的方法。
脱病毒步骤:将上清液加氢氧化钠5重量份,于室温下水解5小时,醋酸中和至pH8,用截留分子量为3000-50000的分子膜截留,得滤液;
酸水解病毒灭活步骤:将滤液用醋酸调节pH至4,于60℃水解10小时,采用巴氏灭菌法,水解液冷却,用氢氧化钠调pH至中性,离心,干燥,得总脂粗品干粉。
优选的本发明各项纯化步骤为:
脱盐步骤:以HI PREPTM柱脱盐,214nm紫外监测,电导率监测,水平衡后,将总脂粗品干粉上柱,用水洗脱,收集紫外峰部分,得水相收集液;
本发明中,HiTrapTM、HiLoadTM和RESOURCETM均可作为HIPREPTM柱的替代。
硅胶层析步骤:体积比为3-9∶1-3∶0.1-0.3的氯仿、甲醇、水混合液平衡硅胶柱,将水相收集液上柱后,用上述氯仿、甲醇、水混合液洗脱,TLC检测收集洗脱液,得收集液;
反相层析步骤:将收集液过Source RPC30柱,经水平衡,分别用80%甲醇分离和100%甲醇洗脱,214nm紫外监测,收集紫外洗脱峰,得反相收集液;
本发明的反相层析所用填料不限于Source RPC30。
浓缩步骤:将反相收集液浓缩、冷却析晶,过滤、得单唾液酸四己糖神经节苷脂钠粗品;
丙酮重结晶步骤:将单唾液酸四己糖神经节苷脂钠粗品用丙酮重结晶,得结晶固体;
冻干步骤:将结晶固体用水溶解后用0.22μm滤膜除菌过滤,冷冻干燥、得半成品,经外包装、装箱得成品。
上述纯化步骤,最优选的硅胶层析步骤:体积比为3∶1∶0.1的氯仿、甲醇、水混合液平衡硅胶柱,将水相收集液上柱后,用上述氯仿、甲醇、水混合液洗脱,TLC检测收集洗脱液,得收集液;
本发明的新鲜猪脑包括如下步骤处理:
在新鲜状态下于≤-18℃冷冻保存一年;
猪脑外观应完整、清洁,色泽新鲜,无异味,无污染杂质;
猪脑剖开后观察,应质地良好,无肿块、萎缩、坏死、出血、炎症等病变。
本发明的有益效果在于,采用高纯度的单唾液酸四己糖神经节苷脂钠制得的注射剂,采用特定pH条件下的脱病毒步骤、酸水解病毒灭活步骤,经对100名使用者的跟踪统计,不良反应发生率降低了47%。
具体实施方式
实施例1单唾液酸四己糖神经节苷脂钠的制备
先将新鲜猪脑捣碎,于-10℃用丙酮处理,得沉淀,在80℃烘烤,制得丙酮粉;将丙酮粉以体积比2∶1的氯仿甲醇混合液提取3次,得抽提液;将抽提液用0.10体积的水进行fo l c h分配,有机层弃去,保留水层,得上清液;将上清液加氢氧化钠1重量份,于室温下水解5小时,醋酸中和至pH8,用截留分子量为30000-50000 的分子膜截留,得滤液;将滤液用醋酸调节pH至4,于60℃水解10小时(巴氏灭菌法),水解液冷却,用氢氧化钠调pH至中性,离心,干燥,得总脂粗品干粉。
HIPREPTM柱脱盐,214nm紫外监测,电导率监测,水平衡后,将总脂粗品干粉上柱,用水洗脱,收集紫外峰部分,得水相收集液;用体积比为3∶1∶0.1的氯仿、甲醇、水混合液平衡硅胶柱,将水相收集液上柱后,用上述氯仿、甲醇、水混合液洗脱,TLC检测收集洗脱液,得收集液;将收集液过Source RPC30柱,经水平衡,分别用80%甲醇分离和100%甲醇洗脱,214nm紫外监测,收集紫外洗脱峰,得反相收集液;将反相收集液浓缩、冷却析晶,过滤、得单唾液酸四己糖神经节苷脂钠粗品;将单唾液酸四己糖神经节苷脂钠粗品用丙酮重结晶,得结晶固体;将结晶固体用水溶解后用0.22μm滤膜除菌过滤,冷冻干燥、得半成品,经外包装、装箱得成品,纯度达>99.1%。
实施例2单唾液酸四己糖神经节苷脂钠的制备
与实施例1基本步骤相同,所不同是参数数值。具体制法为:先将新鲜猪脑捣碎,于-15℃用丙酮处理,得沉淀,在75℃烘烤,制得丙酮粉;将丙酮粉以体积比3∶1的氯仿甲醇混合液提取5次,得抽提液;将抽提液用0.15体积的水进行folch分配,有机层弃去,保留水层,得上清液;将上清液加氢氧化钠3重量份,于室温下水解4小时,醋酸中和至pH7,用截留分子量为30000-50000的分子膜截留,得滤液;将滤液用醋酸调节pH至3,于70℃水解8小时(巴氏灭菌法),水解液冷却,用氢氧化钠调pH至中性,离心,干燥,得总脂粗品干粉。
将HIPREPTM柱脱盐,214nm紫外监测,电导率监测,水平衡后,将总脂粗品干粉上柱,用水洗脱,收集紫外峰部分,得水相收集液;用体积比为2∶1∶0.15的氯仿、甲醇、水混合液平衡硅胶柱,将水相收集液上柱后,用上述氯仿、甲醇、水混合液洗脱,TLC检测收集洗脱液,得收集液;将收集液过Source RPC30柱,经水平衡,分别用80%甲醇分离和100%甲醇洗脱,214nm紫外监测,收集紫外洗脱峰,得反相收集液;将反相收集液浓缩、冷却析晶,过滤、得单唾液酸四己糖神经节 苷脂钠粗品;将单唾液酸四己糖神经节苷脂钠粗品用丙酮重结晶,得结晶固体;将结晶固体用水溶解后用0.22μm滤膜除菌过滤,冷冻干燥、得半成品,经外包装、装箱得成品,纯度达>99.3%
实施例3原料猪脑的质量标准
1.1来源
符合国家食品卫生规定的肉联厂,取材于检疫合格的生猪,雌雄不限。
1.2质量标准
1)必须是具有检疫合格证明的健康猪脑;
2)在新鲜状态下于≤-18℃冷冻保存一年;
3)猪脑外观应完整、清洁,色泽新鲜,无异味,无污染杂质;
4)猪脑剖开后观察,应质地良好,无肿块、萎缩、坏死、出血、炎症等病变。
5)应符合国家规定的食品卫生学和菌检要求。
以上所述实施例仅仅是本发明的优选实施方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进,均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。