CN103524572A - 高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂钠的制法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高纯度的单唾液酸四己糖神经节苷脂钠的制法，是以新鲜猪脑为原料经过提取步骤和纯化步骤进行制备，其中提取步骤包括制丙酮粉步骤、组织总脂的抽提步骤、folch分配步骤、脱病毒步骤、酸水解病毒灭活步骤；纯化步骤包括脱盐步骤、硅胶层析步骤、反相层析步骤、浓缩步骤、丙酮重结晶步骤、冻干步骤。本发明的有益效果在于，采用高纯度的单唾液酸四己糖神经节苷脂钠制得的注射剂，采用特定pH条件下的脱病毒步骤、酸水解病毒灭活步骤，经对100名使用者的跟踪统计，不良反应发生率降低了47％。

Description

高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂钠的制法

技术领域

本发明属于制药领域，特别涉及一种高纯度的单唾液酸四己糖神经节苷脂钠的制法。 

背景技术

单唾液酸四己糖神经节苷脂钠(Monosialotetrahexosylganglioide Sodium，GM1)的制法一般分为提取和纯化两个步骤。纯化方法大致包括： 

1、CN1814610A公开了采用大孔树脂分离单唾液酸四己糖神经节苷脂的方法。 

2、CN1353112A公开的纯化步骤为：粗品经离子交换柱层析，反相柱层析，所得GM1纯度大于98％。 

3、CN1158295C公告了结合使用超滤膜分离技术、Iatrobeads及DEAE Sephadex A25柱层析、高效液相色谱层析技术，纯度达95％以上。 

4、Momoi TaKashi建立了阴离子交换层析技术、亲和层析技术。 

现有技术都立足于提高产品纯度、收率，降低产品成本，减少毒害有机溶剂(特别是氯仿)的使用量等方面进行了大量的研究，并且市场已有单唾液酸四己糖神经节苷脂钠注射液、注射用单唾液酸四己糖神经节苷脂钠等多种产品在销售使用。然而，由于来源于生物原料猪脑，单唾液酸四己糖神经节苷脂钠的不良反应比较多，特别是与药物中的杂质、污染物、添加剂、病毒或特殊代谢产物形成有关的过敏反应，严重的过敏反应可发生全身皮疹，尤其是黏膜处更多，且有溃烂。 

发明内容

本发明提供了一种高纯度的单唾液酸四己糖神经节苷脂钠的制法，该制法获得的产品具有纯度高、不良反应低的特点。本发明的技术方案包括如下内容： 

本发明的一种高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂钠的制法，是以新鲜猪脑为原料经过提取步骤和纯化步骤进行制备，其中， 

提取步骤包括制丙酮粉步骤、组织总脂的抽提步骤、folch分配步骤、脱病毒步骤、酸水解病毒灭活步骤； 

纯化步骤包括脱盐步骤、硅胶层析步骤、反相层析步骤、浓缩步骤、丙酮重结晶步骤、冻干步骤。 

优选的本发明提取步骤包括， 

制丙酮粉步骤：即将新鲜猪脑捣碎，于-5--15℃用丙酮处理，得沉淀，在70-90℃烘烤，制得丙酮粉； 

组织总脂的抽提步骤：即将丙酮粉以体积比3∶1-1∶3的氯仿甲醇混合液提取2-5次，得抽提液； 

folch分配步骤：即将抽提液用0.05-0.15体积的水进行folch分配，有机层弃去，保留水层，得上清液； 

脱病毒步骤：将上清液加氢氧化钠1-10重量份，于室温下水解3-7小时，醋酸中和至pH7-9，用截留分子量为3000-50000的分子膜截留，得滤液；最优的为截留分子量为30000-50000的分子膜. 

酸水解病毒灭活步骤：将滤液用醋酸调节pH至3.5-4.5，于50-70℃水解8-12小时(巴氏灭菌法)，水解液冷却，用氢氧化钠调pH至中性，离心，干燥，得总脂粗品干粉。 

最优的本发明提取步骤包括， 

制丙酮粉步骤为：将新鲜猪脑捣碎，于-10℃用丙酮处理，得沉淀，在80℃烘烤，制得丙酮粉； 

组织总脂的抽提步骤为：将丙酮粉以体积比2∶1的氯仿甲醇混合液提取3次，得抽提液； 

folch分配步骤为：将抽提液用0.1体积的水进行folch分配，有机层弃去，保留水层，得上清液； 

本发明的“Folch分配法”是指以二氯甲烷/甲醇液液相分离法来提取脂质的方法。 

脱病毒步骤：将上清液加氢氧化钠5重量份，于室温下水解5小时，醋酸中和至pH8，用截留分子量为3000-50000的分子膜截留，得滤液； 

酸水解病毒灭活步骤：将滤液用醋酸调节pH至4，于60℃水解10小时，采用巴氏灭菌法，水解液冷却，用氢氧化钠调pH至中性，离心，干燥，得总脂粗品干粉。 

优选的本发明各项纯化步骤为： 

脱盐步骤：以HI PREP^TM柱脱盐，214nm紫外监测，电导率监测，水平衡后，将总脂粗品干粉上柱，用水洗脱，收集紫外峰部分，得水相收集液； 

本发明中，HiTrap^TM、HiLoad^TM和RESOURCE^TM均可作为HIPREP^TM柱的替代。 

硅胶层析步骤：体积比为3-9∶1-3∶0.1-0.3的氯仿、甲醇、水混合液平衡硅胶柱，将水相收集液上柱后，用上述氯仿、甲醇、水混合液洗脱，TLC检测收集洗脱液，得收集液； 

反相层析步骤：将收集液过Source RPC30柱，经水平衡，分别用80％甲醇分离和100％甲醇洗脱，214nm紫外监测，收集紫外洗脱峰，得反相收集液； 

本发明的反相层析所用填料不限于Source RPC30。 

浓缩步骤：将反相收集液浓缩、冷却析晶，过滤、得单唾液酸四己糖神经节苷脂钠粗品； 

丙酮重结晶步骤：将单唾液酸四己糖神经节苷脂钠粗品用丙酮重结晶，得结晶固体； 

冻干步骤：将结晶固体用水溶解后用0.22μm滤膜除菌过滤，冷冻干燥、得半成品，经外包装、装箱得成品。 

上述纯化步骤，最优选的硅胶层析步骤：体积比为3∶1∶0.1的氯仿、甲醇、水混合液平衡硅胶柱，将水相收集液上柱后，用上述氯仿、甲醇、水混合液洗脱，TLC检测收集洗脱液，得收集液； 

本发明的新鲜猪脑包括如下步骤处理： 

在新鲜状态下于≤-18℃冷冻保存一年； 

猪脑外观应完整、清洁，色泽新鲜，无异味，无污染杂质； 

猪脑剖开后观察，应质地良好，无肿块、萎缩、坏死、出血、炎症等病变。 

本发明的有益效果在于，采用高纯度的单唾液酸四己糖神经节苷脂钠制得的注射剂，采用特定pH条件下的脱病毒步骤、酸水解病毒灭活步骤，经对100名使用者的跟踪统计，不良反应发生率降低了47%。 

具体实施方式

实施例1单唾液酸四己糖神经节苷脂钠的制备 

先将新鲜猪脑捣碎，于-10℃用丙酮处理，得沉淀，在80℃烘烤，制得丙酮粉；将丙酮粉以体积比2∶1的氯仿甲醇混合液提取3次，得抽提液；将抽提液用0.10体积的水进行fo l c h分配，有机层弃去，保留水层，得上清液；将上清液加氢氧化钠1重量份，于室温下水解5小时，醋酸中和至pH8，用截留分子量为30000-50000 的分子膜截留，得滤液；将滤液用醋酸调节pH至4，于60℃水解10小时(巴氏灭菌法)，水解液冷却，用氢氧化钠调pH至中性，离心，干燥，得总脂粗品干粉。 

HIPREP^TM柱脱盐，214nm紫外监测，电导率监测，水平衡后，将总脂粗品干粉上柱，用水洗脱，收集紫外峰部分，得水相收集液；用体积比为3∶1∶0.1的氯仿、甲醇、水混合液平衡硅胶柱，将水相收集液上柱后，用上述氯仿、甲醇、水混合液洗脱，TLC检测收集洗脱液，得收集液；将收集液过Source RPC30柱，经水平衡，分别用80％甲醇分离和100％甲醇洗脱，214nm紫外监测，收集紫外洗脱峰，得反相收集液；将反相收集液浓缩、冷却析晶，过滤、得单唾液酸四己糖神经节苷脂钠粗品；将单唾液酸四己糖神经节苷脂钠粗品用丙酮重结晶，得结晶固体；将结晶固体用水溶解后用0.22μm滤膜除菌过滤，冷冻干燥、得半成品，经外包装、装箱得成品，纯度达＞99.1％。 

实施例2单唾液酸四己糖神经节苷脂钠的制备 

与实施例1基本步骤相同，所不同是参数数值。具体制法为：先将新鲜猪脑捣碎，于-15℃用丙酮处理，得沉淀，在75℃烘烤，制得丙酮粉；将丙酮粉以体积比3∶1的氯仿甲醇混合液提取5次，得抽提液；将抽提液用0.15体积的水进行folch分配，有机层弃去，保留水层，得上清液；将上清液加氢氧化钠3重量份，于室温下水解4小时，醋酸中和至pH7，用截留分子量为30000-50000的分子膜截留，得滤液；将滤液用醋酸调节pH至3，于70℃水解8小时(巴氏灭菌法)，水解液冷却，用氢氧化钠调pH至中性，离心，干燥，得总脂粗品干粉。 

将HIPREP^TM柱脱盐，214nm紫外监测，电导率监测，水平衡后，将总脂粗品干粉上柱，用水洗脱，收集紫外峰部分，得水相收集液；用体积比为2∶1∶0.15的氯仿、甲醇、水混合液平衡硅胶柱，将水相收集液上柱后，用上述氯仿、甲醇、水混合液洗脱，TLC检测收集洗脱液，得收集液；将收集液过Source RPC30柱，经水平衡，分别用80％甲醇分离和100％甲醇洗脱，214nm紫外监测，收集紫外洗脱峰，得反相收集液；将反相收集液浓缩、冷却析晶，过滤、得单唾液酸四己糖神经节 苷脂钠粗品；将单唾液酸四己糖神经节苷脂钠粗品用丙酮重结晶，得结晶固体；将结晶固体用水溶解后用0.22μm滤膜除菌过滤，冷冻干燥、得半成品，经外包装、装箱得成品，纯度达＞99.3％ 

实施例3原料猪脑的质量标准 

1.1来源 

符合国家食品卫生规定的肉联厂，取材于检疫合格的生猪，雌雄不限。 

1.2质量标准 

1)必须是具有检疫合格证明的健康猪脑； 

2)在新鲜状态下于≤-18℃冷冻保存一年； 

3)猪脑外观应完整、清洁，色泽新鲜，无异味，无污染杂质； 

4)猪脑剖开后观察，应质地良好，无肿块、萎缩、坏死、出血、炎症等病变。 

5)应符合国家规定的食品卫生学和菌检要求。 

以上所述实施例仅仅是本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。 

Claims (6)

1.一种高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂钠的制法，是以新鲜猪脑为原料经过提取步骤和纯化步骤进行制备，其特征在于：

所述提取步骤包括制丙酮粉步骤、组织总脂的抽提步骤、folch分配步骤、脱病毒步骤、酸水解病毒灭活步骤；

所述纯化步骤包括脱盐步骤、硅胶层析步骤、反相层析步骤、浓缩步骤、丙酮重结晶步骤、冻干步骤。

2.如权利要求1所述的制法，其特征在于，

所述制丙酮粉步骤为：将新鲜猪脑捣碎，于-5--15℃用丙酮处理，得沉淀，在70-90℃烘烤，制得丙酮粉；

所述组织总脂的抽提步骤为：将丙酮粉以体积比3∶1-1∶3的氯仿甲醇混合液提取2-5次，得抽提液；

所述folch分配步骤为：将抽提液用0.05-0.15体积的水进行folch分配，有机层弃去，保留水层，得上清液；

所述脱病毒步骤：将上清液加氢氧化钠1-10重量份，于室温下水解3-7小时，醋酸中和至pH7-9，用截留分子量为3000-50000的分子膜截留，得滤液；

所述酸水解病毒灭活步骤：将滤液用醋酸调节pH至3.5-4.5，于50-70水解8-12小时，水解液冷却，用氢氧化钠调pH至中性，离心，干燥，得总脂粗品干粉。

3.如权利要求2所述的制法，其特征在于，

所述制丙酮粉步骤为：将新鲜猪脑捣碎，于-10℃用丙酮处理，得沉淀，在80℃烘烤，制得丙酮粉；

所述组织总脂的抽提步骤为：将丙酮粉以体积比2∶1的氯仿甲醇混合液提取3次，得抽提液；

所述folch分配步骤为：将抽提液用0.1体积的水进行folch分配，有机层弃去，保留水层，得上清液；

所述脱病毒步骤：将上清液加氢氧化钠5重量份，于室温下水解5小时，醋酸中和至pH8，用截留分子量为3000-50000的分子膜截留，得滤液；

所述酸水解病毒灭活步骤：将滤液用醋酸调节pH至4，于60℃水解10小时，采用巴氏灭菌法，水解液冷却，用氢氧化钠调pH至中性，离心，干燥，得总脂粗品干粉。

4.如权利要求2或3所述的任一制法，其特征在于，所述纯化步骤为：

所述脱盐步骤：离子交换柱脱盐，214nm紫外监测，电导率监测，水平衡后，将总脂粗品干粉上柱，用水洗脱，收集紫外峰部分，得水相收集液；

所述硅胶层析步骤：体积比为3-9∶1-3∶0.1-0.3的氯仿、甲醇、水混合液平衡硅胶柱，将水相收集液上柱后，用上述氯仿、甲醇、水混合液洗脱，TLC检测收集洗脱液，得收集液；

所述反相层析步骤：将收集液过反相层析凝胶柱，经水平衡，分别用80％甲醇分离和100％甲醇洗脱，214nm紫外监测，收集紫外洗脱峰，得反相收集液；

所述浓缩步骤：将反相收集液浓缩、冷却析晶，过滤、得单唾液酸四己糖神经节苷脂钠粗品；

所述丙酮重结晶步骤：将单唾液酸四己糖神经节苷脂钠粗品用丙酮重结晶，得结晶固体；

所述冻干步骤：将结晶固体用水溶解后用0.22m滤膜除菌过滤，冷冻干燥、得半成品，经外包装、装箱得成品。

5.如权利要求4所述的制法，其特征在于，所述纯化步骤为：

所述离子交换柱为HIPREP^TM柱；

所述氯仿、甲醇、水混合液的体积比为3∶1∶0.1；

所述反相层析凝胶柱为Source RPC30柱。

6.如权利要求1所述的制法，其特征在于，所述新鲜猪脑包括如下步骤处理：

在新鲜状态下于≤-18℃冷冻保存一年；

猪脑外观应完整、清洁，色泽新鲜，无异味，无污染杂质；

猪脑剖开后观察，应质地良好，无肿块、萎缩、坏死、出血、炎症等病变。