CN105412133A

CN105412133A - 黄芪皂苷i在治疗骨质疏松中的应用

Info

Publication number: CN105412133A
Application number: CN201510777370.0A
Authority: CN
Inventors: 孙丽娟; 程寻; 胡小芳; 韩凤梅; 陈勇
Original assignee: Hubei University
Current assignee: Hubei University
Priority date: 2015-11-13
Filing date: 2015-11-13
Publication date: 2016-03-23

Abstract

本发明提供了黄芪皂苷I在制备治疗骨质疏松的药物中的应用。从传统中药黄芪中筛选出具有促进成骨细胞分化作用的单体化合物黄芪皂苷I，即As-I，并全面的验证其促成骨分化作用，明确了黄芪皂苷I具有通过Wnt通路提高骨形成关键因子Runx2、BMP-2、BGP、β-catenin的表达水平的作用，从而促进成骨细胞分化，且黄芪皂苷I可下调RANKL/OPG表达比率从而抑制破骨细胞分化，进一步达到治疗骨质疏松的目的，对骨质疏松病症的治疗具有重要意义，将黄芪皂苷I作为基础与药用辅料复配为骨质疏松病药物，为治疗该疾病提供了新思路。

Description

黄芪皂苷I在治疗骨质疏松中的应用

技术领域

本发明属于药物技术领域，特别是涉及黄芪皂苷I在黄芪皂苷I在治疗骨质疏松中的应用。

背景技术

骨质疏松症，即OP，是一种以患者骨质量下降，骨密度降低，骨相关蛋白流失，进而导致患者骨折风险增加为特点的疾病。严重影响患者的生活质量。骨质疏松症多发生于老年人，随着世界人口的老龄化，骨质疏松症逐渐成为我国乃至全世界所关注的公共健康问题，研发治疗骨质疏松症的新药已是当务之急。

目前临床上使用的治疗OP的药物也有很多，主要包含三类，第一类为抗骨吸收药物，如双膦酸盐类，降钙素类，选择性雌激素受体调节剂(SERMs)以及雌激素类。第二类为促进骨形成药物，如甲状旁腺激素。最后为其它药物，包括活性维生素D,中药，和植物雌激素等。但目前临床上的药物均有其局限性及弊端，且容易产生药物依赖性或引发其它疾病，因此，研发新型治疗骨质疏松症药物仍然迫在眉睫。因骨质疏松症发生的根本原因是骨代谢失衡，目前研发新药多着力于促进成骨细胞骨形成和抑制破骨细胞骨吸收。研发者已发现多条通路能影响骨形成和骨吸收过程。

骨重建过程可由一系列小事件组成，主要包括早期的碱性磷酸酶ALP产生，接着成骨相关基因如骨钙素(BGP)，骨唾液蛋白(BSP)，特异性转录因子Runx2等被激活，这些相关因子的激活能进一步促进矿化结节的产生和钙沉积。现代研究表明，多种分子通路可调控这个过程。如骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticproteins,BMP)，Wnt(wingless-typeMMTVintegrationsitefamily)，纤维原细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor,FGF)，胰岛素样生长因子1(insulin-likegrowthfactor1,IGF1)和细胞分裂素激活的蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)等。其中，Wnt通路扮演着重要的角色。

黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)为豆科草本植物蒙古黄芪、膜荚黄芪的根，具有广泛的药理学特性，如增强免疫力，抗菌和抗病毒，具保肝、抗炎和滋补心血管等效果。它也临床上用于治疗糖尿病、肾炎、白血病和子宫癌等，还可预防糖尿病并发症的发生。黄芪中含有许多化学成分，主要包括黄酮、皂苷、多糖及氨基酸等，这些化学成分都具有极强的生物活性。且黄芪可对骨代谢产生多种影响。有报道从黄芪及其同属植物中分离出四十余种三萜皂苷。包括乙酰黄芪苷I、黄芪皂苷I～VIII、异黄芪苷I～II、黄芪皂苷乙、环黄芪醇和大豆皂苷I等，有研究表明黄芪提取物具有抗骨质疏松症的作用，但具体是哪种单体化合物的作用，未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了黄芪皂苷I在治疗骨质疏松中的应用。

本发明第一方面提供了黄芪皂苷I在制备治疗骨质疏松的药物中的应用。

本发明第二方面提供了一种治疗骨质疏松的药物，所述药物的活性成分包括黄芪皂苷I。

本发明第三方面提供了一种促进成骨细胞分化、抑制破骨细胞分化、通过Wnt通路提高骨形成关键因子表达水平的药物，所述药物的活性成分包括黄芪皂苷I，所述骨形成关键因子包括：Runx2、β-链蛋白、BMP-2、BGP。

本发明的有益效果是：本发明从传统中药黄芪中筛选出具有促进成骨细胞分化作用的单体化合物黄芪皂苷I，即As-I，并全面的验证其促成骨分化作用，明确了黄芪皂苷I具有通过Wnt通路提高骨形成关键因子Runx2、BMP-2、BGP、β-catenin的表达水平的作用，从而促进成骨细胞分化，且黄芪皂苷I可下调RANKL/OPG表达比率从而抑制破骨细胞分化，进一步达到治疗骨质疏松的目的，对骨质疏松病症的治疗具有重要意义，将黄芪皂苷I作为基础与药用辅料复配为骨质疏松病药物，为治疗该疾病提供了新思路。

附图说明

图1是As-I对MC3T3-E1细胞增殖影响结果的柱状图。

图2是As-I对MC3T3-E1细胞ALP活性影响结果的柱状图。

图3是As-I对MC3T3-E1细胞矿化结节影响的茜素红染色结果图。

图4是As-I对MC3T3-E1细胞矿化结节影响结果的柱状图。

图5是As-I对Runx2mRNA表达影响结果的柱状图。

图6是As-I对β-catenin和Runx2蛋白印迹影响结果图。

图7是As-I对BMP-2mRNA表达影响结果的柱状图。

图8是As-I对BGPmRNA表达影响结果的柱状图。

图9是As-I对BGP蛋白印迹影响结果图。

图10是Wnt通路抑制剂Dkk-1对As-I诱导的ALP活性影响结果的柱状图。

图11是Wnt通路抑制剂Dkk-1对As-I诱导的β-catenin蛋白印迹影响结果图。

图12是As-I对OPGmRNA表达影响结果的柱状图。

图13是As-I对RANKLmRNA表达影响结果的柱状图

图14是As-I对OPG、RANKL蛋白印迹影响结果图。

以上各柱状图中所有数据均以平均数±标准差表示。统计学分析方法采用t检验，p<0.05认为有显著性差异(^*p<0.05；^**p<0.01；^***p<0.001；^#p<0.05)。为消除实验误差，实验数据均来自至少3次独立重复实验结果。

具体实施方式

本发明第一方面提供了黄芪皂苷I在制备治疗骨质疏松的药物中的应用。传统中药黄芪具有抗骨质疏松症的能力，但未知具药效的黄芪单体，经过发明人研究，明确了黄芪皂苷I为具有抗骨质疏松症的能力的黄芪单体，为以黄芪皂苷I为基础开发新的药物来治疗该疾病提供了新思路。

具体的，所述药物为促进成骨细胞分化的治疗骨质疏松的药物。通过细胞增殖率检测(MTT)和碱性磷酸酶(ALP)活性检测，检查早期不同时间点内，不同浓度的黄芪皂苷I对MC3T3-E1细胞增殖率和早期分化的影响。在证实黄芪皂苷I对MC3T3-E1细胞早期分化的作用后，进一步通过茜素红染色方法检测黄芪皂苷I对成骨细胞矿化结节作用的影响，在一个实施方案中，从早期和后期全面验证了黄芪皂苷I对MC3T3-E1细胞促成骨细胞分化的作用。

更加具体的，所述药物为提高骨形成关键因子表达水平的治疗骨质疏松的药物，所述骨形成关键因子包括：特异性转录因子Runx2、β-链蛋白、骨形态发生蛋白BMP-2、骨钙素BGP。Runx2是成骨细胞分化和骨形成过程中重要的调控因子，可以控制下游成骨性相关基因的转录。β-catenin，即β-链蛋白，去磷酸化后从复合体上游离出来，使得胞质中，核内β-catenin水平升高，核内β-catenin进一步影响T细胞因子/淋巴增强因子1(Tcf/LEF1)的表达，进一步影响成骨细胞相关基因，如Runx2的表达。在一个实施方案中，验证了黄芪皂苷I可提高Runx2、β-catenin的表达水平。BMP-2是一种关键的自分泌和旁分泌生长因子，指导成骨细胞分化和骨的形成，可直接作为诱导蛋白诱导细胞向成骨细胞分化，β-catenin可上调BMP-2的表达进而对BMP信号通路达到调控作用，BMP信号通路还可以调控其下游成骨相关基因骨钙素(BGP)的表达，BGP的表达可直接作为成骨标志物被检验，其基因及蛋白水平的表达则直接参与矿化结节的调控。在一个实施方案中，验证了黄芪皂苷I可以提高BMP-2，BGPmRNA及蛋白表达。

进一步具体的，所述药物通过Wnt通路提高骨形成关键因子表达水平，所述骨形成关键因子包括：特异性转录因子Runx2、β-链蛋白、骨形态发生蛋白BMP-2、骨钙素BGP。研究表明，Wnt通路抑制剂Dkk-1对黄芪皂苷I诱导的ALP活性及β-catenin蛋白表达有明显抑制作用，验证了黄芪皂苷I可通过Wnt通路提高Runx2、BMP-2、BGPmRNA及蛋白表达，以及β-catenin蛋白表达，从而达到促进成骨细胞分化的效果，起到治疗骨质疏松症的作用。

所述药物包括活性成分，也可包括与活性成分配合的药用辅料。所述药用辅料包括生产药品和调配处方时使用的赋形剂和附加剂，药学上可接受的药用辅料通常包括无毒的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包裹材料或任何常规类型的制剂辅助物，药用辅料的成分包括但不限于水、葡萄糖、甘油、盐水、乙醇及其组合，还可含有其他试剂如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂或增强制剂效力的佐剂，其他材料如抗氧化剂、保湿剂、粘度稳定剂和类似试剂可根据需要添加，所述药物的活性成分包括黄芪皂苷I。

下面将结合具体实施例对本发明提供的黄芪皂苷I在治疗骨质疏松中的应用予以进一步说明。

小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1细胞(mousecalvariaoriginMC3T3-E1osteoblasticcells,MC3T3-E1cells)是从胚胎小鼠颅骨中分离的前成骨细胞，表现出高水平的成骨细胞分化能力，在含有抗坏血酸，β-甘油磷酸钠的成骨条件培养基(osteoblastmedium,OBM)的作用下可向成骨细胞分化，常被用于成骨细胞研究，因此选取MC3T3-E1作为建模模型。本实施例选取小鼠颅顶骨前成骨细胞系MC3T3-E1，该细胞株来源于武汉大学口腔医学院，细胞药效研究取第2-5代细胞。

1、主要试剂的配制

1.1MEM-α培养基

MEM-α干粉10.0g

NaHCO₃2.2g

以上成分加800ml三次水充分溶解，加1％青/链霉素，调节pH至7.2-7.3，定容至1000ml,0.22μM孔径滤器抽滤除菌、分装，-20℃保存。

1.2成骨条件培养基(osteoblastmedium,OBM)：在α-MEM培养基中加入10mM的β-甘油磷酸钠(β-glycerophosphosphate)和50μg/ml的维生素C，新鲜配制。

1.3冻存培养基：在α-MEM培养基中加入10％FBS，10％DMSO，新鲜配制。

1.4PBS溶液

以上成分加入800ml三次水充分溶解，调节pH至7.2-7.3，定溶至1000ml，高压灭菌备用。

1.5As-I储存液：

DMSO溶解至终浓度为40mM

1.65mg/ml的四氮噻唑蓝(MTT)溶液

称取MTT粉末0.1g，溶于20mlPBS溶液中，过滤，4℃避光保存。

1.70.1％DEPC水

1000ml双蒸水中加入1mlDEPC，用磁力搅拌器搅拌至DEPC充分溶解。用DEPC水处理枪头过夜，倒掉DEPC水，高压蒸汽灭菌30min。

1.850xTAE电泳缓冲液

称取Tris242g和Na₂EDTA·2H₂O37.2g于烧杯中，加800ml去离子水，充分搅拌至其溶解后，加入57.1ml的醋酸，搅拌均匀，加入去离子水，定容至1L，室温保存。

1.9溴化乙锭(EB，10mg/ml)

称取1g溴化乙锭，加入到100ml容器中，加入去离子水100ml,充分搅拌至完全溶解。将溶液转移至棕色瓶中，室温避光保存。使用时的终浓度为0.5μg/ml。

1.1010％过硫酸胺

称取0.1g过硫酸胺，加入1.0ml超纯水充分溶解后，分装-20℃保存，4℃解冻，解冻后保质一周。

1.1130％丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺

称取丙烯酰胺29g，甲叉双丙烯酰胺1g，加入60ml左右去离子水，37℃下充分溶解，定容至100ml，过滤，4℃避光保存1月。使用时恢复至室温。

1.125x电泳缓冲液

称取SDS5g，Tris15g,甘氨酸94g，加600ml左右蒸馏水，转子溶解完全后，加蒸馏水定容至1000ml，4℃保存。

1.13转移缓冲液

称取SDS0.37g，Tris5.8g，甘氨酸2.9g，甲醇200ml，加蒸馏水定容至1000ml，充分溶解后4℃保存。

1.14TBS缓冲液

称取1.22gTris和8.78gNaCl，加入800ml左右蒸馏水，充分溶解后定容至1000ml，4℃保存。

1.15TBST缓冲液(含0.05％Tween20的TBS缓冲液)

500mlTBS缓冲液中，加入250μl的Tween20，充分混匀，4℃保存，当天使用。

1.16封闭液(含5％脱脂奶粉的TBST缓冲溶液)

称取脱脂奶粉5g，加入100mlTBST缓冲液，充分溶解后4℃保存备用。当天使用。

2、实验方法及结果

2.1As-I促进成骨细胞分化的验证

2.1.1As-I对MC3T3-E1细胞增殖的影响

选取不同浓度的As-I作用于MC3T3-E1细胞，使用MTT检验，由于当As-I浓度达到50μM及以上时，对细胞具有毒副作用。因此，选取As-I浓度梯度为10μM，20μM，40μM。因药物溶解于DMSO中，因此再设一对照组DMSO。选取给药后1d、3d和6d这3个时间点，使用MTT检验方法检验不同浓度药物在细胞分化过程中对细胞增殖的影响。具体包括如下步骤：

细胞增殖率测定(MTT法)

1)细胞处理：当MC3T3-E1细胞长至80％左右时，0.25％胰酶消化至细胞间产生间隙，用MEM-α培养基将细胞稀释成细胞悬液，接种96孔培养板，细胞接种密度为1×104/100μl/孔，在条件为37℃、5％CO₂的CO₂培养箱中培养过夜，待细胞贴壁后，吸弃原液，每孔加入200μl相应用成骨条件培养基(OBM培养基)配制的各As-I浓度组(10μM，20μM，40μM)和对照组(DMSO)培养基，隔天换液，分别在诱导1，3，6天后收集样本，每组5个复孔；

2)吸弃培养基，每孔加入200μlPBS轻轻洗涤细胞2-3遍；

3)吸弃PBS，每孔中加入20μlMTT溶液，180μlPBS，在37℃条件下温孵4h，吸弃MTT溶液，每孔加入150μlDMSO溶液；

4)充分振荡，使其充分溶解，10min内用酶标仪在570nm处检测其吸光值。

各时间点各个浓度下的细胞增殖情况如图1所示，从图中可以看出，各时间点、所有浓度下As-I对MC3T3-E1细胞的增殖均无影响，不会促进也不会抑制其生长。

2.1.2As-I对MC3T3-E1细胞ALP活性的影响

碱性磷酸酶(ALP)是成骨细胞分化的标志基因之一，也是成骨细胞分化的早期标志物，在成骨细胞分化早期，可通过检验ALP的表达活性来判断细胞分化情况。为验证As-I促成骨细胞分化的能力，选择三个时间点，即给药后第3d、5d和7d。通过pNPP法检验不同浓度的As-I对MC3T3-E1细胞ALP活性的影响，具体包括如下步骤：

碱性磷酸酶(ALP)活性检测

1)细胞处理：当MC3T3-E1细胞长至80％左右时，0.25％胰酶消化至细胞间产生间隙，用含10％FBS的MEM-α培养基将细胞稀释成细胞悬液，接种96孔培养板，细胞接种密度为1×104/100μl/孔，在条件为37℃、5％CO₂的CO₂培养箱中培养过夜，待细胞贴壁后，吸弃原液，每孔加入200μl相应用成骨条件培养基(OBM培养基)配制的各As-I浓度组(10μM，20μM，40μM)和对照组(DMSO)培养基，隔天换液，分别在诱导3，5，7天后收集样本，每组5个复孔；

2)吸弃培养基，每孔加入200μlPBS轻轻洗涤细胞2-3遍；

3)吸弃PBS，每孔中加入150μl0.1％的TritonX-100的细胞裂解液，于-20℃和37℃反复冻融2次以使细胞完全裂解。将裂解液转入1.5mlEP管中，4℃，12000rpm离心5min，取上清(裂解液)；

4)100μl裂解液加入50μl，3mMpNPP于96孔板中37℃温孵30min后，加入0.2M的NaOH溶液50μl以终止反应，用酶标仪在405nm波长处检测其吸光值；

5)另取25μl裂解液，用BCA试剂盒检测蛋白浓度，参考蛋白质定量结果校正结果，作为ALP相对活性。

各时间点各个浓度下的As-I对MC3T3-E1细胞ALP活性的影响结果如附图2所示，不同时间点，与对照组相比，不同浓度的As-I对MC3T3-E1细胞ALP活性均有促进作用，且随着给药浓度的增加，促进作用增强。其中，在三个不同时间点，最高给药浓度组(40μM)促进作用均有统计学意义(p<0.05)。第5天和第7天，给药浓度达到20μM时，对ALP活性的促进效果亦有统计学意义(p<0.05)。此外，第3天最高给药组，第7天给药浓度达到20μM时，促进效果达到10％以上，第7天最高给药组促进效果接近20％。

ALP是成骨细胞早期分化的重要标志，不同浓度的As-I对MC3T3-E1细胞的ALP活性均有促进作用，且在某些浓度具有统计学意义，这个结果表明，As-I对MC3T3-E1细胞的早期成骨细胞分化作用具有促进作用。

2.1.3As-I对MC3T3-E1细胞矿化结节的影响

为了进一步验证As-I的促成骨分化作用。我们进一步检验As-I对MC3T3-E1细胞晚期成骨标志物矿化结节的影响。采用茜素红染色法对其矿化程度进行检测。细胞外基质中的钙沉积可形成矿化结节，用茜素红染色后，结节呈现红色。红色的深浅及面积大小可定性分析矿化结节的程度。此外，使用氯化十六烷基吡啶将矿化溶解下来，进行定性分析。具体包括如下步骤：

细胞矿化结节检测(茜素红染色法)

1)细胞处理：当MC3T3-E1细胞长至80％左右时，0.25％胰酶消化至细胞间产生间隙，用含10％FBS的MEM-α培养基将细胞稀释成细胞悬液，接种24孔培养板，细胞接种密度为1×104/1ml/孔，在条件为37℃、5％CO2的CO2培养箱中培养过夜，待细胞贴壁后，吸弃原液，每孔加入1ml相应用成骨条件培养基(OBM培养基)配制的各As-I浓度组(10μM，20μM，40μM)和对照组(DMSO)培养基，隔天换液，在诱导21天后收集样本，每组4个复孔；

2)吸弃培养基，每孔加入1mlPBS轻轻洗涤细胞2-3遍；

3)吸弃PBS，每孔中加入1ml预冷的75％乙醇固定1小时；

4)吸弃乙醇，用去离子水洗涤细胞2-3遍，每孔加入1ml40mM茜素红(pH4.2)在37℃温孵1小时；

5)吸弃茜素红溶液，每孔加入1mlPBS轻轻洗涤细胞2-3遍。最后一遍留少许液体，数码相机拍照；

6)为对矿化结节结果进行定量分析，吸弃PBS，每孔加入1ml10％氯化十六烷基吡啶溶化结节1小时，将其转移至96孔板中，用酶标仪检测其570nm处吸光值。

不同As-I浓度下的细胞矿化结节检测结果拍照如附图3所示，跟对照组相比，As-I给药组细胞矿化结节面积更大，染色更深。且随给药浓度加大，茜素红染色更深，和ALP活性检测结果相一致。

不同As-I浓度下的细胞矿化结节定量检测结果如附图4所示，与正常对照组相比，给药组矿化结节数目增多，有统计学意义。无论从定性还是定量结果来看，As-I均能促进MC3T3-E1细胞矿化结节，与前面实验结果相吻合。进一步证实了As-I能促进成骨细胞分化。

以上试验结果从早期和后期全面验证了黄芪皂苷I对促成骨细胞分化的作用，为以黄芪皂苷I为基础开发新的药物来治疗促进成骨细胞分化、并进一步治疗骨质疏松病症提供了新思路。

2.2As-I提高骨形成关键因子的mRNA及蛋白表达水平的验证

2.2.1As-I对Runx2mRNA表达的影响

Runx2是成骨细胞分化和骨形成过程中重要的调控因子，可以控制下游成骨性相关基因的转录，同时它也是Wnt通路调控的下游基因之一。用不同浓度的As-I作用于MC3T3-E1细胞5天后，提取细胞总RNA进行RT-PCR实验。具体包括如下步骤：

一、细胞RNA提取

实验准备

1)将用于RT-PCR的玻璃器皿常规洗净后，置于180℃烤箱中干烤10小时；所有塑料器材为新产品，使用前用0.1％的DEPC水浸泡12小时，高压消毒，低温烘干；

2)用于提取RNA的氯仿、异丙醇均为新包装；

3)用于提取RNA的水均为新配0.1％的DEPC水，高压消毒。

细胞总RNA的提取

1)细胞处理：当MC3T3-E1细胞长至80％左右时，0.25％胰酶消化至细胞间产生间隙，用含10％FBS的MEM-α培养基将细胞稀释成细胞悬液，接种6孔培养板，细胞接种密度为1×10⁴/1ml/孔，在条件为37℃、5％CO₂的CO₂培养箱中培养过夜，待细胞贴壁后，吸弃原液，每孔加入2ml相应用成骨条件培养基(OBM培养基)配制的各As-I浓度组(10μM，20μM，40μM)和对照组(DMSO)培养基，隔天换液，培养5天；

2)吸弃旧培养基，用冰预冷的PBS溶液洗涤细胞2次，弃净PBS溶液；

3)每孔加入1mlTRIZOL试剂，冰上静置5分钟；

4)轻轻吹打细胞数次，将细胞裂解液转移至1.5ml的EP管中；

5)每管加入200μl氯仿，剧烈震荡混匀15秒，冰上静置15分钟；

6)4℃，12000rpm离心15分钟；

7)小心吸取250μl上层水相，转移至经0.1％DEPC液处理的新的1.5mlEP管中；

8)加入500μl异丙醇，轻轻颠倒混匀，冰上静置10分钟；

9)4℃，12000rpm离心10分钟；

10)吸弃上清，加入1ml冰预冷的75％乙醇(DEPC处理水新鲜配制)，洗涤沉淀；

11)4℃，7500rpm离心5分钟；

12)弃上清，室温3～5分钟晾干；

13)加入20μlDEPC处理水，60℃水浴5分钟充分溶解RNA。-80℃保存备用。

紫外分光光度法测定RNA的纯度、浓度

取2μlRNA溶液，稀释50倍。以100μl0.1％DEPC处理水做空白对照调零，紫外分光光度仪中测定OD_260/280，确定RNA纯度。实际RNA浓度(μg/μl)＝所测RNA浓度×稀释倍数。

琼脂糖凝胶电泳检测RNA是否被降解

取5μlRNA溶液，与3μl上样缓冲液(6x)混匀，在1％琼脂糖凝胶中电泳，约10min后，取出凝胶用溴化乙锭染色5min，纯水冲洗后于凝胶成像仪中进行条带扫描。

逆转录合成cDNA

1)根据所测RNA浓度计算出4μgRNA所需体积，加入4μgRNA溶液于0.2mlEP管中，冰上操作，DEPC处理水补至21μl，混匀；

2)65℃水浴5min后，立即置于冰上冷却；

3)在冰上依次加入下列反应物，混匀：

5xRTBuffer6μl

RTEnzymeMix1.5μl

PrimerMix1.5μl

4)将EP管放入PCR仪中，依次按以下条件进行反转录合成：37℃30min、98℃5min。将得到的cDNA于-20℃保存，以备进行PCR扩增反应。

二、以SYBRGreenI荧光染料法进行实时定量PCR检测mRNA表达水平

PCR引物设计

根据文献报道，选用相应的PCR引物，进行预实验，最终得到特异性引物序列。引物序列见表2.1。

表2.1引物序列

实时荧光定量PCR反应

1)PCR反应体系：

2)待测样品以GADPH作为内对照，以上每种样品和内对照均使用3个重复反应孔，以确保统计显著性；

3)将以上20μlPCR扩增试剂小心加入96孔反应板中，盖膜后，800rpm离心5min,避免有气泡产生。然后放入荧光定量PCR仪中反应；

4)PCR循环参数：95℃3min预变性、95℃30s变性、64.5℃30s退火、72℃30s延伸，共40个循环；

5)PCR扩增反应结束后，从65℃以0.5℃5s的速度逐渐升高到95℃来进行融解曲线反应；

6)以上全部反应结束后，观察各基因各As-I组别的融解曲线，若为单峰则表示单一的PCR扩增产物，多峰则表示扩增有杂带；

7)PCR仪自带软件可自行计算出目的基因mRNA表达的相对量，可根据数值建立柱状图以比较各As-I组目的基因的表达情况；

8)每个实验组设至少3个样本，实验重复3次。

不同As-I浓度下MC3T3-E1细胞中Runx2mRNA的表达倍数如附图5所示，附图5与前面试验结果相一致，As-I可促进MC3T3-E1细胞中Runx2mRNA的表达，且随着As-I浓度的增加，表达倍数也增加，与对照组相比，具有统计学意义。

2.2.2As-I对Runx2和β-catenin蛋白表达的影响

β-catenin是Wnt信号通路的重要蛋白，在Wnt通路被激活后，原本磷酸化的β-catenin去磷酸化游离于细胞质中并进入细胞核调控其它基因蛋白的表达。MC3T3-E1细胞接种于6孔板中待其贴壁长至80％左右开始给药，用蛋白裂解液将其裂解，进行蛋白定量后取50μg蛋白做WesternBlot实验。蛋白印迹实验具体包括如下步骤：

一、细胞总蛋白的提取

2)吸弃旧培养基，每孔加入1ml4℃的PBS缓冲液清洗6孔板2-3次，保留最后一次PBS放置于冰上；

3)在EP管中配新鲜裂解液，每1mlRIPA裂解液中加入10μlPMSF(100×),10μlcooktail(100×),轻轻吹打混匀，置于冰上备用；

4)将2中PBS弃净，每孔加入120μl上述配制的裂解液，轻轻晃动6孔板，置于冰上裂解40min；

5)待裂解完成后，快速收集细胞，用灭菌的枪头将细胞碎片及裂解液移入到1.5ml灭菌EP管中；

6)4℃离心机，12000rpm，20min，将上清移入另一1.5ml无菌EP管中，做好标记。

7)取3μl蛋白裂解液稀释10倍，BCA蛋白定量试剂盒测蛋白浓度；

8)余下蛋白裂解液按体积加入一定量的SDS上样缓冲液(6x)，混匀后在沸水中煮沸5-10min。-80℃保存备用。

二、Westernblot实验

电泳

1)使用北京市六一仪器厂的微型垂直板电泳装置，按要求装配制胶板；

2)按蛋白大小确定分离胶浓度，配制所需浓度的分离胶，分离胶配比如表2所示，混匀后立即灌胶，加1ml异丙醇覆盖，室温放置30～60分钟，直到有反拍线出现；

表2不同浓度分离胶配比

3)待胶聚合后，用去离子水小心清洗，以去除残留异丙醇，用滤纸吸干玻璃板上的水；

4)制备浓缩胶，插上样品梳，避免产生气泡，室温放置30～60分钟；

5)待胶凝固成型后，卸下胶板，装入电泳槽中，加入1×电泳缓冲液，小心拔出样品梳；

6)点样，将预先制备好的样品解冻，每孔加入一定质量的样品，点入孔中；

7)电泳：80V电泳至样品到达积层胶与分离胶的分界处，换以120V电泳直至溴酚兰到达分离胶底部；

转膜

1)按照胶的大小剪PVDF膜，将膜在甲醇里浸泡5min；

2)预先将滤纸，甲醇浸泡过的PVDF膜，海绵等在电转缓冲液中浸泡，按说明书，将预先滤纸，PVDF膜，切下的凝胶和海绵安装成凝胶“三明治”式的夹层结构(负极-海绵-5层滤纸-凝胶-PVDF膜-5层滤纸-海绵-正极)，并牢牢锁住；

3)将凝胶三明治放入转移槽中，加入新鲜配制的电转缓冲液，放入冰盒，盖好盖子；

4)冰浴条件下以300mA的条件电转1小时40分钟；

5)卸膜，用TBS清洗膜3次。

Westernblot杂交

1)将清洗过的PVDF膜浸在封闭液中，室温条件下振荡封闭1h；

2)TBST洗涤3次，每次5分钟；

3)将膜置于一抗(1:200～1:1000用一抗稀释液稀释)中，4℃孵育过夜；

4)TBST洗涤6次，每次7分钟；

5)加辣根过氧化物酶标记的二抗(1:5000用封闭液稀释),室温振荡1小时；

6)TBST洗涤6次，每次7分钟；

显影定影

1)等体积混合ECL溶液的A液和B液。将PVDF膜有蛋白的面向上平铺于保鲜膜上，以0.1ml/cm²膜的用量将ECL混合液滴加在PVDF膜上，室温显色1min左右；

2)吸弃多余的ECL溶液，用保鲜膜包好PVDF膜，将膜置于增敏盒中，用胶带固定好，暗室中进行压片；

3)在显影液中显影5min左右，用自来水冲洗后，放入定影液中定影10min左右，自来水冲洗后晾干。根据蛋白表达情况，调整曝光时间，进行多次压片。

As-I对β-catenin和Runx2蛋白印迹影响结果如附图6所示，与对照组相比，不同浓度As-I给药组，均会上调β-catenin和Runx2蛋白的表达量，且随着给药浓度的增加，其上调效果亦增强，与前期的研究结果相符合。

2.2.3As-I对BMP-2、BGPmRNA及蛋白表达的影响

Wnt通路中β-catenin可促进BMP通路中BMP-2的表达，BMP通路是另一重要的骨形成通路，其中BMP-2是重要的调控因子，它可直接促进成骨细胞分化，其下游基因BGP是成骨细胞分化后期最重要的标志物之一，因此，进一步研究了As-I对BMP-2，BGPmRNA及蛋白表达的影响。实验操作方法同本实施例2.4、2.5中实验操作方法，As-I对BMP-2，BGPmRNA表达影响的结果如附图7、附图8所示，As-I对BGP蛋白表达影响的结果如附图9所示。

由附图7、8可见，与空白对照组相比，As-I给药组BMP-2和BGP的mRNA表达水平明显增加，且随着As-I浓度的增加，其表达水平增加倍数升高。而且与对照组相比，在最高浓度组(40μM)，BMP-2mRNA表达水平具有统计学意义，而BGP的mRNA表达水平在各浓度均有统计学意义。

由附图9可见，通过蛋白印迹来进一步检验As-I对BGP蛋白表达的影响，测试结果可知，As-I可促进BGP蛋白表达，且随着给药浓度的增加，促进效果加强，与之前实验结果相符。As-I可以促进BMP-2，BGPmRNA表达水平，也可以促进BGP蛋白表达水平，二者均为成骨细胞分化关键基因，也进一步验证了As-I促进成骨细胞分化的能力。

2.3Wnt通路抑制剂Dkk-1对As-I诱导的ALP活性和β-catenin蛋白表达的影响

2.3.1Wnt通路抑制剂Dkk-1对As-I诱导的ALP活性的影响

上述实验证明，As-I可促进MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化，亦可促进Wnt通路中关键基因蛋白的表达。但As-I是否是通过Wnt通路促进成骨细胞分化仍需进一步验证。为此，我们选择了Wnt通路的经典抑制剂Dkk-1作用于MC3T3-E1细胞上，看其是否会抑制MC3T3-E1细胞ALP活性。为此，我们设置四个浓度组：空白对照组，As-I(40μM)，As-I(40μM)+Dkk-1，Dkk-1。给药培养5天后检测ALP活性，具体包括如下操作步骤：

1)细胞处理：当MC3T3-E1细胞长至80％左右时，0.25％胰酶消化至细胞间产生间隙，用含10％FBS的MEM-α培养基将细胞稀释成细胞悬液，接种96孔培养板，细胞接种密度为1×10⁴/100μl/孔，在条件为37℃、5％CO₂的CO₂培养箱中培养过夜，待细胞贴壁后，吸弃原液，加入200μl新鲜培养基，抑制剂组加入含终浓度为100ng/ml的Dkk-1的培养基，在条件为37℃、5％CO₂的CO₂培养箱中培养4小时。吸弃原液，每孔加入200μl相应用成骨条件培养基(OBM培养基)配制的各As-I浓度组(10μM，20μM，40μM)和对照组(DMSO)培养基，抑制剂组中Dkk-1终浓度为100ng/ml。隔天换液，培养5天；

2)ALP活性检测方法同前述2.2中实验操作。

Wnt通路抑制剂Dkk-1对As-I诱导的ALP活性影响结果如附图10所示，由图10可以看出，As-I(40μM)可以促进MC3T3-E1细胞ALP活性，但是Wnt通路抑制剂Dkk-1可抑制其促进效果。即As-I诱导的MC3T3-E1细胞ALP活性可被Wnt通路抑制剂Dkk-1所抑制。由此推断，As-I是通过Wnt通路诱导MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化。

2.3.2Wnt通路抑制剂Dkk-1对As-I诱导的β-catenin蛋白表达的影响

为进一步验证As-I是否通过Wnt通路促进MC3T3-E1细胞的成骨分化，我们进一步检测Wnt通路抑制剂Dkk-1对As-I诱导的β-catenin蛋白表达的影响。所设分组同2.3.1设置的分组，具体包括如下操作步骤：

1)细胞处理：当MC3T3-E1细胞长至80％左右时，0.25％胰酶消化至细胞间产生间隙，用含10％FBS的MEM-α培养基将细胞稀释成细胞悬液，接种6孔培养板，细胞接种密度为1×10⁴/1ml/孔，在条件为37℃、5％CO₂的CO₂培养箱中培养过夜，待细胞贴壁后，吸弃原液，加入2ml新鲜培养基，抑制剂组加入含终浓度为100ng/ml的Dkk-1的培养基，在条件为37℃、5％CO₂的CO₂培养箱中培养4小时。吸弃原液，每孔加入2ml相应用成骨条件培养基(OBM培养基)配制的各As-I浓度组(10μM，20μM，40μM)和对照组(DMSO)培养基，抑制剂组中Dkk-1终浓度为100ng/ml。隔天换液，培养5天；

2)蛋白印迹操作方法同前述2.2中实验操作。

Wnt通路抑制剂Dkk-1对As-I诱导的β-catenin蛋白表达的影响结果见附图11，由图11可知，As-I可促进MC3T3-E1细胞中β-catenin蛋白表达，而这种促进效果可被Wnt通路抑制剂Dkk-1所抑制，和前期研究结果相符合，进一步验证了As-I通过Wnt通路促进MC3T3-E1向成骨细胞分化。

2.4As-I抑制破骨细胞分化的验证

As-I可促进成骨细胞分化，且促进骨形成关键因子mRNA及蛋白水平的表达。且发现此促进效果是通过促成骨关键通路Wnt通路所调控。Wnt通路中的β-catenin可促进破骨通路RANK通路中重要调控因子OPG的表达。RANK通路是调控破骨细胞分化的重要通路，在RANK通路中有两个关键因子OPG及RANKL，二者均由成骨细胞分泌，其中RANKL可促进破骨细胞成熟，而OPG可抑制此过程，因此OPG和RANKL之间的比例是影响破骨细胞成熟的关键。为研究As-I对骨代谢的影响，验证As-I抑制破骨细胞分化效果，研究了As-I对OPG、RANKLmRNA及蛋白表达的影响。

2.4.1As-I对OPG、RANKLmRNA表达的影响

同前，将MC3T3-E1细胞接种于6孔板中，长至80％左右开始给药，给药5天后，提取RNA，经过一定处理，做RT-PCR实验，具体操作同2.2.1。As-I对OPG、RANKLmRNA表达的影响的结果如附图12、附图13。

由图12、13可知，As-I可促进OPGmRNA的表达，且随给药浓度的增加，其促进效果加强，在所有给药浓度组均有统计学意义；同时，As-I可抑制RANKLmRNA的表达，且随给药浓度的增加，其抑制效果加强，在20和40μM有统计学意义。OPG与RANKL之间的比例升高，表明As-I有可能抑制破骨细胞分化成熟。

2.4.2As-I对OPG、RANKL蛋白表达的影响

为进一步研究As-I对破骨通路的影响，继续研究了As-I对破骨通路两个重要因子OPG及RANKL蛋白表达水平的影响。实验操作同2.2.2，As-I对OPG、RANKL蛋白表达影响的结果如附图14所示。

由图14可知，As-I可促进OPG的蛋白表达，同时抑制RANKL的蛋白表达，且随给药浓度的增加，效果也加强，由蛋白表达量可看出，OPG与RANKL的比率升高，且随给药浓度的增加，效果加强，与我们前期结果相符，可推断出As-I可抑制破骨细胞分化。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.黄芪皂苷I在制备治疗骨质疏松的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的黄芪皂苷I在制备治疗骨质疏松的药物中的应用，其特征在于：所述药物为促进成骨细胞分化的治疗骨质疏松的药物。

3.如权利要求2所述的黄芪皂苷I在制备治疗骨质疏松的药物中的应用，其特征在于：所述药物为提高骨形成关键因子表达水平的治疗骨质疏松的药物，所述骨形成关键因子包括：Runx2、β-链蛋白、BMP-2、BGP。

4.如权利要求3所述的黄芪皂苷I在制备治疗骨质疏松的药物中的应用，其特征在于：所述药物通过Wnt通路提高骨形成关键因子表达水平。

5.如权利要求2所述的黄芪皂苷I在制备治疗骨质疏松的药物中的应用，其特征在于：所述药物为抑制破骨细胞分化的治疗骨质疏松的药物。

6.一种治疗骨质疏松的药物，其特征在于：所述药物的活性成分包括黄芪皂苷I。

7.一种促进成骨细胞分化、抑制破骨细胞分化、通过Wnt通路提高骨形成关键因子表达水平的药物，其特征在于：所述药物的活性成分包括黄芪皂苷I，所述骨形成关键因子包括：Runx2、β-链蛋白、BMP-2、BGP。