CN103505444A - 吉马酮在制备用于治疗肝癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了吉马酮作为治疗肝癌药物的应用，吉马酮对HepG2细胞的细胞毒性实验结果显示，IC₅₀约160μm，流式细胞仪检测吉马酮对肝癌HepG2细胞周期和凋亡的影响实验结果显示，吉马酮能诱导HepG2细胞G2/M周期阻滞并促进细胞凋亡。通过不同浓度吉马酮处理HepG2细胞，检测周期阻滞、凋亡相关蛋白表达情况，结果显示吉马酮通过下调cyclinB1和CDK1蛋白诱导HepG2细胞G2/M周期阻滞，通过p53调控的线粒体凋亡途径促进HepG2细胞凋亡。本发明检测了吉马酮处理后的HepG2细胞ROS产量，结果显示吉马酮可以促进ROS产量的上升，可以造成细胞氧化性损伤。

Description

吉马酮在制备用于治疗肝癌药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，涉及治疗肝癌的药物，具体涉及吉马酮（分子式：C₁₅H₂₂O）在制备治疗肝癌药物中的应用。

背景技术

中药现代化的关键和基础就是对其有效成分的鉴定和有效成分作用机理的研究，因此对中药有效成分中的深入研究具有非常重要的意义，这将有利于中药现代化的进程，加快中药世界化的脚步，更有利于保障人类健康。

莪术挥发性油抗癌的潜力越来越受到关注和确认，但是对于莪术挥发性油中的具体化学成分和其作用机制还处于研究阶段，特别是吉马酮、莪术醇、莪术二酮等莪术挥发性油中的三种主要成分的抗癌效果一直还没有定论。中国专利（申请号为02125900.3）公开了吉马酮用来抗肿瘤细胞，中国专利（申请号为201010604066.3）公开了吉马酮单独使用治疗宫颈癌，未检索到吉马酮单独使用用来治疗肝癌的文献。

肝癌的致病因素至今未研究清楚，目前的研究认为其诱病原因包括物理、化学等各种因素导致肝细胞增殖特别是周期调控失控和肿瘤抑制子失活或表达受阻等，对肝癌这种疾病，目前尚无有效的治疗药物。因此，研究治疗肝癌的有效药物，是医药领域的一项重要课题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种治疗肝癌的药物，以克服现有技术的不足。

本发明提供的治疗肝癌的药物是吉马酮。吉马酮是莪术挥发油中的主要成分，吉马酮化学结构式见图1。本发明对莪术挥发油中的主要成分吉马酮在人肝癌细胞HepG2中进行MTT实验，结果显示，吉马酮对人肝癌细胞（HepG2）生长有明显的抑制作用。经吉马酮处理后的人正常肝细胞L02细胞未有明显的细胞毒性，从而为临床上肝癌疾病的治疗提供了一种安全有效毒副作用小的有效药物。

本发明首先通过MTT法检测了吉马酮对HepG2细胞的细胞毒性，结果显示吉马酮对HepG2细胞的增殖显示浓度依赖性的抑制。然后，通过流式细胞仪检测细胞周期和凋亡并给以药物处理24h后，结果显示药物在80~240μM浓度内，诱导HepG2细胞G2/M周期阻滞并浓度依赖性的促进细胞凋亡。我们还检测了药物对HepG2细胞周期和凋亡相关蛋白表达的影响，结果同样显示吉马酮抑制HepG2细胞周期蛋白cyclinB1和周期蛋白依赖性激酶CDk1的表达，并上调肿瘤抑制蛋白p53的表达，同时也检测了吉马酮对HepG2细胞ROS产量的影响，结果显示给以吉马酮处理后，ROS含量明显上升，说明吉马酮可以造成HepG2细胞氧化性损伤。其次，我们检测了吉马酮对于正常肝细胞的细胞毒性，对应浓度吉马酮处理人正常肝细胞L02细胞后，MTT结果显示吉马酮对L02细胞增殖没有明显影响。综合实验结果分析，确定吉马酮可以作为用于预防和治疗肝癌的药物。吉马酮可以单独制成治疗肝癌药物，也可以以吉马酮为活性成分制备用于预防和治疗肝癌的复方制剂。吉马酮的给药剂量按照细胞实验用量为80~240μM。

本发明提供了吉马酮作为治疗肝癌药物的应用，吉马酮对HepG2细胞的细胞毒性实验结果显示，IC₅₀约160μm，流式细胞仪检测吉马酮对肝癌HepG2细胞周期和凋亡的影响实验结果显示，吉马酮能诱导HepG2细胞G2/M周期阻滞并促进细胞凋亡。通过不同浓度吉马酮处理HepG2细胞，检测周期阻滞、凋亡相关蛋白表达情况，结果显示吉马酮通过下调cyclin B1和CDK1蛋白诱导HepG2细胞G2/M周期阻滞，通过p53调控的线粒体凋亡途径促进HepG2细胞凋亡。本发明检测了吉马酮处理后的HepG2细胞ROS产量，结果显示吉马酮可以促进ROS产量的上升，可以造成细胞氧化性损伤。

本发明对已知化合物吉马酮发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。吉马酮可从药材莪术中提取而得，而且提取技术成熟，提取的吉马酮纯度可达98%以上，能够保证工业化生产。以吉马酮为活性成分的药物可以配置成多种剂型,如：口服胶囊剂、片剂、软胶囊剂、微囊剂等。

附图说明

图1为吉马酮化学结构式。

图2为吉马酮对HepG2细胞的增殖抑制检测示意图，不同浓度药物加入到HepG2细胞中培养24h后，采用MTT法检测药物对细胞生长的影响结果图；

图3为吉马酮处理对HepG2细胞形态的改变和细胞核的影响。A、C图为对照组；B图为160μM吉马酮处理后，Hochest33258染色液染色后的荧光照片；D图为160μM吉马酮处理后倒置显微镜下HepG2细胞的形态。

图4为一种检测药物对HepG2细胞凋亡的影响。不同浓度吉马酮（A:对照,B:80μM,C:160μM,D:200μM）处理24h后，Annexin-V和PI两种染料双染HepG2细胞，流式细胞仪分析处于正常（左下）、早凋（右下）、晚凋（右上）、坏死（左上）期的细胞比例。

图5为吉马酮对HepG2细胞周期的影响结果分析。（A图为对照，B:80μM,C:160μM,D:200μM）

图6为检测药物对HepG细胞中周期和凋亡相关几种蛋白表达的影响。将处于对数生长期的HepG2细胞用不同浓度的实施例1处理后，提取总蛋白，以GAPDH为内参，通过western blot方法检测p53,p21,Cyclin B1,CDK1,Bax,Bcl-2,Bcl-xl蛋白的表达水平。

图7为检测药物对HepG2细胞内ROS产物的影响。将处于对数生长期的HepG2细胞用不同浓度的实施例1处理，通过DCFH-DA探针检测ROS的含量。(A-F:0,40μM,80μM,160μM,200μM,240μM)

图8为检测药物对人正常肝细胞L02增殖的影响。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限于以下实施例。

实施例1吉马酮对HepG2细胞的增殖抑制作用比较

1.实验材料

1.1细胞株

人肝癌细胞株HepG2购自中国典型培养物保藏中心(China Center for TypeCulture Collection，CCTCC)。

1.2药品及试剂

吉马酮：购自成都曼斯特生物科技有限公司

DMSO：美国Sigma公司产品

DMEM及胎牛血清：美国Gibco产品

青霉素-链霉素溶液：安特捷生物技术有限公司

MTT：美国Sigma公司产品

胰蛋白酶：碧云天生物技术研究所

酶标仪Sunrise：TECAN公司

超净实验台SZX型：上海浦东跃欣科仪厂

CO2培养箱  HH·CP型：上海博迅实业有限公司

微量移液枪 P2.5等：大龙医疗设备有限公司

2.实验方法：

2.1细胞培养

人肝癌HepG2细胞株HepG2用含有10%FBS、青霉素100μg/ml、链霉素100μg/ml的高糖DMEM培养液于37℃，CO2体积分数为5%的细胞培养箱内培养。

2.2MTT法检测不同药物对HepG2细胞生长抑制情况

将细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔20000个细胞，过夜待细胞贴壁后，加入不同药液，每个浓度平行5孔，37℃，5%CO2培养24小时候每孔加入5mg/ml MTT 24μl，继续培养4小时，弃去上清液，每孔加入DMSO 100μl，用酶标仪在492nm波长处测出细胞对照组和各药物组的OD值，取各组均值，重复试验3次。以下面的公式计算各组药物对细胞的抑制率IR=(1-药物组OD值/对照组OD值)×100%。结果显示：吉马酮明显抑制HepG2细胞增殖且呈剂量依赖关系（见图2）

实施例2吉马酮抑制HepG2细胞增殖的机制研究

1.实验材料

1.1细胞株（同实施例1）

1.2药品及试剂

吉马酮：购自成都曼斯特生物科技有限公司

DMSO：购自美国Sigma公司产品

DMEM及胎牛血清：购自美国Gibco产品

Western及IP细胞裂解液：购自碧云天生物技术研究所

PMSF：购自碧云天生物技术研究所

Hoechst 33258染色液：购自碧云天生物技术研究所

MTT：美国Sigma公司产品

十二烷基硫酸钠（SDS）：武汉鼎国生物技术有限公司

甘氨酸：武汉鼎国生物技术有限公司

Nacl：国药集团化学试剂有限公司

甲醇：武汉鼎国生物技术有限公司

三羟甲基氨基甲烷（Tris）：武汉鼎国生物技术有限公司

过硫酸铵（APS）：国药集团化学试剂有限公司

丙烯酰胺：武汉安科生物科技有限公司

双甲叉丙烯酰胺：武汉安科生物科技有限公司

TEMED：武汉三益实验用品经营部

PI：武汉三益实验用品经营部

RNA酶A：武汉市洪山区仁久实验器材公司

蛋白上样缓冲液：武汉三益实验用品经营部

NC膜：博士德生物有限公司

预染蛋白质MarkerⅢ(蓝色)：博士德生物有限公司

胰蛋白酶：碧云天生物技术研究所

PBS：博士德生物有限公司

p53、p21、Bax、Bcl-2、Bcl-xl、cyclinB1、CDK1对应一抗：Santa Cruz

羊抗兔和羊抗鼠二抗：博士德生物有限公司

BSA：武汉三益实验用品经营部

脱脂奶粉：内蒙古伊利实业集团

化学发光检测底物：Thermo Scientific

BCA蛋白浓度测定试剂盒：碧云天生物技术研究所

动物组织/细胞总RNA提取试剂盒：北京庄盟国际生物基因科技有限公司

逆转录试剂盒：Fermentas

流式细胞仪（BDLSR II）：美国BD公司产品

电泳仪DYY-4：北京六一仪器厂

转膜仪DYY-4：北京六一仪器厂

低温高速离心机CR21G Ⅱ：日本日立公司

压力蒸汽灭菌锅YX-400B：上海三申医疗器械有限公司

荧光显微镜IX71：日本Olympus公司

倒置显微镜永新XD-202：南京江南永新光学有限公司

2.试验方法

2.1细胞形态观察及Hoechst33258染色

取对数生长期HepG2细胞以2×10⁵个/孔的细胞密度接种于6孔培养板中，置于细胞CO2培养箱内培养6-8h待细胞贴壁后，加入终浓度为160μM的吉马酮处理24h，对照组加同样体积（1ml）的DMEM培养液。倒置显微镜观察细胞形态改变；Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。Hoechst 33258染色液可直接用于固定细胞或组织的细胞核染色，也可直接用于活细胞或组织的细胞核染色。经过Hoechst33258染色后在荧光显微镜下观察，结果显示吉马酮处理后，HepG2细胞形态有明显改变，而且核皱缩明显（见图3）。

2.2流式细胞仪检测细胞凋亡

取对数生长期HepG2细胞以2×105个/孔的细胞密度接种于6孔培养板中，置于细胞CO2培养箱内培养6-8h待细胞贴壁后，分别加入不同浓度的吉马酮，终浓度为80,160,200μM，对照组加同样体积（1ml）的DMEM培养液。继续培养24h，每孔收集约10万细胞，离心后弃上清。加0.5ml的染色缓冲液重悬细胞，分别加入5μl Annexin V-FITC和10μl PI，4℃染色15min，上机检测细胞凋亡情况，结果显示吉马酮可以浓度依赖性的促进HepG2细胞凋亡，而对细胞坏死没有明显影响（见图4）。

2.3流式细胞仪检测细胞周期

取对数生长期HepG2细胞以2×105个/孔的细胞密度接种于6孔培养板中，置于细胞CO2培养箱内培养6-8h待细胞贴壁后，分别加入不同浓度的吉马酮，终浓度为80,160,200μM，对照组加同样体积（1ml）的DMEM培养液。继续培养24h，每孔收集约10万细胞，离心后弃上清，PBS洗涤2次后用80%的冰乙醇-20℃固定过夜，离心收集细胞（最多可放2周），依次加入PBS，PI（10×）和RNA酶A（10×）各10μl，最后加入PBS至总体积200-300μl，小心吹打均匀，避光染色15min后上机检测，结果显示吉马酮可以诱导HepG2细胞G2/M周期阻滞（见图5）。

2.4Western Blot检测一种吉马酮对细胞凋亡和周期阻滞相关蛋白表达的影响

2.4.1实验所需溶液的配制

（1）30%Acry-Bis的配置（29%（m/V）丙烯酰胺和1%（m/V）N,N’-亚甲双丙烯酰胺）：称取29g丙烯酰胺加1g双丙烯酰胺，加100ml温热去离子水，pH值不能超过7，4℃避光保存。

（2）分离胶缓冲液（1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8）：称取18.15g Tris，加80ml去离子水溶解，调pH值至8.8，定容至100ml，4℃避光保存。

（3）浓缩胶缓冲液（1.0mol/L Tris-HCl pH 6.8）：称取6.0g Tris，加80ml去离子水溶解，调PH值至6.8，定容至100ml，4℃避光保存。

（4）10%SDS：1g SDS加10ml去离子水，50℃水浴下溶解，室温保存。

（5）10%过硫酸铵（APS）：1g APS加10ml去离子水，最好现配现用。

（6）电泳缓冲液（1×）：分别称取3.03g Tris-base，14.4g甘氨酸和1g SDS，加去离子水至总量1L。

（7）转膜缓冲液（1×）：分别称取3.03g Tris-base,14.4g甘氨酸，200ml甲醇，加去离子水至总量1L。

（8）1×TBST（膜洗液）：分别称取2.42g Tris-Base，加8g NaCl，用800ml去离子水溶解后，用HCl调pH至7.6，定容至1L，使用前加0.1%Tween-201ml。膜封闭液和抗体稀释液均为含有5%脱脂奶粉的TBST。

2.4.2蛋白的提取及浓度测定

（1）将吉马酮处理后培养24h的六孔板取出，收集所有细胞，PBS洗一次，每孔加入100μl细胞裂解液（确认含PMSF），在冰上裂解3min并使其充分接触细胞，转移到一ep管中，4℃12000rpm离心10min，取上清分装于另一离心管中并置于-70℃保存。

（2）采用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度。将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl分别加入到96孔板中，将标准品稀释液补充至20μl。加适当体积样品到96孔板中，加稀释液至20μl。各孔中加入200μl一定比例配好的BCA试剂A+B，37℃孵育30min。在A570nm下测其吸光度。根据标准曲线计算出样品的浓度。

2.4.3蛋白质凝胶电泳（SDS-PAGE）

SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应。SDS-PAGE可根据不同蛋白质分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离。实验步骤如下：

1）将SDS-PAGE胶板洗干净，烘干然后组装好。

2）配制10％分离胶，配方如下。灌胶结束后加入1ml双蒸水将胶表面压平。

3）待分离胶完全凝固后，倒去胶上的水并用滤纸将水充分吸干，配制5%浓缩胶，立刻插入梳子。

4）待胶凝固后拔去梳子，将凝胶固定于电泳装置上，倒入电泳缓冲液。

5）将样品混好上样缓冲液后煮沸3min后，开始上样，每孔35μl。

6）浓缩胶时80V电压电泳约30min，分离胶100V电压电泳约1-2h。2.4.4转膜

1）裁剪适当大小的PVDF膜，在转膜缓冲液中浸泡10min。

2）待电泳结束后，把蛋白凝胶从玻璃板上小心剥离下来，在转膜缓冲液中浸泡10min。

3）安装转膜装置。在黑色电极面板上一次放海绵，滤纸（多层），蛋白胶，PVDF膜，滤纸（多层），海绵，最后盖上白色电极面板，期间要用玻璃试管不断赶出中间的气泡。

4）转膜：将凝胶一侧靠近阴极，膜一侧靠近阳极，打开电源，调节电流至300mA转移2h。

5）检测：取出PVDF膜，丽春红染色，以检查蛋白转移是否完全。

2.4.5封闭

取出PVDF膜，TBST洗10min，封闭液4℃摇过夜。

2.4.6杂交及显色

1）一抗杂交：将抗体用抗体稀释液按照说明书所说的比例稀释，反贴法室温震荡孵育一小时，而后吸弃一抗稀释液，用1×TBST洗膜3次，每次10min。

2）二抗杂交：将辣根过氧化物酶连接的二抗用抗体稀释液按照说明书所说的比例稀释，反贴法室温振荡孵育50min，而后吸去二抗稀释液，用1×TBST洗膜3次，每次10min。

3）按照化学发光检测试剂盒说明的比例配制发光液，暗室中进行曝光，显影和定影。

2.4.7Western blot结果见图6，结果显示吉马酮处理24h后，肿瘤抑制蛋白p53上调，而其下游的线粒体凋亡途径中促凋亡蛋白Bax表达上调，抑凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl表达下调，说明吉马酮通过上调p53来促进线粒体凋亡途径诱导的HepG2细胞凋亡；另外，G2/M周期蛋白cyclinB1和周期蛋白依赖性激酶CDk1表达均下调，而周期蛋白依赖性激酶抑制子p21上调，这说明吉马酮通过下调周期蛋白cyclin B1和CDK1并上调周期蛋白依赖性激酶抑制子p21的表达来诱导HepG2细胞G2/M周期阻滞。

2.5检测一种吉马酮对细胞内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的影响

实验方法参见试剂盒说明书。步骤如下：

（1）用无血清DMEM稀释DCFH-DA，使其终浓度为10μM/L。

（2）将细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，37℃孵育30min。每隔3-5min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清DMEM洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。

（3）使用488nm激发波长，525nm发射波长，流式细胞仪检测。

流式检测实验结果见图7，从图中可以看到吉马酮处理后，HepG2细胞内ROS的产量明显上升，这说明吉马酮可以诱导HepG2细胞的氧化性损伤。

实施例3吉马酮对人正常肝细胞的细胞毒性

1.实验材料

1.1细胞株

人正常肝细胞系（L02）购自中国典型培养物保藏中心(China Center for TypeCulture Collection，CCTCC)。

1.2药品及试剂：同实施例1。

2实验方法：同实施例1。

实验结果见图8，从图中结果我们可以看到吉马酮对人正常细胞肝细胞L02的生长没有明显抑制作用，这说明吉马酮是一种对正常细胞安全的抗肝癌药物。

Claims (2)

1. 吉马酮在制备用于治疗肝癌药物中的应用。

2.一种用于治疗肝癌的药物制剂，由作为活性成分的吉马酮和药学上可接受的载体或/和添加剂组成。

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