CN103524314A - 一种采用高速逆流色谱法分离制备左旋棉酚的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用高速逆流色谱来分离制备左旋棉酚的方法。所述方法采用二次提取工艺和高效逆流色谱的组合式分离制备技术有效的提取并分离了天然活性物质左旋棉酚，其取得了诸多有益效果：(1)首次采用高效逆流色谱实现左旋棉酚的分离制备，达到了分离效率高、纯度高等诸多优点；(2)采用膨胀溶剂和超声-微波的组合式提取工艺，实现了提取率的最大化，高效地利用了原材料、节约了成本；(3)采用先分离后水解的方法，有效地避免了产物中油脂、色素的存在，提高了产品的纯度，并且可直接获得光学活性物质，上述优点使得该技术具备广泛的工业化前景和市场价值。

Description

一种采用高速逆流色谱法分离制备左旋棉酚的方法
技术领域
本发明涉及一种分离左旋棉酚的方法，更具体地涉及一种采用高速逆流色谱法分离制备左旋棉酚的方法，属于天然产物提取分离领域。
背景技术
棉酚是锦葵科植物草棉、树棉或陆地棉成熟种子、根皮中提取的一种多元酚类物质，具有抑制精子发生和精子活动的作用，其在棉籽粕中的含量最多仅为1.8%左右。近年来，越来越多的研究显示棉酚对多种细胞都具有杀伤和促进凋亡的效果，是一种具有抗肿瘤活性的天然产物。尽管不存在手性原子，棉酚的联萘结构中连接双萘环的化学键具有空间位阻效应，所以天然棉酚是左旋(-)-棉酚和右旋(+)-棉酚的混合物。研究表明，左旋棉酚对细胞的敏感性是右旋棉酚的五倍左右，体外实验表明，左旋棉酚对淋巴、粒细胞、肾上腺、乳腺、宫颈、直肠和中枢神经系统的多种肿瘤细胞株均有明显的增殖抑制活性，左旋棉酚作为抗肿瘤药物已经进入临床二期的实验，它的制备一直是研究的热点问题。
Figure BDA0000403325000000011
上世纪八十年代就有关于用HPLC法拆分消旋棉酚的报道，通过将消旋棉酚与光学活性氨基醇类化合物缩合形成席夫碱，通过C18反相柱分离后，酸水解得到纯的左旋棉酚。但是氨基醇类化合物价格昂贵，条件不易掌握。
CN1033795A的专利申请报道了一种分离光活性棉酚的方法，其技术方案为：将消旋棉酚与筛选的光学活性伯胺类化合物反应，通过石油醚进行TLC分析，再通过柱层析分离缩合物的非对映异构体，进而水解得到光活性棉酚。但是这种方法需要用到大量的有机溶剂，分离效率低，制备周期长；同时，左旋棉酚中的大量酚羟基与层析柱的填料具有较强的结合作用，产品吸附严重，收率较低。
CN101020626A的专利申请报道了一种制备左旋棉酚的方法，其包括如下操作：通过消旋棉酚与天然氨基酸或氨基酸酯进行缩合，进而重结晶得到缩合物的对映体，最后再水解得到左旋棉酚的方法，但是该方法步骤繁多，重结晶时间长且左旋棉酚的光学纯度较低。
高速逆流色谱(High Speed Counter current chromatography)是一种液-液色谱分离技术，其固定相和流动相均为液体，与传统分离纯化方法相比，具有样品无损失、无污染、高效、快速等诸多优点，是一种新兴的适用于天然活性物质的独特分离技术。但现有技术中并没有采用该技术来分离制备棉酚的报道，尤其是具有优异活性的左旋棉酚。
针对现有技术中存在的缺陷和高效逆流色谱的优势，本发明旨在开发一种快速制备左旋棉酚的方法，以克服现有技术中的缺陷，提高分离收率、降低分离成本，满足广大医药客户的需求。
发明内容
有鉴于此，为了克服现有分离技术的不足，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量的创造性劳动和经过深入研究探索后，从而完成了本发明。
具体而言，本发明涉及一种用高速逆流色谱来分离制备左旋棉酚的方法，
所述方法具体包括如下步骤：
(1)消旋体棉酚复合物粗品的制备，其中，所述棉酚复合物是指醋酸棉酚或甲酸棉酚；
(2)高速逆流色谱固定相和流动相的制备；
(3)左旋棉酚复合物的分离纯化步骤；
(4)左旋棉酚的制备。
在本发明所述方法中，所述步骤(1)中消旋体棉酚复合物粗品的提取的具体操作如下：首先将棉籽粕烘干至恒重，加入研磨机中研碎，过80目筛，得到研磨粉末；将研磨粉末搅拌溶解在一定体积的膨胀溶剂中，加压至3-8MPa形成膨胀溶剂体系，搅拌浸提，将压力降低至常压，滤除不溶物；将不溶物置于两倍于膨胀溶剂体积的丙酮中，在超声波-微波协同提取仪中进行二次提取，提取结束后，合并两次提取液，并浓缩至总体积的1/3，然后加入酸的水溶液适量，继续搅拌，析出固体，离心分离得到消旋体棉酚复合物，折算棉酚提取率；
其中，所述的膨胀溶剂的体积组成为10-20%丙酮和80-90%CO2，膨胀溶剂的体积与研磨粉末质量的用量比例为1.2-2.5ml/g，优选1.5-2ml/g，更优选1.5-1.8ml/g；
研磨粉末搅拌溶解在膨胀溶剂中时的搅拌温度为0-80℃，优选10-60℃，更优选20-30℃；该搅拌溶解的搅拌时间为1-5h，优选1-4h，更优选2-3h；因为出现了两个搅拌。
超声波-微波协同提取的参数设置为：超声波40-60w，微波120-250w，提取时间30-90min；
所述酸的水溶液中酸的质量分数为10-90%，优选为20-50%，更优选为30%，其中的酸为甲酸或乙酸，优选乙酸；
所加入的酸的水溶液的质量与研磨粉末的质量比为1-10:1，优选2-8:1，更优选3-5:1。
折算提取率的计算公式为：折算棉酚提取率=[m(消旋体棉酚复合物)×M(棉酚)]/[M(醋酸棉酚或甲酸棉酚)×m(棉籽粕)]×100%；其中的m是代表质量，M代表分子量。
在本发明所述方法中，所述步骤(2)高速逆流色谱中固定相和流动相的制备具体操作如下：将正丁醇、乙酸乙酯和水混合，震荡摇匀，静置分层，上层作为固定相，下层作为流动相，两相均进行超声脱气处理20-40min，其中正丁醇、乙酸乙酯和水的体积比为1-1.6:3-5:1，优选1.4:4:1。
在本发明所述方法中，所述步骤(3)中左旋棉酚复合物的分离纯化步骤的具体操作过程如下：首先将步骤(2)所得的固定相泵入高速逆流色谱的色谱柱中，使其充满整个色谱柱，然后开启高速逆流色谱，调整主机转速，以一定的流速将步骤(2)所得的流动相泵入色谱柱中，待两相达到动态平衡后，取150mg消旋体棉酚复合物粗品溶解在4-7mL固定相和4-7mL流动相溶剂的混合物即混合溶剂中，得到样品溶液，将样品溶液通过进样阀进样，进样完毕后继续泵入流动相，根据反相HPLC确定左旋棉酚复合物的出峰位置，收集其所在的分离物，脱溶得到左旋棉酚复合物。
其中，为了得到足够量的左旋棉酚复合物以备后续步骤使用，可连续多次进行该分离纯化步骤。
其中，所述主机的转速为500-1000rpm，优选650-850rpm，更优选700rpm；所述流动相流速为1-5mL/min，优选1-3mL/min，更优选2mL/min。
反相HPLC的条件为：Chiralcel OD-RH柱(150mm×4.6mm，5μm)，柱温30℃，流动相:pH为3.5磷酸三乙胺缓冲溶液-乙腈(体积比30:70);流速:1.0mL/min;紫外检测波长:225nm；进样量：10μl。
在本发明所述方法中，所述步骤(4)中左旋棉酚的制备的具体操作过程如下：将步骤(3)中得到的左旋棉酚复合物溶解在乙醚中，再加入质量分数0.1%的NaHSO3溶液，搅拌反应分相，将乙醚相水洗两次，用无水硫酸钠干燥并过滤，减压蒸馏出去乙醚后，再次用乙醚萃取，水洗后脱除乙醚，最后用石油醚重结晶得到左旋棉酚，其中溶解左旋棉酚复合物的乙醚、NaHSO3溶液与左旋棉酚复合物的体积质量比12ml:24-36ml:1g。
本发明的优点是：(1)首次采用高效逆流色谱实现左旋棉酚的分离制备，达到了分离效率高、纯度高等诸多优点；(2)采用膨胀溶剂和超声-微波的组合式提取工艺，实现了提取率的最大化，高效地利用了原材料、节约了成本；(3)采用先分离后NaHSO3溶液水解的方法，有效地避免了产物中油脂、色素的存在，提高了产品的纯度，并且可直接获得光学活性物质。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
实施例1
(1)首先将棉籽粕烘干至恒重，加入研磨机中研碎，过80目筛，得到研磨粉末；将30g研磨粉末搅拌溶解在45ml膨胀溶剂中，加压至5MPa形成膨胀溶剂体系，于30℃下搅拌浸提2.5h，将压力降低至常压，滤除不溶物；将不溶物置于90ml丙酮中，在超声波-微波协同提取仪中进行二次提取，提取结束后，合并两次提取液，并浓缩至总体积的1/3，然后加入质量浓度为30%的乙酸水溶液120g，继续搅拌，析出固体，离心分离得到消旋体棉酚复合物0.5g，折算棉酚提取率为1.50%；
其中，所述的膨胀溶剂的体积组成为15%丙酮和85%CO2；超声波-微波协同提取的参数设置为：超声波50w，微波220w，提取时间60min；
(2)将280ml正丁醇、800ml乙酸乙酯和200ml水混合，震荡摇匀，静置分层，上层作为固定相，下层作为流动相，两相均进行超声脱气处理30min。
(3)首先将固定相泵入高速逆流色谱的色谱柱中，使其充满整个色谱柱，然后开启高速逆流色谱，调整主机转速为700rpm，以2ml/min的流速将流动相泵入色谱柱中，待两相达到动态平衡后，取150mg消旋体棉酚复合物粗品溶解在4ml固定相和4ml流动相的混合物即混合溶剂中，得到样品溶液，将样品溶液通过进样阀进样，进样完毕后继续泵入流动相，根据反相HPLC确定左旋棉酚复合物的出峰位置，收集其所在的分离物，脱溶得到左旋棉酚复合物71.8mg，可进行多次分离直至得到足够量的左旋棉酚复合物，以备后续步骤使用；
反相HPLC的条件为：Chiralcel OD-RH柱(150mm×4.6mm，5μm)，柱温30℃，流动相:pH为3.5磷酸三乙胺缓冲溶液-乙腈(体积比30:70);流速:1.0mL/min;紫外检测波长:225nm；进样量：10μl。
(4)将步骤(3)中得到的2g左旋棉酚复合物溶解在24ml乙醚中，再加入48ml质量分数0.1%的NaHSO3溶液，搅拌反应分相，将乙醚相水洗两次，用无水硫酸钠干燥并过滤，减压蒸馏出去乙醚后，再次用乙醚萃取，水洗后脱除乙醚，最后用石油醚重结晶得到左旋棉酚59.2mg，水解收率92%，e.e值为99.6%。
实施例2
(1)首先将棉籽粕烘干至恒重，加入研磨机中研碎，过80目筛，得到研磨粉末；将25g研磨粉末搅拌溶解在45ml膨胀溶剂中，加压至3MPa形成膨胀溶剂体系，于25℃下搅拌浸提2h，将压力降低至常压，滤除不溶物；将不溶物置于90ml丙酮中，在超声波-微波协同提取仪中进行二次提取，提取结束后，合并两次提取液，并浓缩至总体积的1/3，然后加入40%的乙酸水溶液75g，继续搅拌，析出固体，离心分离得到消旋体棉酚复合物0.4g，折算棉酚提取率为1.45%；
其中，所述的膨胀溶剂的体积组成为10%丙酮和90%CO2；超声波-微波协同提取的参数设置为：超声波60w，微波180w，提取时间90min；
(2)将280ml正丁醇、800ml乙酸乙酯和200ml水混合，震荡摇匀，静置分层，上层作为固定相，下层作为流动相，两相均进行超声脱气处理35min。
(3)首先将固定相泵入高速逆流色谱的色谱柱中，使其充满整个色谱柱，然后开启高速逆流色谱，调整主机转速为650rpm，以1ml/min的流速将流动相泵入色谱柱中，待两相达到动态平衡后，取150mg消旋体棉酚复合物粗品溶解在5.5ml固定相和5.5ml流动相的混合物即混合溶剂中，得到样品溶液，将样品溶液通过进样阀进样，进样完毕后继续泵入流动相，根据反相HPLC确定左旋棉酚复合物的出峰位置，收集其所在的分离物，脱溶得到左旋棉酚复合物71.2mg，可进行多次分离直至得到足够量的左旋棉酚复合物，以备后续步骤使用；
(4)将步骤(3)中得到的1.5g左旋棉酚复合物溶解在18ml乙醚中，再加入54ml质量分数0.1%的NaHSO3溶液，搅拌反应分相，将乙醚相水洗两次，用无水硫酸钠干燥并过滤，减压蒸馏出去乙醚后，再次用乙醚萃取，水洗后脱除乙醚，最后用石油醚重结晶得到左旋棉酚58.1mg，水解收率91%，e.e值为99.4%。
实施例3
(1)首先将棉籽粕烘干至恒重，加入研磨机中研碎，过80目筛，得到研磨粉末；将30g研磨粉末搅拌溶解在48ml膨胀溶剂中，加压至8MPa形成膨胀溶剂体系，于20℃下搅拌浸提3h，将压力降低至常压，滤除不溶物；将不溶物置于96ml丙酮中，在超声波-微波协同提取仪中进行二次提取，提取结束后，合并两次提取液，并浓缩至总体积的1/3，然后加入50%的乙酸水溶液150g，继续搅拌，析出固体，离心分离得到消旋体棉酚复合物0.51g，折算棉酚提取率为1.52%；
其中，所述的膨胀溶剂的体积组成为20%丙酮和80%CO2；超声波-微波协同提取的参数设置为：超声波40w，微波120w，提取时间30min；
(2)将280ml正丁醇、800ml乙酸乙酯和200ml水混合，震荡摇匀，静置分层，上层作为固定相，下层作为流动相，两相均进行超声脱气处理30min。
(3)首先将固定相泵入高速逆流色谱的色谱柱中，使其充满整个色谱柱，然后开启高速逆流色谱，调整主机转速为850rpm，以3ml/min的流速将流动相泵入色谱柱中，待两相达到动态平衡后，取150mg消旋体棉酚复合物粗品溶解在7ml固定相和7ml流动相的混合物即混合溶剂中，得到样品溶液，将样品溶液通过进样阀进样，进样完毕后继续泵入流动相，根据反相HPLC确定左旋棉酚复合物的出峰位置，收集其所在的分离物，脱溶得到左旋棉酚复合物71.6mg，可进行多次分离直至得到足够量的左旋棉酚复合物，以备后续步骤使用；
(4)将步骤(3)中得到的1g左旋棉酚复合物溶解在12ml乙醚中，再加入30ml质量分数0.1%的NaHSO3溶液，搅拌反应分相，将乙醚相水洗两次，用无水硫酸钠干燥并过滤，减压蒸馏出去乙醚后，再次用乙醚萃取，水洗后脱除乙醚，最后用石油醚重结晶得到左旋棉酚
58.7mg，水解收率91.5%，e.e值为99.3%。
上述实施例1-3的分离产物左旋棉酚均通过高效液相色谱法与标准物的出峰位置作相应比对确认为相同物质，其具体物性测试参数为：
熔点:181℃-183℃。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ(ppm)：11.11(s,2H),7.73(s,2H)，6.42(s,2H),5.89(s,2H),3.82(m,2H),2.19(s,6H),1.50(d,J=6.9Hz,12H)。
MS m/z：518.17(M+1,100)。
对比例1-3
除将步骤(1)中的膨胀溶剂替换为总体积相等的如下体积比的丙酮-水膨胀溶剂外，分别以实施例1的相同方式实施了对比例1-3。具体结果见下表1。
表1.
Figure BDA0000403325000000081
对比例4-6
除省略步骤(1)中超声-微波协同提取操作外，分别以实施例1的相同方式实施了对比例4-6。具体结果见下表1。
表2.
Figure BDA0000403325000000082
Figure BDA0000403325000000091
对比例7-12
除变换步骤(2)中正丁醇、乙酸乙酯和水的体积比(即三者的总体积不变，仅改变体积比)来制备固定相和流动相外，分别以实施例1的相同方式实施了对比例7-12。具体结果见下表3。
表3.
Figure BDA0000403325000000092
结果分析
(1)由表1和表2可知，采用膨胀溶剂、超声-微波协同提取的二次组合提取方式，有效地提高了消旋体棉酚复合物的提取率，改善了物料的利用率，节约了原材料成本。
(2)由表3可知，溶剂配比对于固定相、流动相的制备至关重要，尤其影响目标物质的分离效果，本发明人经过大量的实验研究经过大量的创造性实验摸索出了用于配制固定相、流动相的溶剂组分(正丁醇、乙酸乙酯和水)，其中，采用体积比为1-1.6:3-5:1的正丁醇、乙酸乙酯和水操作可实现左旋棉酚分离纯化达到>95%的ee值，特别是采用1.4:4:1的比例可实现>99%的ee值，取得了显著的技术效果。
(3)由实施例1-3可知，采用本发明特定的提取工艺和高效逆流色谱的分离技术科成功实现左旋棉酚的分离制备，并且取得了提取效率高、纯度高、成本低、无污染等多种有益效果。
综合上述，本发明采用二次提取工艺和高效逆流色谱的分离技术有效的提取并分离了天然活性物质左旋棉酚(其对细胞的敏感性约是右旋棉酚的5倍多)，并实现了收率高、纯度高、成本低和无污染的技术效果。正是由于合适工艺的组合以及特定工艺参数的合适选择而起到了协同增效的作用，取得了意想不到的优异功效，具备广泛的工业化前景和市场价值，更有助于药物活性的左旋棉酚在医药领域的推广应用。
应当理解，这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用高速逆流色谱来分离制备左旋棉酚的方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
(1)消旋体棉酚复合物粗品的制备，其中，所述棉酚复合物是指醋酸棉酚或甲酸棉酚；
(2)高速逆流色谱固定相和流动相的制备；
(3)左旋棉酚复合物的分离纯化步骤；
(4)左旋棉酚的制备。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中消旋体棉酚复合物粗品的提取的具体操作如下：首先将棉籽粕烘干至恒重，加入研磨机中研碎，过80目筛，得到研磨粉末；将研磨粉末搅拌溶解在一定体积的膨胀溶剂中，加压至3-8MPa形成膨胀溶剂体系，搅拌浸提，将压力降低至常压，滤除不溶物；将不溶物置于两倍于膨胀溶剂体积的丙酮中，在超声波-微波协同提取仪中进行二次提取，提取结束后，合并两次提取液，并浓缩至总体积的1/3，然后加入酸的水溶液适量，继续搅拌，析出固体，离心分离得到消旋体棉酚复合物；
其中，所述的膨胀溶剂的体积组成为10-20%丙酮和90-80%CO2，膨胀溶剂的体积与研磨粉末质量的用量比例为1.2-2.5ml/g；搅拌时温度为0-80℃；超声波-微波协同提取的参数设置为：超声波40-60w，微波120-250w，提取时间30-90min；所述酸的水溶液为质量分数10-90%的水溶液，其中的酸为甲酸或乙酸；加入酸的水溶液的质量与研磨粉末的质量比为1-10:1。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述膨胀溶剂的体积与研磨粉末质量的用量比例优选为1.5-1.8ml/g；搅拌时温度优选为20-30℃；搅拌时间优选为1-4h；所述酸的水溶液为质量分数优选为20-50%的水溶液，其中的酸优选为乙酸；加入酸的水溶液的质量与研磨粉末的质量比优选为2-8：1。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中固定相和流动相的制备的具体操作如下：将正丁醇、乙酸乙酯和水混合，震荡摇匀，静置分层，上层作为固定相，下层作为流动相，两相均进行超声脱气处理20-40min，所述正丁醇、乙酸乙酯和水的体积比为1-1.6:3-5:1。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中左旋棉酚复合物的分离纯化步骤的具体操作过程如下：首先将固定相泵入高速逆流色谱的色谱柱中，使其充满整个色谱柱，然后开启高速逆流色谱，调整主机转速，以一定的流速将流动相泵入色谱柱中，待两相达到动态平衡后，取150mg消旋体棉酚复合物粗品溶解在4-7mL固定相和4-7mL流动相溶剂的混合物即混合溶剂中，得到样品溶液，将样品溶液通过进样阀进样，进样完毕后继续泵入流动相，根据反相HPLC确定左旋棉酚复合物的出峰位置，收集其所在的分离物，脱溶得到左旋棉酚复合物；
其中，所述主机的转速为500-1000rpm；所述流动相流速为1-5mL/min。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述主机的转速优选为650-850rpm；所述流动相流速优选为1-3mL/min。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：反相HPLC的条件为：色谱柱为150mm×4.6mm，5μm的Chiralcel OD-RH柱，柱温为30℃，流动相是体积比为30:70的pH3.5磷酸三乙胺缓冲溶液:乙腈;流速为1.0mL/min;紫外检测波长为225nm；进样量为10μl。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中左旋棉酚的制备的具体操作过程如下：将步骤(3)中得到的左旋棉酚复合物溶解在乙醚中，再加入质量分数0.1%的NaHSO3溶液，搅拌反应分相，将乙醚相水洗两次，用无水硫酸钠干燥并过滤，减压蒸馏出去乙醚后，再次用乙醚萃取，水洗后脱除乙醚，最后用石油醚重结晶得到左旋棉酚。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述乙醚、NaHSO3溶液与左旋棉酚复合物的体积质量比12ml:24-36ml:1g。
CN201310520261.1A 2013-10-28 2013-10-28 一种采用高速逆流色谱法分离制备左旋棉酚的方法 Expired - Fee Related CN103524314B (zh)

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