CN103520445A - 开口箭在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了开口箭在制备抗肿瘤药物中的应用，属于医药技术领域。通过MTT法和流式细胞术发现开口箭能阻滞S-180细胞生长周期，抑制其增殖，诱导肿瘤细胞凋亡。通过EMSA和实时荧光定量PCR发现开口箭能减少NF-κB的表达和抑制NF-κB的活性，对S-180细胞具有抑制作用；开口箭能减少S-180细胞接种的荷瘤小鼠模型瘤体组织内NF-κB的表达，同时还能抑制荷瘤小鼠模型瘤体组织内NF-κB的活性，具有抑制肿瘤生长的作用。通过急性毒性试验和长期毒性试验证实开口箭对昆明种小鼠肝肾功能和血糖值无影响，对昆明小鼠的脏器无损伤。表明开口箭具有安全、有效的抗肿瘤作用，可用于制备抗肿瘤药物。

Description

开口箭在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及开口箭在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

肿瘤、心脏病以及脑血管疾病是21世纪危害人类健康和生命的三大疾病。恶性肿瘤发病率和死亡率呈逐年递增趋势，关于肿瘤的防治也是近年来国内外研究的重要课题。通过长期大量的临床实践得知，传统的中草药在抗恶性肿瘤方面具有其独特疗效，通常作用于肿瘤发生、发展的多个环节，具有多靶点、多环节、多效应的特点，能较好的改善肿瘤患者的临床症状、体征，减轻放化疗后不良反应，提高患者免疫力和延长寿命等。在临床治疗中，放化疗以及手术治疗方式已经是肿瘤治疗的基本手段，但存在不良反应大、长期应用易产生耐药性等问题，中药治疗恶性肿瘤可以减轻患者不良反应，提高患者的免疫力。近年来，国内外的研究机构寄希望于价格低廉、安全性高、不良反应少等的中药能应用在抗肿瘤方面。

开口箭录属于百合科铃兰簇植物，主产三峡库区和神农架林区，长期以来为少数民族民间用药。取其根茎入药，味苦，辛，性寒，有毒，具有清热解毒，祛风除湿，散瘀止痛等功效，主要治疗咽喉肿痛、白喉，胃痛，风湿痹痛，跌打损伤，痈肿疮毒，毒蛇咬伤等。

NF-κB是在成熟B细胞中被发现的一种核蛋白，因其与B细胞免疫球蛋白上的κB轻链基因增强子κB序列特异结合而得名。NF-κB在炎症、肿瘤、哮喘、胃肠道、系统性红斑狼疮等疾病中有广泛的表达，成为为近20年来研究的重要靶点。NF-κB蛋白家族包括Rel（cRel）、p65（RelA,NF-κB3）、RelB和p50（NF-κB1）、p52（NF-κB2）5个亚单位；其中p65、cRel和RelB分别含有N端Rel同源区（RHD）和C端的反式激活结构域（TD），在RHD的C末端有一个核定位区域（NLS），负责与DNA结合、二聚体化和核易位，而TD则与转录活化相关。p50和p52只有RHD，缺乏TD，因此二者不能激活基因转录，只是作为一种抑制分子而存在，在细胞内二者通常以各自前体p105和p100存在。两个亚基形成的二聚体与靶基因上-κB位点结合调节基因转录，不同的NF-κB二聚体在选择结合序列时稍有差异，这是NF-κB通过不同的二聚体的形式对不同基因的表达进行调节的一种方式，最常见的NF-κB二聚体是p65与p50组成的异二聚体。在静息状态下，NF-κB与其抑制物（IκB）形成复合体，以无活性形式存在于胞浆中，当细胞受刺激后，NF-κB二聚体从细胞质进入细胞核，导致相关基因的转录。NF-κB主要激活途径因其家族参与主导成员不同分为两条：经典途径和旁路路径。经典途径主要与RelA-p50有关，在肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素1（IL-1）、病毒、微生物等刺激后激活IκB激酶复合体（IKK），使其活化将IκB特定丝氨酸残基磷酸化，而导致NF-κB暴露核定位位点，游离的NF-κB迅速移位至细胞核，与特异性κB序列结合而诱导一系列相关基因转录；旁路途径主要与RelB-p105/100有关，在各种因子的刺激下激活IKK，导致p100磷酸化后被蛋白酶降解，最终引起RelB-p50/p52核转移并与DNA结合。

活化的NF-κB进入到细胞核后，与其靶基因中的启动子或增强子共有的κB序列“GGGRNNYYCC”结合从而诱导下游基因的转录。NF-κB调控的下游基因包括TNF、IL-1、COX2、MMP9等促进肿瘤发生的基因，VEGF、TNF等与肿瘤血管生成有关的基因，ICAM-1、VCAM-1、ELAM-1等与肿瘤转移有关的基因，bcl-2、cIAP、TRAF等与肿瘤抗调亡有关的基因。许多证据表明，NF-κB与肿瘤的发生发展有密切的关系。NF-κB的激活不仅存在于造血系统来源的肿瘤细胞中，也存在于实体瘤来源的细胞中，然而在正常的细胞中却很少发现有NF-κB的激活。NF-κB的激活既存在于肿瘤细胞中，也存在于一些肿瘤组织中如多发性骨髓瘤、急性髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、前列腺癌和乳腺癌。更重要的是，在这些肿瘤标本中抑制NF-κB的活化会抑制肿瘤细胞的增殖，引起细胞周期的停滞并诱导凋亡，表明NF-κB在肿瘤细胞的增殖存活中起着重要的作用。

发明内容

本发明的目的在于开发传统民间用药开口箭新的用途，提供开口箭在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的目的还在于提供一种安全、有效的含开口箭抗肿瘤药物。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

MTT法检测开口箭对S-180细胞增殖的影响发现开口箭能够抑制S-180细胞增殖。流式细胞术检测S-180细胞DNA含量及其周期发现开口箭阻滞S-180细胞生长周期，导致细胞形态的变化，诱导肿瘤细胞凋亡。通过EMSA和实时荧光定量PCR发现开口箭能减少NF-κB的表达和抑制NF-κB的活性，对S-180细胞具有抑制作用，且在一定浓度和时间范围内具有量效；建立荷瘤小鼠模型，发现开口箭能减少S-180细胞接种的荷瘤小鼠模型瘤体组织内NF-κB的表达，同时还能抑制荷瘤小鼠模型瘤体组织内NF-κB的活性，具有抑制肿瘤生长的作用。通过EMSA和实时荧光定量PCR发现开口箭能减少NF-κB的表达和抑制NF-κB的活性，对S-180细胞具有抑制作用，且在一定浓度和时间范围内具有量效。开口箭短时间大剂量服用对昆明小鼠肝肾功能和血糖值无影响，对昆明小鼠的脏器组织无病理性损伤。开口箭长期服用对昆明小鼠的肝肾功能和空腹血糖值亦无影响，对昆明小鼠的脏器组织无病理性损伤。通过急性毒性试验和长期毒性试验证实开口箭对昆明种小鼠肝肾功能和血糖值无影响，对昆明小鼠的脏器无损伤。

上述结果表明开口箭通过抑制NF-κB的活性，降低NF-κB在瘤体组织的表达，抑制肿瘤细胞的增殖，具有安全、有效的抗肿瘤作用，可用于制备抗肿瘤药物。

一种抗肿瘤药物，包含开口箭或开口箭提取物。

所述的开口箭提取物的制备优选包括如下步骤：将开口箭或开口箭饮片用水清洗后浸泡，再用蒸馏水进行熬制，将熬制的溶液煎熬浓缩，待浓缩液冷却后过滤即得到开口箭提取物。

本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：本发明首次发现开口箭具有抑制肿瘤细胞的功能，并揭示了其抑制肿瘤细胞增殖的靶向机制（开口箭通过抑制NF-κB的活性，降低NF-κB在瘤体组织的表达，抑制肿瘤细胞的增殖）。由于开口箭对实验动物无毒副作用，可开发成一种安全、有效的抗肿瘤药物。

附图说明

图1是开口箭对S-180细胞抑制增殖的时效图。

图2是电镜下各组实体瘤超微结构图；其中，A：生理盐水组（×5000）；B：CTX组（×4000；C：高剂量组（2g/mg，×3000）；D：中剂量组（1g/mg，×4000）；E：低剂量组（0.5g/mg，×4000）。

图3是EMSA检测S-180细胞NF-κB活性结果图；其中，A：突变探针反应组，B：探针反应组，C：空白对照组，D：高剂量组，E：中剂量组，F：低剂量组，G：阴性对照组，H：环磷酰胺组。

图4是EMSA检测S-180细胞接种的荷瘤小鼠肿瘤组织中NF-κB活性结果图；其中，A：突变探针反应组，B：探针反应组，C：空白对照组，D：高剂量组，E：中剂量组，F：低剂量组，G：阴性对照组，H：环磷酰胺组。

图5是S-180细胞NF-κB扩增倍数结果图；其中，A：5-氟尿嘧啶组，B：高剂量组，C：中剂量组，D：低剂量组。

图6是S-180细胞接种的荷瘤小鼠肿瘤组织中NF-κB扩增倍数结果图；其中，A：环磷酰胺组，B：高剂量组，C：中剂量组，D：低剂量组。

具体实施方式

下面结合实施例和附图进一步阐述本发明，但不应理解为对本发明保护范围的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1开口箭药物制备

称取开口箭饮片（神农架产区，涡阳县源和堂中药饮片有限责任公司）0.5kg，首先用自来水将开口箭饮片清洗两遍，再用自来水将其浸泡30min，更换蒸馏水1.5L熬制40～50分钟，将得到的溶液倒入事先准备的干净烧杯中，逐渐放置至冷却，再次往开口箭饮片中加入750mL蒸馏水熬制40～50分钟，然后将溶液倒入同一个烧杯中冷却，倒掉药渣，将两次所收集的开口箭药物的溶液放入药罐中煎熬浓缩至250mL，分煎两次得浓度为2.0g/mL溶液，冷却后用无菌纱布过滤两次，分瓶置4℃保存，使用时可用蒸馏水将其稀释到0.04g/mL和1.0g/mL，在要进行体内灌胃时提前30min移至室温。

实施例2MTT法检测开口箭对S-180细胞增殖的影响

取对数生长期的S-180细胞用台盼蓝染色法测定细胞活力：将细胞悬液作适当稀释，与0.4%的台盼蓝溶液以9:1（体积比）混匀，取少许溶液滴入清洁计数板，分别计数活细胞和死细胞数，根据活细胞拒染呈无色透明状，死细胞被染成明显蓝色计算细胞活力：活细胞率（%）=活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%。

选取活细胞率＞96%的S-180细胞用细胞计数板进行计数，根据细胞数/mL=四大格细胞总数/4×10000计数细胞数，根据该细胞生长特性将细胞稀释成4×10⁴/mL以100μL/孔细胞悬液转板至96孔板中，周围36孔用蒸馏水填充以防止蒸发现象影响测定结果。再将开口箭分别稀释至0、20、40、80、160、320μg/mL的浓度梯度以100μL/孔加入到每孔中混匀，每组设5个复孔，将培养板置于37℃、5%CO2培养箱中培养，分别于24h、48h、72h取出一块培养板进行测定。测定时试验孔以20μL/孔加入5mg/mLMTT溶液，置37℃、5%CO2培养箱中孵育4h，再以150μL/孔加入DMSO溶结晶，并置摇床80rpm、10min加速结晶的溶解，最后用酶标仪设定波长为570nm测量各孔的吸光值，按照抑瘤率=（对照组值－治疗组值）/对照组值×100%（对照组即5-氟尿嘧啶组，治疗组即开口箭组），计算各组的抑瘤率和IC50值，并进行统计学分析，结果如图1和表1所示。

活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能将淡黄色的MTT还原为蓝紫色的结晶甲臜，该结晶的量与活细胞数成正相关。图1显示：从干预时间上看，24h、48h、72h均有不同程度的抑制S-180细胞增殖作用，48h各个浓度的OD值均低于24h，72h的OD值高于48h，与24h比较无明显规律性，说明开口箭抑制S-180细胞增殖的最佳时间是给药后48h。

根据检测OD值统计分析显示，当药物浓度在0-320μg/mL之间，随着药物浓度的增加OD值越小，抑瘤率越大，说明开口箭在0-320μg/mL之间存在量效关系；各浓度OD值有显著性差异（P=0.000，P<0.01），给药时间与浓度梯度无明显统计学意义（P=1.000，P>0.05），如表1所示。

表1开口箭对S-180细胞抑制增殖表

24h：^*P<0.05，与阴性对照组比较，48h：^*P<0.05与阴性对照组比较，阴性对照组就是不加药物组；n表示重复。

实施例3荷瘤小鼠模型建立

将小鼠适应性的喂养4天，小鼠生长状态良好者进行下一步试验；取对数生长期的S-180细胞，用血细胞计数板进行计数，用培养基稀释至2×10⁵/mL细胞悬液，根据预实验结果（KM小鼠和BALB/c-nu小鼠腹腔注射细胞悬液3、5、7、10天均无腹水长出）选择直接皮内接种方式建立肿瘤模型。试验前准备同上，接种部位为左后腋下和右后背部；接种时先用75%酒精局部常规消毒，左手拇指和食指轻轻按住皮肤使之绷紧，在两指之间，用有细胞悬液的注射器针头进入皮肤浅层，再向上挑起并稍刺入，将药液注入皮内，直至注射部位皮肤出现一白色小皮丘为至，注射量为每个部位0.1mL；接种后每天观察小鼠饮食、饮水量、精神状态以及肿瘤生长情况。S-180细胞接种BALB/c-nu小鼠后于第5d可见实体瘤突起，于接种第10d剥取实体瘤，瘤体组织生长状态良好，选择S-180细胞接种BALB/c-nu小鼠作为荷瘤小鼠模型。

实施例4实验动物及体外实验分组

实验动物分组

将接种S-180细胞10天的肿瘤生长良好且精神状态佳的BALB/c-nu小鼠进行随机分组：A组：阴性对照组（即生理盐水组），在普食的基础上给予生理盐水灌胃；B组：开口箭低剂量组，在普食的基础上给予开口箭0.5g/kg；C组：开口箭中剂量组，在普食的基础上给予开口箭1g/kg；D组：开口箭高剂量组，在普食的基础上给予开口箭2g/kg；以上各组均为灌胃给药；E组：阳性对照组（即环磷酰胺组），在普食的基础上按体重给予环磷酰胺0.02g/kg腹腔注射。每天一次，干预2周后剥取肿瘤组织，行相关组织和生化检测等。

体外细胞实验分组

取对数生长期的S-180细胞进行体外实验，根据处理药物不同分为：阴性对照组（即生理盐水组）；开口箭低剂量组：25μg/mL；开口箭中剂量组：50μg/mL；开口箭高剂量组：100μg/mL；阳性对照组（即5-氟尿嘧啶组）：10μg/mL。将对数生长期的S-180细胞计数后转6孔板，每孔加入6mL细胞悬液，放置培养箱24h后加入相应各组药物处理，继续放置培养箱培养48h后分别行流式细胞术、EMSA和实时荧光定量PCR检测。

实施例5电镜切片制作

在无菌条件下取实施例4各组小鼠肿瘤组织，去胞膜，将其切成5mm方形，用2.5%戊二醛固定液先固定2h后，用0.1M磷酸缓冲液（pH7.2-7.4）漂洗三次，然后用1%锇酸后固定90min，pH7.2-7.4，固定完毕，用0.1M磷酸缓冲液漂洗20min后，再分别用50%、70%、80%乙醇各一次，每次各15min，100%乙醇两次，每次15min进行梯度脱水，然后环氧树脂812包埋，最后用枸橼酸铅进行切片染色，电镜观察（图2）。

凋亡是细胞受基因调控的一种自然死亡过程，是多细胞生物生命活动中不可缺少的过程。从形态学上认定细胞变化是最直接判定细胞凋亡的方法。从图2可以看出：电镜下可见环磷酰胺组实体瘤细胞体积变小，细胞质浓缩，细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象的空泡结构，甚者有细胞核的染色质高度凝聚、边缘化，可见凋亡小体；开口箭各组细胞体积无明显缩小，细胞核染色质无明显凝聚边缘化，高中低随着剂量的增加，细胞变化与环磷酰胺组越接近。

实施例6流式细胞术检测S-180细胞DNA含量及其周期

收集体外培养的S-180细胞的悬浮细胞于5mL离心管中，1200rpm离心5min；倒掉上清液，每管加入1mL4℃预冷的PBS（0.01M，pH7.4）重悬细胞；转移至1.5mL的离心管，以1200rpm离心5min沉淀细胞；倒掉上清液，并轻弹管底，每管加入1mL4℃预冷的75%乙醇，轻轻吹打混匀，4℃固定过夜；以1500rpm离心5min沉淀细胞，倒掉上清液，并用1mL4℃预冷的PBS，1500rpm离心5min清洗细胞两次；轻弹管底分散细胞，每管加入0.5mL的100mg/L的碘化丙啶染色液（加入前约5min按6个样本的量配制），轻轻吹打细胞悬液，37℃孵育30min后；用200目筛网过滤，并转移至流式管后上机检测，结果如表2所示。

表2开口箭对S-180细胞周期的影响

碘化丙啶染液能够透过凋亡中晚期的细胞和死细胞膜，利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度使细胞核红染，结合被细胞的DNA含量分析，可确定凋亡的细胞所处的细胞周期。开口箭对S-180细胞生长周期的阻滞在S期，而且随着浓度的增加阻滞在S的比例越大，说明开口箭可阻滞细胞生长，诱发S-180细胞的凋亡。

实施例7EMSA检测NF-κB的活性

提取S-180细胞和荷瘤小鼠肿瘤组织的细胞核蛋白，使用碧云天生物技术研究所的化学发光法EMSA试剂盒检测S-180细胞和S-180细胞接种的荷瘤小鼠肿瘤组织中的NF-κB活性。其中，结合反应体系如下，探针使用生物素标记：

表3空白对照反应

表5探针冷竞争反应

表6突变探针的冷竞争反应

注：NF-κB突变探针序列：

5’-AGT TGA GGC GAC TTT CCC AGG C-3’，

3’-TCA ACT CCG CTG AAA GGG TCC G-5’；

NF-κB探针序列：

5′-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3′，

3′-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-5′；

具体步骤参照化学发光法EMSA试剂盒检说明书，结果见图3和4。

突变探针冷竞争反应中，正常的标记探针和NF-κB的结合的条带会被抑制，图片上出现很淡几乎没有的结合条带；而在探针冷竞争反应中，正常的标记探针和NF-κB结合不会被明显抑制，出现较宽的条带；未加蛋白的空白基本无结合条带，这反应该探针结合的一定的特异性。开口箭高中低剂量梯度显示出结合条带逐步变暗变宽的趋势，与阴性对照相比，显示出一定的抑制作用，与环磷酰胺组比较，低剂量组结合条带无明显变化，高中剂量组条带明显变淡。由此说明开口箭对S-180细胞及荷瘤小鼠肿瘤组织NF-κB的活性有抑制作用，并有一定的浓度依赖性。

实施例8实时荧光定量PCR检测各组NF-κB的表达

提取S-180细胞和S-180细胞接种过的荷瘤小鼠肿瘤组织的总RNA，进行反转录，再通过实时荧光定量PCR检测NF-κB的表达情况。反转录和实时荧光定量PCR使用的是TOYOBO的First Strand cDNA Synthesis Kit和THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix，具体过程如下：

取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液，加入1μL oligo(dT)15，用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μL；PCR仪上70℃保温5min，迅速置冰上冷却；依次加入4μL5×反转录酶缓冲液，2μL10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μL反转录酶，用枪抽吸混匀；PCR仪上42℃保温30min，结束后80℃保温5min灭活反转录酶。

取0.2mL PCR管，配制如下反应体系：2×qPCR Mix12.5μL，2.5μM基因（NF-κB）引物2.0μL，反转录产物2.0μL，ddH₂O8.5μL；每个反转录产物配制3管；NF-κB上下游引物分别为：CTGATGTGCATCGGCAAGTGG和CAGAAGTTGAGTTTCGGGTAGGC。

取0.2mL PCR管，配制如下反应体系：2×qPCR Mix12.5μL，2.5μM内标（β-action）引物2.0μL，反转录产物2.0μL，ddH₂O8.5μL；每个反转录产物配制3管。β-action上下游引物分别为：CTGAGAGGGAAATCGTGCGT和CCACAGGATTCCATACCCAAGA。

按如下程序进行PCR扩增：预变性95℃1min；循环（40次）95℃15s→58℃20s→72℃20s；末段延伸72℃5min；溶解曲线72℃→95℃。

利用SYBR Green I染料法的荧光信号变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量，通过CT值对起始模板进行定量分析，以β-action内参基因，利用CT值与DNA拷贝数的对数成负相关原理，对NF-κB表达量进行相对定量。采用2–△△CT法即：△CT=CT（目的基因平均值）–CT（对应内参基因平均值），△△CT=△CT（实验组）–△CT（对照组），最终扩增倍数=2–△△CT。β-action内参基因与目的基因融解曲线均为单一峰。说明无引物二聚体及非特异性扩增产生，引物设计良好，特异性强；经β-action内参基因矫正后开口箭高中低组NF-κB扩增倍数依次递增，5-氟尿嘧啶组或环磷酰胺组扩增倍数与低剂量组相当（图5和图6）。

实施例9急性毒性试验

选取6～8周龄的雄性昆明小鼠24只，体重20±2g；给予禁食、不禁水12～16小时。将其随机分为4组，每组6只。开口箭设40mg/mL（低剂量）、1000mg/mL（中剂量）、2000mg/mL（高剂量）3个剂量组，分别相当于人体推荐用量的1倍、25倍、50倍；另外再设置1个蒸馏水对照组。24h内各组昆明小鼠灌胃2次，每只昆明小鼠1.0mL，间隔时间6小时，然后按照常规饲养。观察小鼠外观、行为活动、呼吸、排便、分泌物、死亡等情况记录并称体重连续7天。因为受开口箭药物的浓度和体积的影响，一次灌胃给药以最大浓度、最大容量均未测出半数致死量（LD50），7天后，所有小鼠称重，处死，解剖，病理检查重要脏器（心、肝、脾、肾），做HE染色观察内脏组织的病理变化。

在以开口箭24h内对昆明小鼠连续灌胃给药2次后，未闻及异常叫声，并且无惊厥、震颤、运动失调、流泪、流鼻涕、流涎、呼吸困难、肠胀气、便秘、腹泻等现象发生。常规饲养七天后所有灌胃给药的昆明小鼠均未出现死亡情况。开口箭灌胃给药组小鼠活动自如、皮毛光滑，没有异常的分泌活动。开口箭灌胃给药组昆明小鼠和生理盐水对照组饮食、饮水无差异。由于存在开口箭药物浓度和体积的影响，一次性给于最大容量、最大浓度均未测出半数致死量（LD50），灌胃给药的最大计量为100g/kg。开口箭短期服用对昆明小鼠的肝肾功能和空腹血糖值无影响。昆明小鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏组织病理切片显示开口箭短时间大剂量服用对昆明小鼠的脏器组织无病理性损伤。

开口箭对昆明小鼠的急性毒性试验体重统计结果如表7所示。

表7开口箭对昆明小鼠的急性毒性试验体重统计（﹡代表与正常对照组比P＞0.05）

实施例10长期毒性试验

选取6～8周龄的雄性昆明小鼠24只，体重20±2g；给予禁食、不禁水12～16小时。将其随机分为4组，每组6只。40mg/mL（低剂量）、1000mg/mL（中剂量）、2000mg/mL（高剂量）3个剂量组，分别相当于人体推荐用量的1倍、25倍、50倍；另外再设置1个蒸馏水对照组。采用灌胃法，每只昆明小鼠1.0mL，每天1次，连续30d。观察小鼠外观、行为活动、呼吸、排便、分泌物、死亡等情况，每周称1次体重，自由进食和饮水。31d后处死动物解剖，病理检查重要脏器（心、肝、脾、肾），做HE染色观察内脏组织的病理变化，处死小鼠之前需采用心脏采血的方式取昆明小鼠血液做生化指标检测，包括谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆红素（TBIL）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、葡萄糖（GLU）。

在以开口箭连续灌胃30天后，高剂量组、中剂量组、低剂量组灌胃给药的昆明小鼠均未出现死亡的情况，生长发育良好，各组小鼠活动动自如、皮毛光滑，外观正常，行为活动无异常，大小便正常，粘膜无充血，眼、鼻无异常分泌物，饮食正常。在灌胃给药的第一周末、第二周末、第三周末、第四周末分别称重后各组的体重量如表8所示。随着实验时间延长，体重量逐周增加，经统计学分析增长的过程，各灌胃给药组之间无统计学差异；第一周末、第二周末、第三周末、第四周末小鼠的进食量和空白对照组比较未见显著差异。

表8开口箭灌胃小鼠的长期毒性试验体重统计

﹡代表与正常对照组比P＞0.05)

生化指标值见表9，各组的生化指标值均在正常值范围内，并且高剂量组、中剂量组、低剂量组与空白对照组之间ALT、AST、TBIL、BUN、Cr、GLU的值比较无显著性差异。开口箭长期服用对昆明小鼠的肝肾功能和空腹血糖值无影响，对昆明小鼠的脏器组织无病理性损伤。

表9开口箭各组小鼠生化指标值的比较（﹡代表与正常对照组比P＞0.05）

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  武汉大学

 

<120>  开口箭在制备抗肿瘤药物中的应用

 

<130>  1

 

<160>  8    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  22

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  NF-κB 突变探针（正向）

 

<400>  1

agttgaggcg actttcccag gc                                                22

 

 

<210>  2

<211>  23

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  NF-κB 突变探针（反向）

 

<400>  2

gcctgggaaa gtcgcctcaa ct                                                22

 

 

<210>  3

<211>  22

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  NF-κB 探针（正向）

 

<400>  3

agttgagggg actttcccag gc                                                22

 

 

<210>  4

<211>  22

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  NF-κB 探针（反向）

 

<400>  4

gcctgggaaa gtcccctcaa ct                                                22

 

 

<210>  5

<211>  20

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  NF-κB上游引物

 

<400>  5

ctgatgtgca tcggcaagtg g                                                 21

 

 

<210>  6

<211>  22

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  NF-κB下游引物

 

<400>  6

cagaagttga gtttcgggta ggc                                               23

 

 

<210>  7

<211>  21

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  β-action上游引物

 

<400>  7

ctgagaggga aatcgtgcgt                                                   20

 

 

<210>  8

<211>  23

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  β-action下游引物

 

<400>  8

ccacaggatt ccatacccaa ga                                                22

Claims (5)

1.开口箭在制备抗肿瘤药物中的应用。

2.开口箭提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的开口箭提取物的制备包括如下步骤：将开口箭或开口箭饮片用水清洗后浸泡，再用蒸馏水进行熬制，将熬制的溶液煎熬浓缩，待浓缩液冷却后过滤即得到开口箭提取物。

4.一种抗肿瘤药物，其特征在于包含开口箭。

5.一种抗肿瘤药物，其特征在于包含开口箭提取物。

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